一種棉花分子遺傳連鎖作圖的方法

2023-05-29 05:02:21 1

專利名稱：：一種棉花分子遺傳連鎖作圖的方法
技術領域：
：本發明屬於一種評價棉花連鎖遺傳的方法，特別是關於棉花分子遺傳連鎖作圖的方法，具體涉及利用序列相關擴增多態性(SRAP)分子標記進行棉花分子遺傳連鎖作圖的方法的發明。
背景技術：
：分子遺傳連鎖圖已經在多種植物中構建。棉花分子標記連鎖圖的構建始於1994年，Reinish應用限制性片段長度多態性(RFLP)標記構建了一張包含705個多態性位點，分布到不同大小的41個連鎖群的圖譜，總長4675cM(ReinischAJ，DongJM，BrubakerCL，StellyDM，WendelJF，PatersonAH.AdetailedRFLPmapofcottonGossypiumhirsutum×Gossypiumbarbadensechromosomeorganizationandevolutioninadisomicpolyploidgenome.Genetics，1994，138829-847)。Shappley等利用陸地棉×陸地棉F2群體應用限制性片段長度多態性(RFLP)標記構建了總長為865cM，含120個標記，覆蓋基因組18.6％左右的連鎖圖(ShappleyZ.W，JenkinsJ.N.，C.E.MeredithWR，McCarty，JrJC.AnRFLPlinkagemapofUplandcotton，GossypiumhirsutumL.TheorApplGenet，1998，97756～761)。Jiang等應用限制性片段長度多態性(RFLP)得到含261個標記，27個連鎖群，平均間距14.4cM，總長3767cM的連鎖圖譜(JiangCX，WrightRJ，El-ZikKM，PatersonAH.PolyploidformationcreateduniqueavenuesforresponsetoselectioninGossypium(cotton).ProcNatlAcadSci，1998，951419～1424)。Ulloa等構建了總長為700.7cM，覆蓋基因組15％左右，包含有81個限制性片段長度多態性(RFLP)多態性位點的分子標記連鎖圖(UlliaM，MeredithJrWR.GeneticlinkagemapandQTLanalysisofagronomicandfiberqualitytraitsinanintraspecificpopulation.TheJournalofCottonScience，2000，4161～170)。左開井等利用泗綿3號(Bt)與鄂荊1號的152個F2單株，得到67個多態性位點(40個RFLP，11個RAPD，16個SSR位點)，分布在8個連鎖群上，圖譜長度為1337.4cM(左開井，孫濟中，張獻龍等。利用RAPD、SSR和RFLP標記構建陸地棉分子標記連鎖圖。華中農業大學學報，2000，19(3)190～193)。Ulloa等利用Shappley等(1998)和Ulloa和Meredith(2000)構建的兩個連鎖群和他們新構建的另兩張圖譜聚合作圖，得到了47個連鎖群，含284個位點，總長1502.6cM，但標記在各連鎖群分布不均勻(UlloaM，MeredithWRJr，ShappleyZW，KahlerAL.RFLPgeneticlinkagemaopsfromF2.3populationsandajoinmapofGossypiumhirsutum.TheorApplGenet，2002，104200～208)。ZhangJ通過半配合產生58個GossypiumhirsutumL.和GossypiumbarbadenseL.的單倍體群體，應用於連鎖圖構建，624個標記(510個SSR和114個RAPD)中的489個進入43個連鎖群，總長3314.5cM(ZhangJ，GuoW，ZhangT.Molecularlinkagemapofallotetraploidcotton(GossypiumhirsutumL.×GossypiumbarbadenseL.)withahaploidpopulation.TheorApplGenet，2002，1051166～1174)。就目前而言，棉花已經構建的多張分子標記連鎖圖，應用的DNA標記主要是限制性片段長度多態性(RFLP)、簡單序列重複(SSR)和隨機擴增多態性DNA(RAPD)。限制性片段長度多態性(RFLP)標記具有共顯性、信息完整、重複性和穩定性好等優點，但RFLP技術的實驗操作過程較複雜，不易實現自動化，並且對DNA的要求高，用量大，對大群體進行分析的費用大。隨機擴增多態性DNA(RAPD)標記對DNA的需要量少，對DNA的要求不高，操作簡單易行，但RAPD標記易受實驗條件影響，重複性差，產率低。簡單序列重複(SSR)是一種很好的標記，但棉花的SSR有限，而開發SSR很費時又很昂貴。棉花的分子標記連鎖圖密度還不夠，必須增加標記才能滿足應用的需要，現有的標記對增加圖譜密度的能力有限，必須應用新的標記。
發明內容本發明的目的在於克服現有應用於棉花分子連鎖圖構建的缺陷，應用SRAP構建棉花的分子標記連鎖圖，平均每個引物組合可產生3.75個多態性條帶，最多可產生13條帶，具有產率高、增加標記所需時間短的特點，可大幅度增加棉花分子標記連鎖圖的密度。本發明通過以下技術方案實現一種評價棉花連鎖遺傳的方法，特別是棉花分子遺傳連鎖遺傳作圖的方法，其特徵在於按照下列步驟1)以海島棉品系Pima90為父本，陸地棉品種邯鄲208為母本，配製雜交組合，將得到的F2單株作為分子遺傳連鎖作圖的起始材料，並將所述的材料種植于田間；2)從所述的田間材料中取所述的親本和F2群體植株的嫩綠葉片提取其總DNA；3)應用序列相關擴增多態性(Sequence-relatedamplifiedpolymorphismSRAP)標記方法，利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增引物檢測所述群體的多態性並進行遺傳作圖，其中所述的引物除Li和Quiros(LiG，QuirosCF.Sequence-relatedamplifiedpolymorphisim(SRAP)，anewmarkersystembasedonasimolePCRreactionitsapplicationtomappingandgenetagginginBrassica.TheorApplGenet，2001，103455～461)報導的引物外，另外自行設計了引物，該引物的編號從me6--m9，(上遊引物)；em7--e17(下遊引物)。本發明自行設計的引物如附圖1所示；4)將步驟3)擴增的DNA片段進行聚丙烯醯胺凝膠電泳，該方法包括先用2000伏電壓預電泳至電流為30mA，上樣後用2500伏恆壓再電泳1.5～2h，在電泳過程中控制膠板溫度不高於50℃；5)對步驟4)獲得的凝膠片進行銀染，染色時先染凝膠下部，待顯出帶後再染上部；6)結合凝膠片所顯示的帶型進行遺傳連鎖評價並作圖。在本發明中所述的PCR反應體系是DNA模板60ng；在所述的涉及的引物中隨機取上、下遊引物各1個，配對使用，每個引物用量為30ng，dNTPs為200uM；1×ReactionBuffer；MgCl2為1.5mM；Taq酶1U，總體積為20ul，不足部分用ddH2O補充。附圖及其說明圖1是本發明中設計的SRAP分子標記引物；圖2是本發明的引物m3e14在部分F2群體上的擴增圖；圖中，M100bpladder；P1邯鄲208；P2Pima90；其它為F2部分單株；箭頭示多態性條帶。圖3是本發明的棉花SRAP分子標記連鎖圖；以下結合說明書及附圖對本發明作進一步描述1、供試材料以Pima90(海島棉)為父本，邯208(陸地棉)為母本，配製雜交組合，得到129個F2單株作為作圖群體。所有材料種於中國湖北省武漢市華中農業大學試驗田。2、總DNA提取方法從所述的田間材料中取所述親本和F2群體植株的嫩綠葉片提取其總DNA，具體方法參照1994年Paterson等(PatersonAH，CurtLB，WendelJF，Arapidmethodforextractionofcotton(Gossypiumspp.)genomicDNAsuitableforRFLPandPCRanalysis.PlantMolBilRep，1993，11112-127)發表的方法提取。3、SRAP標記分析(1)棉花SRAP標記分析PCR引物除Li和Quiros(LiG，QuirosCF.Sequence-relatedamplifiedpolymorphisim(SRAP)，anewmarkersystembasedonasimolePCRreactionitsapplicationtomappingandgenetagginginBrassica.TheorApplGenet，2001，103455～461)論文中發表的引物外，另自行設計引物，該引物的編號從me6--m9，(上遊引物)；em7--e17(下遊引物)。本發明的引物見附圖1所示。之後將本發明所設計的引物交由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。在本發明中PCR反應體系為DNA模板60ng；在所述的涉及的引物中隨機取上、下遊引物各1個，配對使用，每個引物用量為30ng(用量參照AFLP方法見文獻VosP，HogersR，BleekerM，ReijansM，vandeLeeT，HomesM，FrijtersA，PotJ，PelemanJ，KuiperM，ZabeauM.AFLPanewtechniqueforDNAfingerprinting.NucleicAcidsRes，1995，234407～4414)；dNTPs為200uM；1×ReactionBuffer；MgCl2為1.5mM；Taq酶1U(購自MBI公司)，總體積為20ul，不足部分用ddH2O補充。DNA擴增程序參照Li和Quiros報導的方法，擴增反應在PTC-100PCR儀上進行。(2)電泳電泳儀為美國生命科學公司的EC-160電泳儀，電泳緩衝液為0.5×TBE。20ul擴增產物中加入10ulLoadingBuffer(98％去離子甲醯胺，10mMEDTA，0.25％溴粉蘭，0.25％二甲苯青)，95℃變性5min，上樣5ul。採用6％PAGE膠(7mol/L尿素)分離，2000伏電壓預電泳至電流為30mA，上樣後用2500伏恆壓電泳1.5～2h，電泳過程中確保膠板溫度不高於50℃。(3)電泳後銀染，銀染方法參考吳冠芸等的方法(吳冠芸，潘華珍，吳羽生物化學與分子生物學實驗常用數據手冊，北京，科學出版社，1999)。染色時，先染凝膠下部，待顯出帶後，再染上部。4、數據整理及連鎖分析分子標記的記錄採用Mapmaker軟體(LincolnS，DalyM，LanderES.ConstructiongeneticmapswithMAPMAKER/EXP3.0.InWhiteheadInstituteTechnicalReport，2nded.CambridgeWhiteheadInstitute，1992)記錄方法。對於共顯性標記，用「A」表示邯鄲208親本的純合帶型；用「B」表示Pima90親本的純合帶型；「H」表示兩親本的雜合帶型。對於顯性標記，邯鄲208親本為純合帶型，記為「A」；Pima90親本的純合帶型與雜合帶型記為「C」。Pima90親本的純合帶型記為「B」；邯鄲208親本的純合帶型與雜合帶型記為「D」。缺失數據用「-」表示。採用「引物組合+標記分子量」的方法對標記進行命名，如m1e1-550，「m1e1」表示引物組合me1和em1，「-550」表示該標記的分子量；引物組合後面的「-K」表示該標記的分子量為1000bp。利用MAPMAKER/EXP.3.0(LincolnS，DalyM，LanderES.ConstructiongeneticmapswithMAPMAKER/EXP3.0.InWhiteheadInstituteTechnicalReport.2nded.CambridgeWhiteheadInstitute，1992)為作圖軟體，先用Group和Order命令進行標記間連鎖分析(LOD＝3.0，r＝0.4)，對未進入連鎖群的標記用Try命令連到相應連鎖群上，最後用Ripple命令確定最佳排列順序，構建棉花分子標記連鎖圖。利用Kasambi函數將重組率轉換為遺傳圖距(cM)。本發明的效果1、利用SRAP構建的棉花分子標記連鎖圖，標記在連鎖圖中分布均勻，克服了已發表的連鎖圖標記分布不均勻的缺點。2、標記產率高，平均每個引物組合可產生3.75個多態性條帶，最多可產生13條多態性條帶，比已應用於棉花分子遺傳連鎖圖構建的其它標記的產率都高。3、本發明採用的電泳處理，從而確保結果的準確性、可重複性及高分辨性。具體實施例方式實施例11、以海島棉品系Pima90為父本，陸地棉品系邯208為母本，配製雜交組合，將得到的F2單株作為遺傳連鎖作圖的起始材料，並將所述的材料種植于田間；2、從所述的田間材料中取所述親本和F2單株群體植株的嫩綠葉片提取其總DNA；3、利用SRAP標記構建棉花分子標記連鎖圖，得到一張含237個位點的39個連鎖群，總長3030.7cM，覆蓋整個基因組的65.4％，標記間平均間距12.79cM。這是首張用SRAP構建的棉花分子遺傳連鎖圖譜。具體步驟如下3.1SRAP標記分析SRAP分析PCR引物除Li和Quiros(LiG，QuirosCF.Sequence-relatedamplifiedpolymorphisim(SRAP)，anewmarkersystembasedonasimolePCRreactionitsapplicationtomappingandgenetagginginBrassica.TheorApplGenet，2001，103455～461)論文中發表的引物外，另自行設計引物(見附圖1所示上遊引物編號從me6--m9；下遊引物編號從em7--e17，本發明設計的引物交由上海生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應體系為DNA模板60ng；在所述的涉及的引物中隨機取上、下遊引物各1個，配對使用，每個引物用量為30ng；[用量參照AFLP操作方法(文獻見VosP，HogersR，BleekerM，ReijansM，vandeLeeT，HomesM，FrijtersA，PotJ，PelemanJ，KuiperM，ZabeauM.AFLPanewtechniqueforDNAfingerprinting.NucleicAcidsRes，1995，234407～4414)]。dNTPs為200uM；1×ReactionBuffer；MgCl2為1.5mM；Taq酶1U(購自MBI公司)，總體積為20ul，不足部分用ddH2O補充。DNA擴增程序參照Li和Quiros(LiG，QuirosCF.Sequence-relatedamplifiedpolymorphisim(SRAP)，anewmarkersystembasedonasimolePCRreactionitsapplicationtomappingandgenetagginginBrassica.TheorApplGenet，2001，103455～461)的方法，擴增反應在PTC-100PCR儀上進行。(2)電泳電泳儀為美國生命科學公司的EC-160電泳儀，電泳緩衝液為0.5×TBE。20ul擴增產物中加入10ulLoadingBuffer(98％去離子甲醯胺，10mMEDTA，0.25％溴粉蘭，0.25％二甲苯青)，95℃變性5min，上樣5ul。採用6％PAGE膠(7mol/L尿素)分離，2000伏電壓預電泳至電流為30mA，上樣後用2500伏恆壓電泳1.5～2h，電泳過程中確保膠板溫度不高於50℃。(3)電泳後銀染，銀染方法參考吳冠芸等的方法(吳冠芸，潘華珍，吳羽。生物化學與分子生物學實驗常用數據手冊。北京科學出版社，1999)。3.2數據整理及連鎖分析分子標記的記錄採用Mapmaker軟體記錄方法。對於共顯性標記，用「A」表示邯鄲208親本的純合帶型；用「B」表示Pima90親本的純合帶型；「H」表示兩親本的雜合帶型。對於顯性標記，邯鄲208親本為純合帶型，記為「A」；Pima90親本的純合帶型與雜合帶型記為「C」。Pima90親本的純合帶型記為「B」；邯鄲208親本的純合帶型與雜合帶型記為「D」。缺失數據用「-」表示。採用「引物組合+標記分子量」的方法對標記進行命名，如m1e1-550，「m1e1」表示引物組合me1和em1，「-550」表示該標記的分子量；引物組合後面的「-K」表示該標記的分子量為1000bp。利用MAPMAKER/EXP.3.0作圖軟體，先用Group和Order命令進行標記間連鎖分析(LOD＝3.0，r＝0.4)，對未進入連鎖群的標記用Try命令連到相應連鎖群上，最後用Ripple命令確定最佳排列順序，構建棉花分子標記連鎖圖。利用Kasambi函數將重組率轉換為遺傳圖距(cM)。3.3親本間多態性DNA標記的篩選對兩親本用136個引物組合進行篩選，每個組合可產生50～100個清晰可辨的條帶。選取多態性好的76個引物組合進行群體分析，共得到285條多態性條帶，每組合的多態性條帶數從1～13不等。平均每個引物組合產生3.75個多態性條帶(見附圖2所示)3.4棉花SRAP分子標記連鎖圖的構建對得到的285個多態性標記用MAPMAKER/EXP3.0構建遺傳連鎖圖。237個標記進入39個連鎖群(LOD≥3.0)，48個獨立，總長3030.7cM，覆蓋整個基因組的65.4％(見圖3)。每個連鎖群有2～13個標記，最長的連鎖群為227.4cM，最短的連鎖群為5cM。標記間最大間距為42.8cM，最小間距為0.2cM，標記間平均間距12.79cM。權利要求1.一種評價棉花連鎖遺傳的方法，特別是棉花分子遺傳連鎖作圖的方法，其特徵在於按照下列步驟1)以海島棉品系Pima90為父本，陸地棉品種邯鄲208為母本，配製雜交組合，將得到的F2單株作為遺傳連鎖作圖的起始材料，並將所述的材料種植于田間；2)從所述的田間材料中取所述親本和F2群體植株的嫩綠葉片提取其總DNA；3)應用序列相關擴增多態性(Sequence-relatedamplifiedpolymorphismSRAP)分子標記，聚合酶鏈式反應(PCR)擴增引物檢測所述群體的多態性並進行遺傳作圖，其中所述的引物序列如附圖1所示4)將步驟3)擴增的DNA片段進行聚丙烯醯胺凝膠電泳，該方法包括先用2000伏電壓預電泳至電流為30mA，上樣後用2500伏恆壓再電泳1.5～2h，在電泳過程中控制膠板溫度不高於50℃；5)對步驟4)獲得的凝膠片進行銀染，染色時先染凝膠下部，待顯出帶後再染上部；6)結合凝膠片所顯示的帶型進行遺傳連鎖評價並作圖。2.根據權利要求1所述的評價棉花連鎖遺傳的方法，特別是棉花分子遺傳連鎖傳作圖的方法，其特徵在於所述的PCR反應體系是DNA模板60ng；在所述的涉及的引物中隨機取上、下遊引物各1個，配對使用，每個引物用量為30ng，dNTPs為200uM；1×ReactionBuffer；MgCl2為1.5mM；Taq酶1U，總體積為20ul，不足部分用ddH2O補充。全文摘要本發明公開了一種利用SRAP分子標記進行棉花連鎖遺傳作圖的方法。作圖群體為海島棉與陸地棉雜交產生F文檔編號A01H1/02GK1541514SQ0311901公開日2004年11月3日申請日期2003年4月29日優先權日2003年4月29日發明者張獻龍,林忠旭,聶以春,賀道華申請人:華中農業大學