聚苯胺-多酚氧化酶傳感器的製備方法
2023-05-28 19:55:51
專利名稱：聚苯胺-多酚氧化酶傳感器的製備方法
技術領域：
本發明涉及生物傳感器技術領域，特別是製備聚苯胺-多酚氧化酶生物傳感器的
工藝技術領域。
背景技術：
酚類化合物對人類及動、植物存在危害並導致了嚴重的環境問題。因此，對酚類化 合物的監控成為重要的研究課題。多酚氧化酶生物傳感器因其高靈敏度、快速響應、操作簡 單及易於小型化等優點被廣泛地用於酚類化合物的檢測。酶的固定是構築生物傳感器的關 鍵步驟，而固定酶的材料和方法對傳感器的性能有重要影響。目前有許多材料如磁性納米 粒子、溶膠-凝膠，自組裝單層膜，粘土等用於多酚氧化酶的固定。然而，有些材料製備複雜 或耗時，有些生物兼容性差或對酶的負載量低，使這些材料的應用受到了限制。因此，探索 新材料和/或新方法實現多酚氧化酶的有效固定具有重要的理論及實踐意義。
自二十世紀八十年代以來，用導電高聚物固定酶製備生物傳感器引起了研究者的 廣泛關注。聚苯胺由於其單體原料(苯胺)價格低、合成簡單、導電率高、環境穩定性好、耐 高溫及抗氧化性好及氧化還原可逆性等優點，廣泛應用於抗靜電及電磁屏蔽材料、二次電 池、防腐蝕材料、超級電容器、選擇性透過膜及生物傳感器等方面。基於聚苯胺具有良好的 生物兼容性、導電性、摻雜和去摻雜特性、以及能被許多基團修飾等特點，使之成為固定酶 的優選材料。然而，在PH > 4的溶液中合成的聚苯胺會失去電化學活性和導電性，這不利 於生物傳感器的電子傳遞反應。 目前用導電聚苯胺固定酶構築生物傳感器的常用的方法可分為四類，"一步法"、 "兩步法"、"模板法"和"交聯法"，四種方法都具有各自的優、缺點。早期的"一步法"大多在 中性介質中進行，在此條件下合成的聚苯胺膜結構緊密、導電性差、酶的負載量低、以及電 荷傳遞效率低，因此"一步法"在一段時間內受到冷落。然而，與其他三種方法相比，"一步 法"具有突出的優勢，如方法簡便，製做成本低、易於批量生產等。因此，只要克服了以上不 足之處，"一步法"將是一種有前途的固定酶的方法。
發明內容
本發明的目的在於提供一種能既簡便又經濟地製備新型的聚苯胺_多酚氧化酶 傳感器的方法。
本發明的技術方案是採用直接電化學聚合法製備聚苯胺_多酚氧化酶傳感器。
也即在含有離子液體及表面活性劑的苯胺溶液中固定多酚氧化酶，構成聚苯 胺-多酚氧化酶傳感器；所述離子液體為硫酸乙酯-l-甲基_3-乙基咪唑離子液體；所述表 面活性劑為十二烷基硫酸鈉。 通過試驗表明，在離子液體中合成的聚苯胺-多酚氧化酶傳感器在pH高達12的 條件下仍保持良好的電化學活性和導電性，這對生物傳感器的電子傳遞反應是十分有益 的。
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本發明以"一步法"，即將酶、單體及支持電解液混合，在電極上電解生成導電 高聚物膜的同時，實現酶的固定。本發明合成的聚苯胺-多酚氧化酶傳感器具有良好的 生物兼容性，合適的孔結構等優點，能實現多酚氧化酶的有效固定。因此，本發明製備的 聚苯胺_多酚氧化酶傳感器優點在於高PH下仍具有良好的電化學活性，對底物響應快 (< 20s)，靈敏度高，較寬的線性範圍，重複性、穩定性好。該傳感器能對酚類化合物進行監 本發明所述電解液的組成包括0. 1-0. 5mol dm—3苯胺、體積百分比為5_50%的硫 酸乙酯-1-甲基_3-乙基咪唑離子液體、0. 1-1. Og dm—3多酚氧化酶、0. 1-3. Omol dm—3鹽酸 及0. 1-5. Og dm—3十二烷基硫酸鈉。 採用以上組分製作的聚苯胺_多酚氧化酶傳感器能有效地克服不含離子液體和 十二烷基硫酸鈉的同樣條件下製作的聚苯胺_多酚氧化酶傳感器電化學活性差、電荷傳遞 慢，以及因孔隙率不合適而引起酶的負載量低等不足。對提高酶傳感器的電流響應、縮短酶 傳感器的響應時間和延長酶傳感器的壽命是非常有益的。
圖1為響應電流與電勢的關係圖。 圖2為響應電流與鄰苯二酚濃度的關係圖。 圖3為響應電流與pH的關係圖。 圖4為響應電流與溫度關係圖。 圖5為傳感器的長期穩定性試驗圖。
具體實施例方式
—、製備過程 1、原料苯胺(經減壓蒸餾至無色後保存在4t:冰箱中備用)。 來自蘑菇中的多酚氧化酶。 硫酸乙酯-1-甲基-3-乙基咪唑離子液體(根據文獻J. D. Holbrey， W. M. Reichert， R. P. Swatlosk， G. A. Broker, W. R. Pitner， K. R. Seddon， R. D. Rogers, Green Chem. ，4(2002)407的方法製備)。 其餘原料均為分析級。 溶液均用二次蒸餾水配製。 2、電解液組成 苯胺佔電解液總量的0. 1-0. 5mol dm—3。 硫酸乙酯-1-甲基-3-乙基咪唑離子液體佔電解液總體積百分比為5-50% 。 多酚氧化酶佔電解液總量的0. 1-1. 0g dm—3。 鹽酸佔電解液總量的0. 1-3. Omol dm一3。 十二烷基硫酸鈉佔電解液總量的0. 1-5. 0g dm—3。 3、電解池組成 電解池採用三電極體系，由兩鉑片和一飽和甘汞電極(SCE)構成。鉑電極使用前用鉻酸、酒精及八1203處理。
4、傳感器製備過程 將電解液加入電解池中，電勢控制在O. 5-1. 2V，恆電位合成2 15分鐘，電極表面
形成均勻緻密的薄膜，從而製備多酚氧化酶傳感器。傳感器取出後用二次水徹底衝洗。
5、保存傳感器不使用時放入4t:冰箱中乾燥保存。 二、試驗包括電位、底物(鄰苯二酚)濃度、pH值、溫度對傳感器響應電流的影響 及傳感器的穩定性測定。
1、電勢對聚苯胺_多酚氧化酶傳感器響應電流的影響 試驗溫度條件為25. (TC ，在含40 ii mol dm—3鄰苯二酚的B-R緩衝溶液(pH = 6. 5) 中，多酚氧化酶生物傳感器的響應電流與電勢的關係示於圖1。 從圖1 中可見電位在175至-25mV範圍內，響應電流隨電勢的降低逐漸增大，這
是由於隨電勢的降低醌的還原反應變快的緣故。 2、底物(鄰苯二酚)濃度對響應電流的影響 圖2為在B-R緩衝溶液(pH = 6. 5)中，多酚氧化酶傳感器響應電流與鄰苯二酚濃 度之間的關係。 試驗溫度條件為25. (TC， pH = 6. 5， E = 50mV(vs. SCE)。 從圖2可見，在濃度低於150 ii mol dm—3時響應電流隨鄰苯二酚濃度線性增大(如 插圖所示)，表明酶催化反應為一級反應。隨著鄰苯二酚濃度的繼續增大，響應電流增加緩 慢，最後酶催化反應由一級反應轉化為零級反應。根據綜合汙水排放標準(GB8978-1996)， 鄰苯二酚濃度應為2. 75-9. 17 ii moldm—3。故該傳感器能滿足實際應用的需要。
3、pH值對響應電流的影響i式驗條件:鄰苯二酚濃度為40 ii mol dm—3， E = 50mV(vs. SCE) ， 25. 0°C 。
圖3為在含40 ii mol dm—3鄰苯二酚的B_R緩衝液中，響應電流與pH之間的關係。
由圖3可見隨pH值的增大，傳感器的響應電流先增大後減小。pH二6.5時響應 電流達到最大值。說明固定的多酚氧化酶最適pH是6. 5，這與蘑菇中的自由多酚氧化酶最 適pH 6. 2接近。 4、溫度對響應電流的影響試驗條件:鄰苯二酚濃度為40 ii mol dm—3， pH = 6. 5， E = 50mV(vs. SCE) 圖4為在含40iimo1 dm—3鄰苯二酚的B-R緩衝液中，響應電流與溫度的關係。如
圖4所示，傳感器的響應電流隨溫度升高而增加，溫度繼續升高，響應電流減小。最大響應
電流出現在4(TC，這是固定化的多酚氧化酶的最適溫度。 5、聚苯胺-多酚氧化酶傳感器的穩定性試驗條件:鄰苯二酚濃度為40 ii mol dm—3， pH = 6. 5， E = 50mV(vs. SCE)
如圖5所示，通過測量傳感器對40 ii mol dm—3鄰苯二酚的響應電流檢測了它的長 期穩定性。120天後，傳感器的響應電流保持了初始電流的75%，直到現在它仍然保持了好 的活性。因此，該聚苯胺_多酚氧化酶傳感器具有較高穩定性。 綜上所述，本發明在含離子液體(硫酸乙酯-l-甲基_3-乙基咪唑離子液體)及 表面活性劑(十二烷基硫酸鈉)的苯胺溶液中用直接電化學的方法固定多酚氧化酶成功製備了聚苯胺-多酚氧化酶生物傳感器。該傳感器對底物(鄰苯二酚)進行檢測，具有響應 快、靈敏度高、線性範圍寬、重複性和長期穩定性好的特點，具有實際應用價值。
權利要求
聚苯胺-多酚氧化酶傳感器的製備方法，其特徵在於採用直接電化學聚合法製備聚苯胺-多酚氧化酶傳感器。
2. 根據權利要求1所述聚苯胺_多酚氧化酶傳感器的製備方法，其特徵在於在含有離 子液體及表面活性劑的苯胺溶液中固定多酚氧化酶，構成聚苯胺_多酚氧化酶傳感器；所 述離子液體為硫酸乙酯-1-甲基_3-乙基咪唑離子液體；所述表面活性劑為十二烷基硫酸 鈉。
3. 根據權利要求2所述聚苯胺_多酚氧化酶傳感器的製備方法，其特徵在於所述電解 液包括0. 1-0. 5mol dm—3苯胺、體積百分比為5_50%的硫酸乙酯-1-甲基-3-乙基咪唑離 子液體、0. 1-1. Og dm—3多酚氧化酶、0. 1-3. Omol dm—3鹽酸及0. 1-5. Og dm—3十二烷基硫酸 鈉。
全文摘要
聚苯胺-多酚氧化酶傳感器的製備方法，本發明涉及生物傳感器技術領域，採用直接電化學聚合法製備聚苯胺-多酚氧化酶傳感器。即在含有離子液體及表面活性劑的苯胺溶液中固定多酚氧化酶，構成聚苯胺-多酚氧化酶傳感器。本發明以「一步法」，即將酶、單體及支持電解液混合，在電極上電解生成導電高聚物膜的同時，實現酶的固定。具有良好的生物兼容性，合適的孔結構等優點，能實現多酚氧化酶的有效固定。因此，本發明製備的聚苯胺-多酚氧化酶傳感器優點在於高pH下仍具有良好的電化學活性，對底物響應快，靈敏度高，較寬的線性範圍，重複性、穩定性好。該傳感器能對酚類化合物進行監測。
文檔編號G01N27/403GK101738424SQ20091023488
公開日2010年6月16日 申請日期2009年10月26日 優先權日2009年10月26日
發明者譚永豔, 闞錦晴 申請人:揚州大學