抗流感病毒的藥物有效部位及活性成分的分離製備方法
2023-05-29 03:00:51 3
專利名稱：抗流感病毒的藥物有效部位及活性成分的分離製備方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥有效部位及活性成分，特別是涉及一種抗流感病毒的中藥有效部位及活性成分的分離製備方法。
背景技術：
感冒是臨床常見病、多發病，尤其是由流感病毒引起的流行性感冒，對人體危害更大。目前用於治療感冒的中藥製劑和西藥製劑都很多見，但是從純中藥製劑中分離出具有抗流感病毒活性的藥物有效部位及活性成分的方法及相關製劑並不多見。
技術方案本發明的目的在於提供一種抗流感病毒的中藥有效部位及活性成分的分離製備方法；本發明的目的還在於提供所述中藥有效部位及活性成分的抗流感病毒新用途；本發明目的還在於提供一種由所述中藥有效部位及活性成分製成的藥劑；本發明目的還在於提供一種新的化合物。
本發明的目的是通過如下技術方案實現的按比例稱取金銀花9重量份、連翹9重量份、牛蒡子9重量份、甘草5重量份、薄荷6重量份、荊芥6重量份、桔梗6重量份、淡豆豉6重量份、淡竹葉4重量份，混合均勻，加水煎煮2-3次，合併各次水煎液，濃縮，通過弱極性的大孔吸附樹脂進行吸附，待水煎液全部通過樹脂柱後，用水繼續衝洗樹脂柱，至水洗液近無色止，然後再用40-70％乙醇對樹脂柱上吸附的物質進行洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓回收溶劑至幹，即得到複方中藥抗流感病毒活性部位。
本發明抗流感病毒活性部位為淡黃色粉末，具有一定的吸溼性，易溶於水和稀乙醇，難溶於氯仿、石油醚等親脂性有機溶劑。三氯化鐵反應陽性，鹽酸-鎂粉反應陽性，沒食子酸-濃硫酸反應陽性，α-萘酚-濃硫酸反應陽性。主要含有黃酮類和木脂素類成分，其中總黃酮成分的含量為35.0％，總木脂素類成分的含量為21.1％。另含有一定量的三萜類、酚酸類和其它成分。
本發明抗病毒活性成分的分離方法取本發明抗流感病毒活性部位300重量份，通過弱極性大孔吸附樹脂，用30％、50％、70％、95％乙醇水溶液依次進行洗脫，各部分洗脫液減壓回收溶劑後，分別得到30％乙醇洗脫物A72重量份，50％乙醇洗脫物B93重量份，70％乙醇洗脫物C12重量份，95％乙醇洗脫物D6重量份。
上述95％乙醇洗脫物D，用聚醯胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分。
30％乙醇洗脫部分用Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，得到化合物丙烯酸鹽。
50％乙醇洗脫部分經矽膠柱層析分離，20∶1，18∶1，15∶1，12∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，其中15∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫部分經SephadexLH-20柱層析分離，甲醇洗脫，得到化合物金合歡素。
上述70％乙醇洗脫物C，用聚醯胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為水洗脫部分、30％乙醇洗脫部分和50％乙醇洗脫部分，水洗脫部分用Sephadex LH-20柱層析分離，水洗脫，得到化合物甘草次酸和連翹苷；30％乙醇洗脫部分經Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，矽膠柱層析分離，19∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫、Sephadex LH-20柱層析分離，甲醇洗脫，得到化合物醉魚草苷；50％乙醇洗脫部分經Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，矽膠柱層析分離，10∶1，9∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，其中自6∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫部分得到化合物連翹酯苷。
上述50％乙醇洗脫物B，用聚醯胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為水洗脫部分、10％乙醇洗脫部分、30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分。
水洗脫部分用矽膠柱層析分離，分為水洗脫部分、10％乙醇洗脫部分、30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分。
水洗脫部分用矽膠柱層析分離，98∶2∶0.1，95∶5∶0.1，90∶5∶0.1，85∶5∶0.1，80∶5∶0.1，75∶5∶0.1，70∶5∶0.1，65∶5∶0.1，60∶5∶0.1，55∶5∶0.1，50∶5∶0.1，40∶5∶0.1，35∶5∶0.1，30∶5∶0.1氯仿-甲醇-水混合溶劑梯度洗脫，依次分為14個部分。其中部分4用矽膠柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到化合物牛蒡子苷；部分7用矽膠柱層析分離，11∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到化合物橙皮苷；部分9經Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，得到化合物烏拉爾甘草皂苷甲，烏拉爾甘草皂苷乙；部分14經Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，得到化合物甘草酸。
30％乙醇洗脫部分用矽膠柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按色帶分別收集，得到第1、2、3部分；7∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按色帶分別收集，得到第4、5、6部分；4∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到第7部分。其中自部分1得到化合物芒柄花素；部分2經Sephadex LH-20柱層析分離，甲醇洗脫，聚醯胺柱層析分離，19∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，得到化合物蘆丁和異甘草素；部分7經Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，聚醯胺柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，1∶1甲醇-水混合溶劑為流動相半製備高效液相色譜分離製備，得到化合物異甘草素-2』-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷。
50％乙醇洗脫部分用矽膠柱層析分離，60∶1，50∶1，40∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為8個部分，其中自部分1得到化合物大豆素；部分2經Sephadex LH-20柱層析分離，80％甲醇洗脫，得到化合物染料木素；部分8用矽膠柱層析分離，20∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到化合物三十八烯醇。
上述30％乙醇洗脫物A，用聚醯胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為水洗脫部分、10％乙醇洗脫部分、30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分。
水洗脫部分用矽膠柱層析分離，49∶1，39∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為14個部分。其中部分13經Sephadex LH-20柱層析分離，50％甲醇洗脫，得到化合物異甘草素-4』-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷。
10％乙醇洗脫部分用矽膠柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按色帶分別收集，得到10個部分。其中自部分2得到化合物甘草苷，自部分10得到化合物甘草素-4』-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷；部分9用聚醯胺柱層析分離，5∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，得到化合物金絲桃苷。
30％乙醇洗脫部分用矽膠柱層析分離，40∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為12個部分，其中自部分12得到化合物異甘草素-4-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷；部分2經Sephadex LH-20柱層析分離，50％甲醇洗脫，得到化合物綠原酸；部分10用半製備高效液相色譜分離製備，1∶20甲醇-3％醋酸混合溶劑為流動相，得到化合物4，5-二咖啡醯基奎寧酸，3，5-二咖啡醯基奎寧酸，3，4-二咖啡醯基奎寧酸。
50％乙醇洗脫部分用矽膠柱層析分離，49∶1，39∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1，3∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為15個部分，其中自部分7得到化合物6-甲氧基大豆素；部分14經製備薄層層析，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑為展開劑]製備得到化合物異甘草苷。
70％乙醇洗脫部分用矽膠柱層析分離，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為8個部分。其中自部分5得到化合物3，3』，4-三甲氧基鞣花酸，自部分8得到化合物甘草素。
上述分離得到的31個化合物的結構均經理化常數測定及波譜學方法(紫外光譜、紅外光譜、氫核磁共振光譜、碳核磁共振光譜和質譜等)予以測定。其中異甘草素-2』-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷為新化合物，丙烯酸鹽、金合歡素、醉魚草苷、大豆素、染料木素、三十八烯醇、6-甲氧基大豆素、3，3』，4-三甲氧基鞣花酸等8個化合物為首次從本發明各單味藥中分離得到的已知化合物，其餘22個化合物為首次從本發明中分離得到的已知化合物。
本發明活性部位及活性成份均可按常規工藝製成任何臨床上可接受的劑型。
發明人採用雞胚法和病毒致細胞病變作用(CPE)方法，考察了本發明煎劑和本發明抗流感病毒活性部位的抗流感病毒活性。
1.實驗材料病毒毒株甲型流感病毒(A1京防86-1)，乙型流感病毒(B1京防93-184)，由北京市防疫站提供。
細胞株MDCK細胞，由國家流感中心提供。細胞生長液為含小牛血清、青黴素、鏈黴素和谷胺醯胺的Eagle’s液。維持液同生長液，但不含小牛血清，而含終濃度為2mg/L的胰酶。
樣品(本發明煎劑)按本發明原方比例(金銀花∶連翹∶牛蒡子∶甘草∶薄荷∶荊芥∶桔梗∶淡豆豉∶淡竹葉為9∶9∶9∶5∶6∶6∶6∶6∶4)，取金銀花、連翹等9味藥共60g，混合均勻，加水煎煮2次(第一次加水1000mL，煎煮2小時；第二次加水800mL，煎煮1.5小時)。合併2次水煎液，共計1300mL，水浴濃縮至幹。實驗前，以高純水配置成相當於生藥0.01g/mL的濃度。
樣品(本發明抗病毒活性部位)取本發明抗流感病毒活性部位以高純水配置成相當於生藥0.01g/mL的濃度。
陽性對照藥病毒唑，湖北省醫藥工業研究所出品。實驗前，以高純水配置成0.005g/mL的濃度。
2.抗病毒實驗2.1雞胚法將雞胚在實驗室39℃下孵育至10天胚齡，於尿囊腔分別接種100EID50甲型和乙型流感病毒，接種量為0.1ml/胚，每組實驗均接種20枚雞胚。室溫放置1小時後，對照組尿囊腔給予生理鹽水0.2ml，實驗組分別給予本發明煎劑和本發明抗流感病毒活性部位0.2ml，陽性對照組給予病毒唑0.2ml。石蠟封口，置孵箱內孵化，48小時後將雞胚置冰箱內2小時，收穫尿囊液，進行血凝實驗。
表1 對雞胚內甲/乙流感病毒的作用*組別n 血凝(枚) 陽性 陰性生理鹽水 20/20 20/20 0/0本發明煎劑**20/20 4/316/17本發明抗病毒活性部位**20/20 0/020/20病毒唑***20/20 0/020/20*甲A/京防86-1，乙B/京防93-184**本發明、本發明抗病毒活性部位相當於生藥0.01g/mL***病毒唑0.005g/mL
表2對甲/乙流感病毒殺滅、預防和治療作用*給藥時間本發明煎劑**本發明活性部位**病毒唑***病毒對照病毒感染同時3.5/3.0 2.0/1.5 1.5/1.3 6.5/5.5病毒感染前 3.0/3.5 1.5/1.8 1.5/1.5 7.0/6.0病毒感染後 4.0/2.5 2.5/1.5 2.0/1.5 6.5/4.5*甲A/京防86-1，乙B/京防93-184**本發明、本發明抗病毒活性部位相當於生藥0.01g/mL***病毒唑0.005g/mL表3 不同濃度本發明抗流感病毒活性部位在細胞中抗甲/乙流感病毒作用*病毒 給藥時間本發明抗病毒活性部位濃度 病毒對照0.01g/mL0.005g/mL 0.0025g/mL甲/乙 病毒感染同時2.0/1.5 3.5/2.5 5.0/4.5 6.5/5.5*甲A/京防86-1，乙B/京防93-1842.2毒致細胞病變作用(CPE)取成片MDCK細胞，棄去生長液，用Hank’s液洗一次。將A1京防86-1和B1京防93-184病毒配置成10-1～10-8稀釋液，然後分別加入試管中。2小時後倒掉病毒液，用Hank’s液洗一次，在分別加入相當於生藥濃度0.01g/ml的本發明煎劑和本發明抗流感病毒活性部位以及終濃度為0.005g/ml的病毒唑，對照組分別加入1ml維持液。置37℃5％CO2培養箱中培養，72小時後在倒置顯微鏡下觀察。
表4 本發明抗流感病毒活性部位在MDCK細胞中的抗病毒作用樣品TCID50甲型流感病毒 乙型流感病毒生理鹽水 6.5 4.5本發明煎劑 4.0 2.5本發明抗病毒活性部位 2.5 1.5病毒唑 2.0 1.53.實驗結果由表1～3可知，本發明抗病毒活性部位和陽性對照組均未出現血凝現象，說明本發明抗病毒活性部位對甲型和乙型流感病毒均有顯著的抑制作用，使流感病毒滴度降低。由表4可知，本發明抗病毒活性部位對甲型和乙型流感病毒，其TCID50比病毒對照組低1.5log以上，說明本發明抗流感病毒活性部位在這兩種病毒感染過程中具有治療作用。
發明人還對抗流感病毒活性部位的抗流感病毒作用機理進行了研究1 實驗材料1.1藥物與試劑受試藥物本發明抗流感病毒活性部位陽性對照藥病毒唑(virazole)，湖北省濱湖製藥廠產品，為原料藥(批號970512)，體外實驗時以高純水配製成藥物濃度為0.5mg/ml的原藥液。
試劑細胞培養液含10％小牛血清、0.29g/ml穀氨醯胺、100u/ml青、鏈黴素的Eagle’s MEM(日本日水製藥株式會社出品)；細胞維持液除所含小牛血清為2％外，其它含量均同培養液。
1.2 病毒與細胞病毒呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒-I型(HN-I)、流感病毒A3型，購自中國預防醫學科學院病毒研究所及兒科研究所，中國中醫研究院中藥研究所病毒室傳代，-70℃保存備用。
細胞人喉癌傳代細胞Hep-2株，由衛生部藥品生物製品檢定所提供。
1.3 儀器CO2培養箱，日本Yamato科學株式會社製造；倒置顯微鏡，德國產Olympus牌。
2 實驗方法2.1 本發明抗流感病毒活性部位對Hep-2培養細胞的毒性試驗將本發明抗流感病毒活性部位樣品液(實驗前用高純水配製成藥物濃度為100mg/ml的原藥液，過濾除菌)以細胞培養液作1∶2～1∶256倍比稀釋。取已長成單層的Hep-2細胞，倒掉培養液，加入不同稀釋度的藥液，每孔加100μl，每個稀釋度各加4個復孔，同時設正常細胞對照。將培養板置37℃5％CO2培養箱中培養4天，每日用倒置顯微鏡觀察藥液對細胞的影響，以細胞不出現退變的最小稀釋度判定為藥物對細胞的最大無毒濃度。
通過毒性試驗觀察到1∶256倍比稀釋的本發明抗流感病毒活性部位原藥液對細胞生長無明顯影響，故定為最大無毒濃度(即最大有效濃度)，實驗時以最大有效濃度順延至最小有效濃度。
2.2本發明抗流感病毒活性部位對病毒致細胞病變作用(CPE)的影響2.2.1先感染後加藥取已長成單層細胞的96孔培養板，倒掉培養液，分別接種100TCID50的不同病毒液50μl/孔，置37℃5％CO2培養箱中吸附1h；倒掉病毒液，用不含小牛血清的細胞維持液洗細胞面3次，然後加入相應稀釋度的藥液100μl/孔，每個稀釋度作4個復孔，同時設病毒對照、正常細胞對照及陽性藥對照。置37℃5％CO2培養箱中培養，每日在倒置顯微鏡下鏡檢1次，觀察細胞有無病變及病變進展情況。
2.2.2先加藥後感染取已長成單層細胞的96孔培養板，倒掉培養液，加入相應稀釋度的藥液100μl/孔，置37℃5％CO2培養箱中作用1h；倒掉藥液，再感染100TCID50的不同病毒液50μl/孔，置37℃5％CO2培養箱中吸附1h；倒掉病毒液，用細胞維持液洗細胞面3次，然後每孔加入100μl細胞維持液，置37℃5％CO2培養箱中培養，每日在倒置顯微鏡下鏡檢1次，觀察細胞有無病變及病變進展情況。
2.2.3對病毒的直接殺滅作用把100TCID50的不同病毒液加入到相應稀釋度的藥液中，置37℃5％CO2培養箱中作用1h；之後將其加入到已長成單層細胞的96孔培養板中，置37℃5％CO2培養箱中吸附1h；倒掉溶液，用細胞維持液洗細胞面3次，然後每孔加入100μl細胞維持液，置37℃5％CO2培養箱中培養，每日在倒置顯微鏡下鏡檢1次，觀察細胞有無病變及病變進展情況。
3 實驗結果上述實驗中，當病毒對照組細胞病變達到「++++」時記錄實驗結果。細胞病變程度(CPE)的判斷按以下6級分類標準，結果採用秩和檢驗進行統計學處理。細胞病變程度(CPE)判斷的6級分類標準「-」細胞正常生長，無病變出現；「±」細胞病變少於整個單層細胞的10％；「+」細胞病變約佔整個單層細胞的25％；「++」細胞病變約佔整個單層細胞的50％；「+++」細胞病變約佔整個單層細胞的75％；「++++」細胞病變約佔整個單層細胞的75％以上。同時計算相應的有效濃度範圍、抑制50％細胞病變的藥物濃度(IC50)及治療指數(TI)。實驗結果見表5、6、7。
有效濃度＝原藥液濃度/稀釋倍數治療指數＝最大無度濃度/最小有效濃度IC50按Reed-Muench法計算。
表5 本發明抗流感病毒活性部位的抗病毒活性濃度 先感染後加藥 先加藥後感染 對病毒的直接殺滅作用藥物(mg/ml)流感病毒A3HN-I RSV 流感病毒A3HN-I RSV influenza A3virus HN-IRSV0.390 ----** ----** 44443333 4444 44443333 44444444本發明0.195±±±±**±±±±* 44443333 4444 44443333 44444444抗流感0.0971111**2322** 44443333 4444 44443333 44444444病毒活0.0493333 4444 44443333 4444 44443333 4444 4444性部位0.0243333 4444 4444 3333 4444 44443333 4444 44440.500----**----** 3333 1111** ±±±±** 4444±±±±**±±±±** 44440.250----**----** 4444 2222* 1111** 44441111**1111** 4444病毒唑0.125 ±±±±**±±±±** 4444 3333 3333 44443333 3333 44440.062 3333 44444444 3333 4444 44443333 4444 44440.031 3333 44444444 3333 4444 44443333 4444 4444生理鹽水 3333 44444444 3333 4444 44443333 3333 4444注表中的數字為每個細胞孔的細胞病變程度(CPE)相應的病變等級。
與病毒對照組比較**P＜0.01*P＜0.05表5結果顯示，藥物直接作用於病毒及先給藥物後再感染病毒時，本發明抗流感病毒活性部位均沒有表現出抑制作用；而當先感染病毒後再給藥時，本發明抗流感病毒活性部位對流感病毒A3和副流感病毒所致細胞病變則表現出明顯的抑制作用，與病毒對照組比較有顯著性差異(P＜0.05＝；而對RSV則無效。
表6本發明抗流感病毒活性部位有效濃度範圍(mg/ml)本發明抗流感病毒活性部位 病毒唑流感病毒A30.097～0.390 0.125～0.500HN-I 0.097～0.390 0.250～0.500RSV ——注「—」表示對所試病毒無效表6結果顯示，在體外本發明抗流感病毒活性部位對對流感病毒A3和副流感病毒有明顯的抑制作用，有效濃度在0.097～0.390mg/ml之間，與陽性藥病毒唑作用相當。
表7本發明抗流感病毒活性部位的IC50(mg/ml)和治療指數TI本發明抗流感病毒活性部位 病毒唑IC50TI IC50TI流感病毒A30.0714 8.91 4HN-I 0.0834 8.91 2RSV — — ——注「—」表示對所試病毒無效表7結果顯示，在體外本發明抗流感病毒活性部位對流感病毒A3和副流感病毒的IC50在0.071～0.083之間，治療指數均為4。
實施例1按比例稱取金銀花0.9kg、連翹0.9kg、牛蒡子0.9kg、甘草0.5kg、薄荷0.6kg、荊芥0.6kg、桔梗0.6kg、淡豆豉0.6kg、淡竹葉0.4kg，取金銀花、連翹等9味藥共6kg，混合均勻，加水煎煮2次，第一次加水100L，煎煮2小時；第二次加水80L，煎煮1.5小時；合併2次水煎液，濃縮至60L；通過弱極性的AB-8大孔吸附樹脂進行吸附，樹脂體積為15L，吸附流速為2L/h；待水煎液全部通過樹脂柱後，用8倍樹脂體積，即約120L的水繼續衝洗樹脂柱，至水洗液近無色止，然後再用8倍樹脂體積，即約120L的50％乙醇對樹脂柱上吸附的物質進行洗脫，洗脫流速為2L/h；收集50％乙醇洗脫液，減壓回收溶劑至幹，即得到本發明抗流感病毒活性部位350g。計算本發明抗流感病毒活性部位的得率為5.83％。
實施例2按比例稱取金銀花0.9kg、連翹0.9kg、牛蒡子0.9kg、甘草0.5kg、薄荷0.6kg、荊芥0.6kg、桔梗0.6kg、淡豆豉0.6kg、淡竹葉0.4kg，取金銀花、連翹等9味藥共6kg，混合均勻，加水煎煮3次，第一次加水100L，煎煮2小時；第二、三次加水80L，煎煮1.5小時；合併3次水煎液，濃縮至60L；通過弱極性的AB-8大孔吸附樹脂進行吸附，樹脂體積為15L，吸附流速為2L/h；待水煎液全部通過樹脂柱後，用8倍樹脂體積，即約120L的水繼續衝洗樹脂柱，至水洗液近無色止，然後再用8倍樹脂體積，即約120L的60％乙醇對樹脂柱上吸附的物質進行洗脫，洗脫流速為2L/h；收集60％乙醇洗脫液，減壓回收溶劑至幹，即得到本發明抗流感病毒活性部位350g。計算本發明抗流感病毒活性部位的得率為5.83％；將活性部位常規賦性劑製成膠囊。
實施例3活性成份的分離方法取本發明抗流感病毒活性部位300g，通過弱極性大孔吸附樹脂，用30％、50％、70％、95％乙醇水溶液依次進行洗脫，各部分洗脫液減壓回收溶劑後，分別得到30％乙醇洗脫物A72g，50％乙醇洗脫物B93g，70％乙醇洗脫物C12g，95％乙醇洗脫物D6g。
上述95％乙醇洗脫物D，用聚醯胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分。
30％乙醇洗脫部分用Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，得到化合物丙烯酸鹽5mg。
50％乙醇洗脫部分經矽膠柱層析分離，20∶1，1 8∶1，15∶1，12∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，其中15∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫部分經SephadexLH-20柱層析分離，甲醇洗脫，得到化合物金合歡素18mg。
上述70％乙醇洗脫物C，用聚醯胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為水洗脫部分、30％乙醇洗脫部分和50％乙醇洗脫部分，水洗脫部分用Sephadex LH-20柱層析分離，水洗脫，得到化合物甘草次酸10mg和連翹苷22mg；30％乙醇洗脫部分經Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，矽膠柱層析分離，19∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫、Sephadex LH-20柱層析分離，甲醇洗脫，得到化合物醉魚草苷18mg；50％乙醇洗脫部分經SephadexLH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，矽膠柱層析分離，10∶1，9∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，其中自6∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫部分得到化合物連翹酯苷5mg。
上述50％乙醇洗脫物B，用聚醯胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為水洗脫部分、10％乙醇洗脫部分、30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分。
水洗脫部分用矽膠柱層析分離，分為水洗脫部分、10％乙醇洗脫部分、30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分。
水洗脫部分用矽膠柱層析分離，98∶2∶0.1，95∶5∶0.1，90∶5∶0.1，85∶5∶0.1，80∶5∶0.1，75∶5∶0.1，70∶5∶0.1，65∶5∶0.1，60∶5∶0.1，55∶5∶0.1，50∶5∶0.1，40∶5∶0.1，35∶5∶0.1，30∶5∶0.1氯仿-甲醇-水混合溶劑梯度洗脫，依次分為14個部分。其中部分4用矽膠柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到化合物牛蒡子苷95mg；部分7用矽膠柱層析分離，11∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到化合物橙皮苷16mg；部分9經Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，得到化合物烏拉爾甘草皂苷甲24mg，烏拉爾甘草皂苷乙18mg；部分14經Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，得到化合物甘草酸18mg。
30％乙醇洗脫部分用矽膠柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按色帶分別收集，得到第1、2、3部分7∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按色帶分別收集，得到第4、5、6部分；4∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到第7部分。其中自部分1得到化合物芒柄花素8mg；部分2經Sephadex LH-20柱層析分離，甲醇洗脫，聚醯胺柱層析分離，19∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，得到化合物蘆丁33mg和異甘草素2 1mg；部分7經Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，聚醯胺柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，1∶1甲醇-水混合溶劑為流動相半製備高效液相色譜分離製備，得到化合物異甘草素-2』-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷12mg。
50％乙醇洗脫部分用矽膠柱層析分離，60∶1，50∶1，40∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為8個部分，其中自部分1得到化合物大豆素23mg；部分2經Sephadex LH-20柱層析分離，80％甲醇洗脫，得到化合物染料木素18mg；部分8用矽膠柱層析分離，20∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到化合物三十八烯醇12mg。
上述30％乙醇洗脫物A，用聚醯胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為水洗脫部分、10％乙醇洗脫部分、30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分。
水洗脫部分用矽膠柱層析分離，49∶1，39∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為14個部分。其中部分13經Sephadex LH-20柱層析分離，50％甲醇洗脫，得到化合物異甘草素-4』-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷42mg。
10％乙醇洗脫部分用矽膠柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按色帶分別收集，得到10個部分。其中自部分2得到化合物甘草苷33mg；自部分10得到化合物甘草素-4』-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷5mg；部分9用聚醯胺柱層析分離，5∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，得到化合物金絲桃苷15mg。
30％乙醇洗脫部分用矽膠柱層析分離，40∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為12個部分，其中自部分12得到化合物異甘草素-4-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷12mg；部分2經Sephadex LH-20柱層析分離，50％甲醇洗脫，得到化合物綠原酸13mg；部分10用半製備高效液相色譜分離製備，1∶20甲醇-3％醋酸混合溶劑為流動相，得到化合物4，5-二咖啡醯基奎寧酸6mg，3，5-二咖啡醯基奎寧酸4mg，3，4-二咖啡醯基奎寧酸1 2mg。
50％乙醇洗脫部分用矽膠柱層析分離，49∶1，39∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，1 6∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1，3∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為15個部分，其中自部分7得到化合物6-甲氧基大豆素4mg；部分14經製備薄層層析，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑為展開劑]製備得到化合物異甘草苷12mg。
70％乙醇洗脫部分用矽膠柱層析分離，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為8個部分。其中自部分5得到化合物3，3』，4-三甲氧基鞣花酸50mg，自部分8得到化合物甘草素15mg。
權利要求
1.一種抗流感病毒的藥物有效部位，其特徵在於該有效部位是由下述方法製得的按比例稱取金銀花0.9kg、連翹0.9kg、牛蒡子0.9kg、甘草0.5kg、薄荷0.6kg、荊芥0.6kg、桔梗0.6kg、淡豆豉0.6kg、淡竹葉0.4kg，取金銀花、連翹等9味藥共6kg，混合均勻，加水煎煮2次，第一次加水100L，煎煮2小時第二次加水80L，煎煮1.5小時合併2次水煎液，濃縮至60L；通過弱極性的AB-8大孔吸附樹脂進行吸附，樹脂體積為15L，吸附流速為2L/h待水煎液全部通過樹脂柱後，用8倍樹脂體積，即約120L的水繼續衝洗樹脂柱，至水洗液近無色止，然後再用8倍樹脂體積，即約120L的50％乙醇對樹脂柱上吸附的物質進行洗脫，洗脫流速為2L/h；收集50％乙醇洗脫液，減壓回收溶劑至幹，即得到本發明抗流感病毒活性部位。
2.如權利要求1所述的有效部位，其特徵在於該有效部位在製備抗流感病毒的藥物中的應用。
3.抗流感病毒的藥物活性成分，其特徵在於該活性成分是由下述方法製得的按比例稱取金銀花9重量份、連翹9重量份、牛蒡子9重量份、甘草5重量份、薄荷6重量份、荊芥6重量份、桔梗6重量份、淡豆豉6重量份、淡竹葉4重量份，混合均勻，加水煎煮2-3次，合併各次水煎液，濃縮，通過弱極性的大孔吸附樹脂進行吸附，待水煎液全部通過樹脂柱後，用水繼續衝洗樹脂柱，至水洗液近無色止，然後再用40-70％乙醇對樹脂柱上吸附的物質進行洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓回收溶劑至幹，即得到複方中藥抗流感病毒活性部位取本發明抗流感病毒活性部位300重量份，通過弱極性大孔吸附樹脂，用30％、50％、70％、95％乙醇水溶液依次進行洗脫，各部分洗脫液減壓回收溶劑後，分別得到30％乙醇洗脫物A72重量份，50％乙醇洗脫物B93重量份，70％乙醇洗脫物C12重量份，95％乙醇洗脫物D6重量份；上述95％乙醇洗脫物D，用聚醯胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分；30％乙醇洗脫部分用Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，得到化合物丙烯酸鹽；50％乙醇洗脫部分經矽膠柱層析分離，20∶1，18∶1，15∶1，12∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，其中15∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫部分經SephadexLH-20柱層析分離，甲醇洗脫，得到化合物金合歡素上述70％乙醇洗脫物C，用聚醯胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為水洗脫部分、30％乙醇洗脫部分和50％乙醇洗脫部分，水洗脫部分用Sephadex LH-20柱層析分離，水洗脫，得到化合物甘草次酸和連翹苷；30％乙醇洗脫部分經Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，矽膠柱層析分離，19∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫、SephadexLH-20柱層析分離，甲醇洗脫，得到化合物醉魚草苷；50％乙醇洗脫部分經Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，矽膠柱層析分離，10∶1，9∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，其中自6∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫部分得到化合物連翹酯苷上述50％乙醇洗脫物B，用聚醯胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為水洗脫部分、10％乙醇洗脫部分、30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分；水洗脫部分用矽膠柱層析分離，分為水洗脫部分、10％乙醇洗脫部分、30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分；水洗脫部分用矽膠柱層析分離，98∶2∶0.1，95∶5∶0.1，90∶5∶0.1，85∶5∶0.1，80∶5∶0.1，75∶5∶0.1，70∶5∶0.1，65∶5∶0.1，60∶5∶0.1，55∶5∶0.1，50∶5∶0.1，40∶5∶0.1，35∶5∶0.1，30∶5∶0.1氯仿-甲醇-水混合溶劑梯度洗脫，依次分為14個部分；其中部分4用矽膠柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到化合物牛蒡子苷；部分7用矽膠柱層析分離，11∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到化合物橙皮苷；部分9經Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，得到化合物烏拉爾甘草皂苷甲，烏拉爾甘草皂苷乙部分14經SephadexLH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，得到化合物甘草酸；30％乙醇洗脫部分用矽膠柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按色帶分別收集，得到第1、2、3部分；7∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按色帶分別收集，得到第4、5、6部分；4∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到第7部分；其中自部分1得到化合物芒柄花素部分2經SephadexLH-20柱層析分離，甲醇洗脫，聚醯胺柱層析分離，19∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，得到化合物蘆丁和異甘草素；部分7經Sephadex LH-20柱層析分離，95％乙醇洗脫，聚醯胺柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，1∶1甲醇-水混合溶劑為流動相半製備高效液相色譜分離製備，得到化合物異甘草素-2』-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷；50％乙醇洗脫部分用矽膠柱層析分離，60∶1，50∶1，40∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為8個部分，其中自部分1得到化合物大豆素；部分2經Sephadex LH-20柱層析分離，80％甲醇洗脫，得到化合物染料木素；部分8用矽膠柱層析分離，20∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫得到化合物三十八烯醇上述30％乙醇洗脫物A，用聚醯胺柱層析分離，水-乙醇混合溶劑梯度洗脫，分為水洗脫部分、10％乙醇洗脫部分、30％乙醇洗脫部分、50％乙醇洗脫部分和70％乙醇洗脫部分；水洗脫部分用矽膠柱層析分離，49∶1，39∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為14個部分；其中部分13經Sephadex LH-20柱層析分離，50％甲醇洗脫，得到化合物異甘草素-4』-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷；10％乙醇洗脫部分用矽膠柱層析分離，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按色帶分別收集，得到10個部分；其中自部分2得到化合物甘草苷，自部分10得到化合物甘草素-4』-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷；部分9用聚醯胺柱層析分離，5∶1氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，得到化合物金絲桃苷30％乙醇洗脫部分用矽膠柱層析分離，40∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為12個部分，其中自部分12得到化合物異甘草素-4-O-芹糖(1-2)-葡萄糖苷；部分2經SephadexLH-20柱層析分離，50％甲醇洗脫，得到化合物綠原酸；部分10用半製備高效液相色譜分離製備，1∶20甲醇-3％醋酸混合溶劑為流動相，得到化合物4，5-二咖啡醯基奎寧酸，3，5-二咖啡醯基奎寧酸，3，4-二咖啡醯基奎寧酸；50％乙醇洗脫部分用矽膠柱層析分離，49∶1，39∶1，35∶1，30∶1，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1，5∶1，4∶1，3∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為15個部分，其中自部分7得到化合物6-甲氧基大豆素；部分14經製備薄層層析，9∶1氯仿-甲醇混合溶劑為展開劑製備得到化合物異甘草苷；70％乙醇洗脫部分用矽膠柱層析分離，25∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，7∶1，6∶1氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫，依次分為8個部分其中自部分5得到化合物3，3』，4-三甲氧基鞣花酸，自部分8得到化合物甘草素。
全文摘要
本發明公開了一種抗流感病毒的藥物組合物及其有效部位和活性成分的分離製備方法，本發明所獲得的活性成分包括新化合物異甘草素－2』－O－芹糖(1－2)－葡萄糖苷和30種已知化合物，本發明有效部位及活性成分具有良好的殺滅流感病毒的作用。
文檔編號A61P1/16GK1504232SQ20031011343
公開日2004年6月16日 申請日期2001年11月12日 優先權日2001年11月12日
發明者石任兵, 劉斌, 陸蘊如, 石鉞, 何勤, 肖詩鷹 申請人:北京中醫藥大學