一種從環境樣品中提取高分子量基因組dna的方法
2023-05-29 03:15:41 2
專利名稱：一種從環境樣品中提取高分子量基因組dna的方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學技術領域，涉及一種環境樣品中提取基因組DNA的方法。
背景技術：
在地球各種環境的物質元素循環和生命過程中，各種微生物起到了極其重要的作用，但是由於環境中存在大量的未培養微生物，所以針對環境中所有微生物的研究顯得更具意義。目前，對於環境中所有微生物的研究已經深入到了分子水平，主要是通過各種宏基因組技術開展。如分子克隆，RFLP分析，DGGE分析，文庫構建等，這些方法和技術的發展，都對DNA片段大小提出了更高的要求。一般來說，構建基因組文庫，初始DNA長度必須在401Λ 以上，否則酶切後核酸片段兩端都帶合適末端的有效片段很少；如果是構建細菌人工染色體文庫，則要求初始DNA長度在501Λ以上。目前，實驗室提取環境樣品基因組DNA的方法主要有溶菌酶-SDS法、CTAB法、試劑盒法。但由於環境樣品的複雜性和操作時水力剪切作用等原因會造成DNA分子的損傷， 所以這些方法提取的環境樣品基因組DNA片段較短，其長度達不到501Λ以上的水平，且通用性較差。
發明內容
為了解決現有環境樣品基因組提取方法中存在的不足，本發明提供一種從環境樣品中提取高分子量基因組DNA的方法。一種從環境樣品中提取高分子量基因組DNA的方法，包括包埋、破壁、消化、電泳、 膠回收、溶解，具體工藝過程如下包埋用ImL懸浮液懸浮Ig環境樣品，加入ImL於50°C保溫的1 %低熔點瓊脂糖後混勻，室溫冷卻使凝固；破壁將膠塊放入IOmL破壁緩衝液中，37°C溫育Mh，期間保持水平50rpm震蕩；消化倒掉破壁緩衝液，加入IOmL消化緩衝液，37°C溫育Mh，期間保持水平50rpm
震蕩；洗滌倒掉消化緩衝液，加入IOOmL洗滌液洗滌三次，再用4°C的電泳緩衝液洗滌一次；電泳將經破壁消化後的膠塊切成長8mm、寬6mm、高2mm大小，插入到0. 7%低熔點瓊脂糖凝膠的點樣孔中，用0. 7%低熔點瓊脂糖凝膠封好點樣孔的空隙後，在電泳緩衝液中以5v/cm的電壓低溫電泳4小時；將0. 7%低熔點瓊脂糖凝膠旋轉90度後，繼續電泳2小時；切膠回收染色後將含DNA的凝膠切下，用電洗脫法回收DNA ；溶解將透析袋電洗脫後得到的DNA晾乾，溶於50μ 1的無菌去離子水或TE溶液， 溶解液即為所提的DNA;所述的懸浮液組成為10mmol/LHEPE-NaOH, lmol/L NaCl, 50mmol/L EDTA,pH8. 0 ；所述的破壁緩衝液組成為15mmol/LHEPES-NaOH, 100mmol/L NaCl, 100mmol/L EDTA, 0. 5g/L SDS, 5mg/mL 溶菌酶，pH 7. 8 ；所述的消化緩衝液組成為30mmol/LHEPES-NaOH, 500mmol/L NaCl, 100mmol/L Na3PO4,1 OOmmo 1/L EDTA, lOmmol/L CaCl2,0. 5g/L SDS, 1. 5mg/mL 蛋白酶 K, pH 7. 8 ；所述的洗滌液組成為5mmol/LHEPES-NaOH，IOOmmo 1/L EDTA, pH 7. 8 ；所述的電泳緩衝液組成為16mmol/LHEPES-NaOH, 16mmol/L NaAc, 0. 8mmol/ LEDTA, 100 μ mo 1/L 硫脲，pH 7. 5 ；所述的低熔點瓊脂糖為1% (W/V)低熔點瓊脂糖，100°C保溫使其溶解。所述的0. 7%低熔點瓊脂糖凝膠為0. 7% (W/V)低熔點瓊脂糖，溶於電泳緩衝液中，100°C保溫使其溶解。所述的TE 溶液組成為lmol/L Tris-HCl, 500mmol/L EDTA，500mmol/L 檸檬酸， ρΗ8· O。本發明從影響提取DNA片段大小的因素入手，從環境樣品中提取了較其他方法所提片段大的高分子量DNA片段，提取的基因組DNA達到501Λ以上，經吸光度檢測，0D260/ 0D280比值在1. 8-2. 0之間。本發明方法重複性好，操作較為簡單，完全能滿足建庫等分子操作的要求。本發明在破壁和消化時使用瓊脂糖包埋樣品，減少了溶液對DNA的機械剪切破壞，對DNA起到保護作用；本發明使用含有HEPES的電泳緩衝液代替一般的含有Tris的電泳緩衝液，減少了電泳過程了由於Tris對DNA的破壞作用；本發明在電泳過程中使用了雙向電泳，減少了腐殖酸、多糖等雜質對最終產物的汙染；本發明使用電洗脫回收DNA，避免了其他方法苯酚抽提步驟對於DNA的機械剪切破壞。
附圖為不同提取方法所提取活性汙泥基因組DNA電泳比較Α.為試劑盒法提取的活性汙泥基因組DNA ；B.為溶菌酶+SDS法提取的活性汙泥基因組DNA ；C.為本發明方法所提取的活性汙泥基因組DNA，Marker為DL15000。
具體實施例方式取溼重約Ig的活性汙泥，加入ImL於50°C保溫的1 %低熔點瓊脂糖後混勻，冷卻使凝固；將膠塊放入IOmL破壁緩衝液中，37°C溫育Mh，期間保持水平50rpm震蕩；倒掉破壁緩衝液，加入IOmL消化緩衝液，37°C溫育Mh，期間保持水平50rpm震蕩；倒掉消化緩衝液，加入IOOmL洗滌液洗滌三次，再用4°C電泳緩衝液洗滌一次；將經破壁消化後的膠塊切成長8mm、寬6mm、高2mm大小，插入到0. 7%低熔點瓊脂糖凝膠的點樣孔中，用0. 7%低熔點瓊脂糖凝膠封好點樣孔的空隙後，在電泳緩衝液中以 5v/cm的電壓低溫電泳4小時；將0. 7%低熔點瓊脂糖凝膠旋轉90度後，繼續電泳2小時；染色後將含DNA的凝膠切下，用電洗脫法回收DNA，將電洗脫後得到的DNA涼幹，溶
4於50 μ 1的無菌去離子水或TE溶液，溶解液即為所提的DNA。使用0. 4%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測本方法所提取基因組DNA分子量大小。使用 1 X TAE作為電泳緩衝液，電場強度為4V/cm，4°C電泳池。凝膠染色後，使用美國基因公司G Box凝膠成像系統成像，並使用美國Bio-rad公司Quantity one V4. 6. 2軟體分析所提取的DNA分子量大小為50kb以上。
權利要求
1.一種從環境樣品中提取高分子量基因組DNA的方法，其特徵在於包含包埋、破壁、 消化、洗滌、電泳、膠回收、溶解步驟包埋用懸浮液懸浮環境樣品，加入低熔點瓊脂糖，室溫冷卻使凝固； 破壁將膠塊放入破壁緩衝液中，溫育，期間保持水平震蕩； 消化倒掉破壁緩衝液，加入消化緩衝液，溫育，期間保持水平震蕩； 洗滌倒掉消化緩衝液，加入洗滌液洗滌，再用電泳緩衝液洗滌； 電泳將經破壁消化後的膠塊切成小塊，插入到低熔點瓊脂糖凝膠的點樣孔中，用低熔點瓊脂糖凝膠封好點樣孔的空隙後，在電泳緩衝液中電泳；膠回收染色後將含DNA的凝膠切下，用電洗脫法回收DNA ；溶解將電洗脫後得到的DNA晾乾，溶於無菌去離子水或TE溶液，溶解液即為所提的DNA。
2.根據權利要求1所述的從環境樣品中提取高分子量基因組DNA的方法，其特徵在於包埋lmL懸浮液懸浮Ig環境樣品，加入ImL於50°C保溫的1 %低熔點瓊脂糖後混勻， 室溫冷卻使凝固；破壁將膠塊放入IOmL破壁緩衝液中，37°C溫育Mh，期間保持水平50rpm震蕩； 消化倒掉破壁緩衝液，加入IOmL消化緩衝液，37°C溫育Mh，期間保持水平50rpm震蕩；洗滌倒掉消化緩衝液，加入IOOmL洗滌液洗滌三次，再用4°C的電泳緩衝液洗滌一次；電泳將經破壁消化後的膠塊切成長8mm、寬6mm、高2mm大小，插入到0. 7%低熔點瓊脂糖凝膠的點樣孔中，用0. 7%低熔點瓊脂糖凝膠封好點樣孔的空隙後，在電泳緩衝液中以 5v/cm的電壓低溫電泳4小時；將0. 7%低熔點瓊脂糖凝膠旋轉90度後，繼續電泳2小時； 膠回收染色後將含DNA的凝膠切下，用電洗脫法回收DNA ；溶解將電洗脫後得到的DNA晾乾，溶於50μ 1的無菌去離子水或TE溶液，溶解液即為所提的DNA。
3.根據權利要求1或2所述的從環境樣品中提取高分子量基因組DNA的方法，其特徵在於所述的懸浮液組成為10mmol/L HEPE-NaOH，lmol/L NaCl, 50mmol/L EDTA, pH8. 0 ； 所述的破壁緩衝液組成為15mmol/L HEPES-NaOH, 100mmol/L NaCl, 100mmol/L EDTA, 0. 5g/L SDS，5mg/mL 溶菌酶，pH 7. 8 ；所述的消化緩衝液組成為:30mmol/L HEPES-NaOH, 500mmol/L NaCl，1 OOmmo 1/L Na3PO4, IOOmmo 1/L EDTA, IOmmo 1/L CaCl2,0. 5g/L SDS, 1. 5mg/mL 蛋白酶 K, pH 7. 8 ； 所述的洗滌液組成為5mmol/L HEPES-NaOH, 100mmol/L EDTA, pH 7.8 ； 所述的電泳緩衝液組成為16mmol/L HEPES-NaOH, 16mmol/L NaAc,0. 8mmol/LEDTA, lOOymol/L 硫脲，pH 7. 5 ；所述的 TE 溶液組成為lmol/L Tris-HCl，500mmol/L EDTA，500mmol/L 檸檬酸，pH8. 0。
全文摘要
本發明屬於分子生物學技術領域，涉及一種環境樣品中提取基因組DNA的方法。本發明方法包含包埋、破壁、消化、洗滌、電泳、膠回收、溶解步驟，用懸浮液懸浮環境樣品，加入低熔點瓊脂糖，室溫冷卻使凝固；將膠塊放入破壁緩衝液中，溫育，期間保持水平震蕩；倒掉破壁緩衝液，加入消化緩衝液，溫育，期間保持水平震蕩；倒掉消化緩衝液，加入洗滌液洗滌，再用電泳緩衝液洗滌；將經破壁消化後的膠塊切成小塊，插入到低熔點瓊脂糖凝膠的點樣孔中，用低熔點瓊脂糖凝膠封好點樣孔的空隙後，在電泳緩衝液中電泳；染色後將含DNA的凝膠切下，用電洗脫法回收DNA；將電洗脫後得到的DNA晾乾，溶於無菌去離子水或TE溶液，溶解液即為所提的DNA。本發明方法重複性好，操作較為簡單，完全能滿足建庫等分子操作的要求。
文檔編號C12N15/10GK102268426SQ20101019075
公開日2011年12月7日 申請日期2010年6月3日 優先權日2010年6月3日
發明者劉慶華, 李旭東, 楊俊仕, 郝純 申請人:中國科學院成都生物研究所