一種集成溫度控制pcr-ce微流控晶片及其製作方法

2023-05-28 20:00:21

專利名稱：一種集成溫度控制pcr-ce微流控晶片及其製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學應用儀器領域，具體地，涉及一種集成溫度控制PCR-CE微流控晶片及其製作方法。
背景技術：
聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR),或稱無細胞克隆技術(Freebacteria cloning technique),作為分子生物學和基因工程的一項重要技術,其是一種在引物引導下選擇性擴增DNA和RNA片段的方法。具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重複性好、易自動化等突出優點，現階段生物工程採用的PCR擴增儀可對所需要的目的基因片段進行連續多次擴增，並可以複製到幾百萬倍數量級的數目，廣泛應用於以獲得目的基因或基因片段為目的的生命科學，醫學工程，遺傳功臣，疾病診斷等許多領域。DNA片段的兩條鏈的兩端序列分別互補，由高溫熱變性，低溫復性和適溫延伸這三個反應溫度區組成一個周期，循環進行，使得DNA片段得以迅速擴增，並在溫度可以循環控制的前提下，此反應可以充分利用反應底物與原料，得到數目可觀的基因片段。CE毛細管電泳分離技術是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力的新型液相分離技術。帶電粒子在直流電場作用下於一定介質(溶劑)中發生的定向運動，帶電粒子收到外界所加的高壓直流電場作用，同時還會受到溶劑阻力作用，一定時間後，此兩種力會產生平衡，荷質比達到所需要求的粒子就會做勻速運動，得以沿流體通道運動。我們通過調節高電壓與流速之間關係，使得目的基因片段達到此種關係，即可使得其他物質通過高電壓作用分離到通道的管壁上，收集並進入到廢液池中集中處理，而目的基因片段通過CE電泳手段得以分離。經檢索發現，新型設計的一種PCR反應管(專利號CN201990663U)，此專利設計的PCR反應管事通過 PCR熱循環儀對放入其中的PCR管進行反覆的升降溫完成，實現溫度控制的PCR擴增。

發明內容
針對現有技術中的缺陷，本發明的目的是提供一種集成溫度控制PCR-CE微流控晶片及其製作方法，即能夠製作集成PCR反應和CE毛細管電泳為一體的可攜式晶片，方便DNA片段以及目的基因的擴增，具有溫控精確，反應速度快，用量小，集成度高的特點，製作成本相對低廉，並可以得到迅速而可靠的PCR反應數據。根據本發明的一個方面，提供一種集成溫度控制PCR-CE微流控晶片，該晶片採用上下雙層設計，上層為PDMS蓋片，下層為鉬電極基板，上下兩層封裝成整體晶片；整體晶片集成了溫度控制，PCR擴增反應和CE分離三個流程。所述晶片具體包括:注入口，儲液池，混合通道，PCR反應腔，CE分離通道，加熱電極，溫度傳感電極以及CE電極；其中注入口、儲液池、混合通道、PCR反應腔和CE分離通道在PDMS蓋片上實現；加熱電極、溫度傳感電極和CE電極在鉬電極基板上實現；所述混合通道由相通的流體通道、交叉的十字通道、波浪型混合通道三部分組成，所述晶片的外部管道與三個注入口鍵合連接，其中兩個注入口進液後分別與儲液池相接，另一個注入口進入的樣本與所述儲液池儲存的溶液分別經過各自的流體通道流經交叉十字通道時混合在一起，最後經過波浪型混合通道充分混合均勻，混合完成後進入到PCR反應腔，在PCR反應腔的下部為鉬電極基板上的加熱電極與溫度傳感電極，分別對PCR反應進行溫度控制與實時溫度檢測，PCR反應完成後進入CE分離通道，在CE分離通道處有緩衝液儲液池、廢液池和CE儲液池三個液體儲存室，其中在緩衝液儲液池與廢液池的下部為CE電極，該電極與外界高壓電源相連接，在CE分離通道的兩端分別由插入光纖通道的光纖從外界引入激發電源，並將激發的螢光信號引到外界進行螢光檢測；在CE分離通道的盡頭連接CE儲液池，在該儲液池中得到最後的目的產品。所述的混合通道存在一些尺寸縮小的通道部分為毛細管閥，由於製作材料為PDMS是憎水材料，由於毛細現象的存在，縮小通道的尺寸可以起到阻流來控制流體流動方向的作用，兩個儲液池中的液體用注射泵按照相同的速度從兩端泵入交叉通道，由於上部流體通道有毛細管閥阻流，兩相流會相遇後共同流入波浪混合通道混合，波浪型混合通道通過_■次流加強對流，提聞混合效率。所述PCR反應腔，與波浪型混合通道的容積相近或相同，因此可以從中央通道外部通過注射泵緩慢壓入非溶性氣體進入通道，同時因為氣體的壓力作用，可將反應液以一定速度緩慢推入PCR反應腔中，進行DNA擴增。PCR反應腔的菱形-矩形反應腔結構可以保證減緩進樣速度，充分利用腔室，減少內部氣泡的生成。所述與PCR反應腔連接的CE分離通道，CE分離通道的結構同樣為十字結構，十字通道的作用是給方便進樣與分離，樣品交叉部分有岔開，整體形成雙T型結構，在進樣過程中通過加載偏壓，壓縮樣品以減小樣品帶寬寬度，同時在分離過程中，通過對進樣口兩端施加電壓，將進樣口管道內的樣品清空，有效的去除了樣品的拖尾情況，同時清空管道後還能實現多次重複進樣，有效的提高試驗的重複性和分離度。所述光纖通道 ，光纖將會使外部激發光源信號從其中一根光纖引入照射到CE分離通道中激發螢光，另一端對準CE分離通道相同位置的光纖會將激發的螢光傳遞到外部設備進行信號的收集與處理。所述加熱電極、溫度傳感電極和CE電極分布在玻璃基板上，加熱電極為蛇形，集中在PCR反應腔下面分布，中央比兩端稀疏，保證中心溫度不至於過高。在PCR反應腔正中心下方對應位置有溫度傳感電極，用於檢測PCR反應腔中的溫度變化並將信號輸出到外部控制系統進行溫度反饋調節。由於鉬具有溫度隨電阻成線性變化的特點，所以電極採用鉬金屬，濺射圖形化在玻璃基片上。加熱與溫度傳感電極都用電極引腳與外部設備相連。CE分離通道部分需要外接高壓電源進行電泳分離，CE電極直接用導線與外接高壓電源連接即可。根據本發明的另一個方面，提供一種集成溫度控制PCR-CE微流控晶片的製備方法，該方法包括如下步驟:步驟一，上層PDMS蓋片是採用微加工技術在基片上加工出凸起陽膜，然後在模具中使用聚合物材料對微通道圖形進行複製，將複製材料剝離後可以得到具有通道形狀的蓋片；
步驟二，下層的鉬電極基板的加工過程為:首先在清潔的玻璃基底上濺射鉬金屬層，然後在金屬層上甩正膠、光刻、顯影圖形化，在濺射刻蝕機中以等離子體轟擊基片表面，光刻膠未覆蓋住部分的金屬將被刻蝕掉，露出基底玻璃面；最終將光刻膠用丙酮酒精去除光刻膠即可露出圖形化的鉬電極。步驟三，待PDMS蓋片與鉬電極基片製作完成後，在鉬電極基板上甩一層PDMS層，在烘箱裡烘到PDMS成為半固態時取出，然後利用等離子體去膠機對PDMS蓋片和剛剛拿出的鉬電極基板去膠，改變表面的化學特性。步驟四，最後將PDMS蓋片與鉬電極基片封裝起來，這種方法既將兩部分封裝合成為完整的一片晶片，又能保護PDMS通道會因為溫度改變而改變其化學性質。與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果:本發明設計製作的上述溫度控制的PCR-CE微流控晶片微型化，成本低廉，方便，快捷的對相關DNA片段進行合成與分離。同時在此設計與製作過程中利用了很多前沿的MEMS工藝，並可以對以後的晶片改進和製作過程的創新提供了很大的空間。


通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特徵、目的和優點將會變得更明顯:圖1為本發明的設計PCR-CE微流控晶片的分解圖。圖2為本發明的PCR-CE微流控晶片的俯視圖。圖3為PCR反應腔部分示意圖。圖4為PDMS蓋片的混合通道示意圖。圖5為CE檢測部分通道示意圖。圖6為微流控晶片的基板整體電極分布圖。圖中:注入口 1，儲液池2，毛細管閥3，十字通道4，波浪型混合通道5，PCR反應腔6，CE儲液池7，緩衝液儲液池8，廢液池9，光纖通道10，CE分離通道11，CE電極12，加熱電極13，溫度傳感電極14。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助於本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬於本發明的保護範圍。如圖1所示， 本實施例提供一種集成溫度控制PCR-CE微流控晶片，該晶片採用雙層設計，上層為以PDMS材料製作的PCR與CE反應通道，下層為採用微加工工藝得到的鉬電極基板，從而檢測與控制PCR反應所需的溫度，並進行循環控制，上下兩層採用PDMS半固化和等離子體去膠封裝而成，整體晶片集成了溫度控制，PCR擴增反應和CE分離三個流程。如圖2所示，本實施例所述晶片包括:注入口 I，儲液池2，混合通道，PCR反應腔6，CE分離通道11，加熱電極13，溫度傳感電極14，CE電極12。其中注入口 1，儲液池2，混合通道，PCR反應腔，CE分離通道在PDMS蓋片上實現，加熱電極，溫度傳感電極，CE電極在鉬電極基板上實現。本實施例中,所述晶片製作成型為54_X25.4mm的矩形構造,外部直徑為1_的塑膠管道與3個注入口 I鍵合連接，左右兩個注入口 I進液後各自與直徑為3mm的儲液池2相接，保證PCR反應的進液量與反應所需底物和樣本量，之後由流體通道、交叉的十字通道4、波浪型混合通道5三部分組成的混合通道將兩個儲液池2所儲存的溶液與樣本(通過中間的注入口 I注入)均勻混在一起，混合完成後即進入到PCR反應腔6，PCR的反應腔為一個菱形-矩形的結構，在PCR反應腔6的下部為鉬電極基板上的加熱電極與溫度傳感電極，分別對PCR反應進行溫度控制與實時溫度檢測，既可以完成PCR反應的三個階段的連續循環控制，PCR反應完成後，進入CE分離通道11，在CE分離通道11處有緩衝液儲液池、廢液池和CE儲液池7三個液體儲存室，其中在緩衝液儲液池與廢液池的下部為CE電極12，與外界高壓電源相連接，提供CE毛細管電泳分離所需電壓信號，並在後面的寬度為IOOum的CE分離通道中進行合成DNA與廢液的分離，在CE分離通道11的兩端分別由插入光纖通道的光纖從外界引入激發電源，並將激發的螢光信號引到外界進行螢光檢測。在CE分離通道11的盡頭連接CE儲液池7，在該儲液池中可得到最後的DNA合成的目的基因。如圖4所示，本實施例中，所述的混合通道存在一些50um的通道部分為毛細管閥3，由於製作材料為PDMS是憎水材料，由於毛細現象的存在，縮小通道的尺寸可以起到阻流來控制流體流動方向的作用，與注入口 I連接的兩個儲液池中的液體用注射泵按照相同的速度從兩端泵入交叉通道，由於流體通道有毛細管閥3阻流，兩相流會相遇後共同流入波浪混合通道5混合，波浪型混合通道5通過二次流加強對流，提高混合效率。如圖3所示，本實施例中，所述PCR反應腔6室，整體容積為10.4ul，與波浪型混合通道5的容積相近，因此可以從中央通道外部通過注射泵緩慢壓入非溶性氣體進入通道，同時因為氣體的壓力作用，可將反應液以一定速度緩慢推入PCR反應腔6中，進行DNA擴增。PCR反應腔6腔室的菱形-矩形反應腔結構可以保證減緩進樣速度，充分利用腔室，減少內部氣泡的生成。

如圖5所示，本實施例中，所述CE分離通道11為十字結構，十字通道的作用是給方便進樣與分離，樣品交叉部分有300um的岔開，整體形成雙T型結構，在進樣過程中通過加載偏壓，壓縮樣品以減小樣品帶寬寬度，同時在分離過程中，通過對CE分離通道11進樣口兩端施加電壓，將CE分離通道11進樣口管道內的樣品清空，有效的去除了樣品的拖尾情況，同時清空管道後還能實現多次重複進樣，有效的提高試驗的重複性和分離度。本實施例中，所述光纖通道距離CE分離通道11約400um，CE分離通道11長度為22mm，光纖將會使外部激發光源信號從其中一根光纖引入照射到CE分離通道11中激發螢光，另一端對準CE分離通道11相同位置的光纖會將激發的螢光傳遞到外部設備進行信號的收集與處理。如圖6所示，本實施例中，所述CE電極12，加熱電極13，溫度傳感電極14分布在玻璃基板上，加熱電極13為蛇形，集中在PCR反應腔6下面分布，中央比兩端稀疏，保證中心溫度不至於過高。在PCR反應腔6正中心下方對應位置有溫度傳感電極14，用於檢測PCR反應腔6中的溫度變化並將信號輸出到外部控制系統進行溫度反饋調節。由於鉬具有溫度隨電阻成線性變化的特點，所以CE電極12，加熱電極13，溫度傳感電極14採用鉬金屬，濺射圖形化在玻璃基片上。加熱電極13、溫度傳感電極14都用電極引腳與外部設備相連。CE分離通道11部分需要外接高壓電源進行電泳分離，CE電極12直接用導線與外接高壓電源連接即可。其中加熱電極13電阻為120歐左右，檢測電阻為60歐左右。本實施上述的晶片，上層PDMS蓋片是採用微加工技術在基片上加工出凸起陽膜，然後在模具中使用聚合物材料對微通道圖形進行複製，將複製材料剝離後可以得到具有通道形狀的蓋片。下層的鉬電極基板的加工過程為首先在清潔的玻璃基底上濺射鉬金屬層，然後在金屬層上甩正膠、光刻、顯影圖形化，在濺射刻蝕機中以等離子體轟擊基片表面，光刻膠未覆蓋住部分的金屬將被刻蝕掉，露出基底玻璃面。最終將光刻膠用丙酮酒精去除光刻膠即可露出圖形化的鉬電極。待PDMS蓋片與鉬電極基片製作完成後，在鉬電極基板上甩一層很薄(約0.1mm厚)的PDMS層，在烘箱裡烘到PDMS成為半固態時取出，然後利用等離子體去膠機對PDMS蓋片和剛剛拿出的鉬電極基板去膠，改變表面的化學特性，最後將PDMS蓋片與鉬電極基片封裝起來，這種方法既將兩部分封裝合成為完整的一片晶片，又能保護PDMS通道會因為溫度改變而改變其化學性質。本實施例PCR-CE晶片的原理是從起始的液體混或到最終的分離檢測都能在同一塊晶片中進行。將待擴增檢測的PCR樣本從注入口 I注入，並進入到相應的儲液池中，另外一個儲液池中注入引物、酶、Mg2+、dNTP緩衝液，螢光標定劑等PCR與CE檢測所需的底物與溶液。最後一個注入口則通過注射泵通入外界氣體，保持和控制內部反應壓強。兩個儲液池的液體通過混合通道進行均勻融合，並利用毛細管閥3起到控制液體流動速度，阻礙其迅速流動而不能混合均勻的目的，只有當外界泵體給予的液壓增大到一定程度才能導通。當兩個液體流在十字通道4混合均勻後，關閉儲液池對應的泵體，打開流體通道的注入口，利用注射泵泵入無菌空氣，空氣將在十字通道混合的反應液全部壓入PCR反應腔6。由於設計的PCR反應腔6和混合通道體積基本一致或相同，則充分混合的反應液可一次性全部進入PCR反應腔6。使用加熱電極13與溫度傳感電極14進行PCR循環擴增，加熱電極13採用外部控制電路控制，在高溫熱變性(90° C左右)，低溫復性(60° C左右)和適溫延伸(72° C左右)三個溫度段循環，大約30個周期即可完成PCR擴增，繼續用延伸通道注入CE儲液池7，並充滿CE儲液池與廢液池9之間的十字CE分離通道11，在CE電極12上外接高壓電源，進行CE電泳分離，這樣最終的產物通過十字CE分離通道11，而廢液被分離到廢液池中。在CE分離通道11的兩端插入光纖進入光纖通道10，光纖從外界引入激發光源並將雷射的螢光信號引入到外部進行螢光檢測，進而得到分離與DNA純度數據。這樣此晶片便可以實現樣本混合，PCR擴增反應，CE分 離並檢測等一體的功能。以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明並不局限於上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的範圍內做出各種變形或修改，這並不影響本發明的實質內容。
權利要求
1.一種集成溫度控制PCR-CE微流控晶片，其特徵在於，該晶片採用上下雙層設計，上層為PDMS蓋片，下層為鉬電極基板，上下兩層封裝成整體晶片； 所述晶片具體包括:注入口，儲液池，混合通道，PCR反應腔，CE分離通道，加熱電極，溫度傳感電極以及CE電極；其中注入口、儲液池、混合通道、PCR反應腔和CE分離通道在上層PDMS蓋片上實現；加熱電極、溫度傳感電極和CE電極在下層鉬電極基板上實現；所述混合通道由相通的流體通道、交叉的十字通道、波浪型混合通道三部分組成，所述晶片的外部管道與三個注入口鍵合連接，其中兩個注入口進液後分別與儲液池相接，另一個注入口的樣本與所述儲液池儲存的溶液分別經過各自的流體通道流經交叉十字通道時混合在一起，最後經過波浪型混合通道充分混合均勻，混合完成後進入到PCR反應腔；在PCR反應腔的下部為鉬電極基板上的加熱電極與溫度傳感電極，分別對PCR反應進行溫度控制與實時溫度檢測，PCR反應完成後進入CE分離通道，在CE分離通道處有緩衝液儲液池、廢液池和CE儲液池三個液體儲存室，其中在緩衝液儲液池與廢液池的下部為CE電極，該電極與外界高壓電源相連接，在CE分離通道的兩端分別由插入光纖通道的光纖從外界引入激發電源，並將激發的螢光信號引到外界進行螢光檢測；在CE分離通道的盡頭連接CE儲液池，在該儲液池中得到最後的目的產品。
2.根據權利要求1所述的集成溫度控制PCR-CE微流控晶片，其特徵在於，所述的混合通道中的流體通道存在毛細管閥，與注入口相連的所述儲液池中的液體用注射泵按照相同的速度從兩端泵入交叉的十字通道，所述混合通道中的流體通道有毛細管閥阻流，兩相流會相遇後共同流入波浪型混合通道混合，波浪型混合通道通過二次流加強對流，提高混合效率。
3.根據權利要求1所述的集成溫度控制PCR-CE微流控晶片，其特徵在於，所述PCR反應腔是菱形-矩形反應腔結構，該PCR反應腔與所述波浪型混合通道的容積相同。
4.根據權利要求1所述的集成溫度控制PCR-CE微流控晶片，其特徵在於，所述CE分離通道為方便進樣與分離的十字結構，樣品交叉部分有岔開，整體形成雙T型結構，在進樣過程中通過加 載偏壓，壓縮樣品以減小樣品帶寬寬度，同時在分離過程中，通過對該通道進樣口兩端施加電壓，將該通道進樣口管道內的樣品清空。
5.根據權利要求1所述的集成溫度控制PCR-CE微流控晶片，其特徵在於，所述光纖通道，其中光纖將會使外部激發光源信號從其中一根光纖引入照射到CE分離通道中激發螢光，另一端對準CE分離通道相同位置的光纖會將激發的螢光傳遞到外部設備進行信號的收集與處理。
6.根據權利要求1所述的集成溫度控制PCR-CE微流控晶片，其特徵在於，所述加熱電極，溫度傳感電極以及CE電極分布在鉬電極基板上，加熱電極為蛇形，集中在PCR反應腔下面分布，中央比兩端稀疏；在PCR反應腔正中心下方對應位置有溫度傳感電極，用於檢測PCR反應腔中的溫度變化並將信號輸出到外部控制系統進行溫度反饋調節；加熱電極與溫度傳感電極都用電極引腳與外部設備相連。
7.—種權利要求1所述的集成溫度控制PCR-CE微流控晶片的製備方法，其特徵在於，該方法包括如下步驟: 步驟一，上層PDMS蓋片是採用微加工技術在基片上加工出凸起陽膜，然後在模具中使用聚合物材料對微通道圖形進行複製，將複製材料剝離後可以得到具有通道形狀的蓋片；步驟二，下層的鉬電極基板的加工過程為:首先在清潔的玻璃基底上濺射鉬金屬層，然後在金屬層上甩正膠、光刻、顯影圖形化，在濺射刻蝕機中以等離子體轟擊基片表面，光刻膠未覆蓋住部分的金屬將被刻蝕掉，露出基底玻璃面；最終將光刻膠用丙酮酒精去除光刻膠即可露出圖形化的鉬電極； 步驟三，待PDMS蓋片與鉬電極基片製作完成後，在鉬電極基板上甩一層PDMS層，在烘箱裡烘到PDMS成為半固態時取出，然後利用等離子體去膠機對PDMS蓋片和剛剛拿出的鉬電極基板去膠，改變表面的化學特性； 步驟四，最後將PDMS蓋 片與鉬電極基片封裝起來。
全文摘要
本發明提供了一種集成溫度控制PCR-CE微流控晶片及其製備方法，該晶片採用雙層設計，上層為以PDMS材料製作的PCR與CE反應通道，下層為採用微加工工藝得到的鉑電極基板，從而檢測與控制PCR反應所需的溫度，並進行循環控制，上下兩層採用PDMS半固化和等離子體去膠封裝而成，整體晶片集成了溫度控制，PCR擴增反應和CE分離三個流程。本發明能夠製作集成PCR反應和CE毛細管電泳為一體的可攜式晶片，方便DNA片段以及目的基因的擴增，具有溫控精確，反應速度快，用量小，集成度高的特點，製作成本相對低廉，並可以得到迅速而可靠的PCR反應數據。
文檔編號C12M1/36GK103103120SQ20131002028
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月18日 優先權日2013年1月18日
發明者張衛平, 姜川, 駱健, 陳文元, 吳校生, 崔峰, 劉武 申請人:上海交通大學