流感病毒疫苗抗原製備方法的改進的製作方法

2023-05-29 02:43:36 2

專利名稱：流感病毒疫苗抗原製備方法的改進的製作方法
技術領域：
本發明涉及流感疫苗製備領域。
背景技術：
參考文獻1的第17和18章描述了目前常規使用的流感疫苗。它們基於活病毒或 滅活病毒，滅活疫苗可以基於完整病毒、『裂解'病毒或純化的表面抗原(包括血凝素以 及也是通常使用的神經氨酸酶)。已知有許多不同的製備裂解抗原疫苗和表面抗原疫苗的方法。例如，各種裂解過 程如參考文獻2-8所述，而製備表面抗原疫苗的不同方法披露於參考文獻9-14。本發明的目的是提供製造裂解疫苗和表面抗原疫苗的改良方法。

發明內容
發明人曾經對現有的從裂解的流感病毒製備疫苗抗原的方法設計了許多改進。去汙劑使用時間的改進在現有純化方法中，流感病毒顆粒先接觸第一去汙劑(例如聚山梨酸酯，如聚山 梨酸酯80)，然後用第二去汙劑(例如CTAB)裂解。第一去汙劑在病毒滅活之前使用，而第 二去汙劑在滅活之後加入。在上述方法中，第二去汙劑隨後除去，而第一去汙劑仍舊保留， 從而有助於抗原溶解。相反，根據本發明的第一個方面，第一去汙劑較晚使用，具體地說是在已經用第二 去汙劑裂解病毒顆粒之後。這種時間和順序的變化使得抗原產量提高了 20倍以上，尤其是 對於H5亞型的甲型流感病毒。因此，本發明提供了一種分裂流感病毒顆粒的方法，所述方法包括以下步驟(i) 在不存在去汙劑時獲得包含流感病毒顆粒的組合物；(ii)在不存在去汙劑時滅活所述流 感病毒顆粒；(iii)用包含第一去汙劑的試劑裂解滅活的病毒顆粒；和(iv)用第二去汙劑 交換第一去汙劑。所述去汙劑交換步驟可在裂解步驟之後的任何時刻進行，但在病毒顆粒 捕獲步驟之前進行較為理想，所述捕獲步驟可通過以下方法進行，例如，親和捕獲、偽親和 捕獲、層析或吸附(見下文)。因此，第二去汙劑可在裂解之後但在病毒顆粒捕獲之前加入。 可在病毒顆粒捕獲之後再加入額外量的第二去汙劑，尤其是如果之前加入的第二去汙劑的 量小於1.5g/L時。通過這種方法獲得的分裂的病毒顆粒可用於製備流感疫苗。本發明還提供了一種分裂流感病毒顆粒的方法，改進之處在於在不存在去汙劑 時滅活流感病毒顆粒；用包含第一去汙劑的試劑裂解滅活的病毒顆粒；以及在裂解後用第 二去汙劑交換第一去汙劑。
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在第一方面的其它實施方式中，所述第二去汙劑是在滅活之後但在裂解之前加入 的。因此，本發明提供了一種分裂流感病毒顆粒的方法，所述方法包括以下步驟(i)在不 存在去汙劑時獲得包含流感病毒顆粒的組合物；(ii)在不存在去汙劑時滅活所述流感病 毒顆粒；(iii)加入第二去汙劑但不裂解滅活的病毒顆粒；(iv)在存在第二去汙劑時用包 含第一去汙劑的試劑裂解滅活的病毒顆粒；和(ν)除去第一去汙劑同時保留第二去汙劑。通過這種方法獲得的分裂的病毒顆粒可用於製備流感疫苗。本發明還提供了一種分裂流感病毒顆粒的方法，改進之處在於在不存在去汙劑 時滅活所述流感病毒顆粒；在存在第二去汙劑時用包含第一去汙劑的試劑裂解滅活的病毒 顆粒；以及在裂解之後除去第一去汙劑同時保留第二去汙劑。在改進去汙劑使用時間的還有其它實施方式中，去汙劑是在病毒顆粒滅活之前、 但在對病毒顆粒進行超濾/滲濾步驟之後加入的。因此，本發明提供了一種分裂流感病毒 顆粒的方法，所述方法包括以下步驟(i)在不存在去汙劑時獲得包含流感病毒顆粒的組 合物；( )對含有病毒顆粒的組合物進行超濾/滲濾；(iii)在濾過的含有病毒顆粒的組 合物中加入去汙劑但不裂解病毒顆粒；和(iv)滅活流感病毒顆粒。該方法還可包括步驟 (ν)用去汙劑裂解滅活的病毒顆粒。步驟(ν)中使用的去汙劑可以不同於步驟(iii)中使 用的去汙劑。可在步驟(ν)之後加入額外量的與步驟(iii)中所用相同的去汙劑，尤其是 如果步驟(iii)中去汙劑的加入量小於1. 5g/L時。在之前去汙劑的加入量小於1. 5g/L時再加入額外量的去汙劑的實施方式中，額 外的加入可在進一步超濾/滲濾步驟之前進行。裂解過程的改進流感疫苗的裂解過程涉及用增溶濃度的去汙劑處理病毒顆粒。合適的去汙劑包括 聚山梨酸酯類(吐溫類)[6]、曲通X-100[6，10，15]、溴化十六烷基三甲基銨(CTAB) [9，16] 和脫氧膽酸鹽[2，17]。在現有純化過程中，在存在20mM Tris/HCl時接觸去汙劑而裂解流感病毒顆粒。相 反，根據本發明的第二個方面，在存在具有較高離子強度緩衝液時使用去汙劑。因此，本發 明提供了一種分裂流感病毒顆粒的方法，所述方法包括以下步驟(i)獲得包含流感病毒 顆粒的組合物；(ii)通過接觸用離子強度為IOOmM或更高的緩衝液劑配製的去汙劑來裂解 所述病毒顆粒。這種升高的離子強度使得抗原產量提高了 20倍以上，尤其是對於H5亞型 的甲型流感病毒。通過這種方法獲得的分裂的病毒顆粒可用於製備流感疫苗。有用的緩衝液的離子強度至少為100mM,例如≥200mM、≥300mM、≥400mM、 ≥500mM、≥600mM、≥700mM、≥800mM,等等。可通過各種途徑獲得這種較高的離子強度， 例如使用單價離子(如NaCl)、二價離子(如硫酸鹽)、三價離子(如磷酸鹽)，等等。使用 三價離子是提高離子強度的便捷方法。一種適用的緩衝液，尤其是當用於基於CTAB的裂解 過程時，是用50mM磷酸鹽緩衝液，pH 7.5配製的200福NaCl。在裂解過程中升高離子強度 時需要小心，尤其對於細胞培養物中生長的病毒，以免造成在隨後的處理步驟中需要保留 的DNA大量溶解。本發明還提供了一種分裂流感病毒顆粒的方法，改進之處在於用離子強度為 100mM或更高的緩衝液劑配製的去汙劑來裂解病毒顆粒。
磷酸鹽緩衝液在現有純化過程中，在用Tris緩衝液裂解之前、之間和之後保持流感病毒顆粒。 相反，根據本發明的第三個方面，在用磷酸鹽緩衝液裂解之前、之間和之後保持流感病毒顆 粒。這種緩衝液變化使得抗原產量提高了 20倍以上，尤其是對於H5亞型的甲型流感病毒。因此，本發明提供了一種分裂流感病毒顆粒的方法，所述方法包括以下步驟(i) 在存在磷酸鹽緩衝液時獲得包含流感病毒顆粒的組合物；(ii)在存在磷酸鹽緩衝液時滅 活所述流感病毒顆粒；和(iii)在存在磷酸鹽緩衝液時裂解所述滅活的流感病毒顆粒。通過這種方法獲得的分裂的病毒顆粒可用於製備流感疫苗。有用的磷酸鹽緩衝液 的PH值在6. 5和8. 5之間，例如在7. 0和8. 0之間，或者約7. 5。本發明還提供了一種分裂流感病毒顆粒的方法，改進之處在於滅活和隨後的裂 解病毒顆粒都在存在磷酸鹽緩衝液時進行。超濾膜在現有純化工藝中，半純化的裂解後流感病毒表面抗原用聚苯醚碸(PES)膜超濾 /滲濾進一步純化。相反，根據本發明的第四個方面，超濾採用的是纖維素膜。這種膜的變 化降低了疏水性和蛋白質保留，使得抗原產量提高了 20倍以上，尤其是對於H5亞型的甲型 流感病毒。因此，本發明提供了一種從包含流感病毒表面糖蛋白的混合物中純化所述糖蛋白 的方法，包括用纖維素膜超濾所述混合物的步驟。通過這種方法獲得的純化糖蛋白可用於 製備流感疫苗。本發明還提供了一種通過超濾從包含流感病毒表面糖蛋白的混合物中純化所述 糖蛋白的方法，改進之處包括採用纖維素超濾膜。可使用各種類型的纖維素膜。這些膜可基於纖維素本身、纖維素酯(例如二乙酸 酯、三乙酸酯、硝酸酯，等等)或其混合物。例如，參考文獻18披露了具有非纖維性聚合微孔 基底的膜，膜層由纖維素和/或乙酸纖維素形成。所述膜層的厚度在1-20微米之間，並且 可以延伸入微孔基底5-30微米。參考文獻19披露了基於三乙酸纖維素的不對稱超濾膜， 該膜任選被至多達30%的二乙酸纖維素取代。參考文獻20披露了形式為中空纖維的滲濾 膜，其具有乙酸纖維素或乙酸纖維素衍生物構成的連續內腔。在第一層析步驟之前加入額外處理步驟在現有純化工藝中，為從細胞培養物發酵培養基組分中分離流感病毒顆粒，流感 病毒顆粒是從樹脂上的培養收穫物中捕獲的。已經觀察到某些毒株不能完全結合於樹脂。根據本發明的第四個方面，在捕獲步驟之前將病毒收穫物進行超濾/滲濾到低電 導率緩衝液中。根據流感病毒毒株不同，該初始步驟可使抗原產量提高至多達10倍，且對 於不結合於捕獲劑的病毒顆粒尤其有用。因此，本發明提供了一種處理含有流感病毒顆粒的液體培養基的方法，包括超濾 所述液體培養基的步驟以提供包含低電導率緩衝液的含病毒顆粒滲餘物。然後進一步處理 該滲餘物，例如通過親和捕獲、吸附、層析等等。本發明還提供了一種從含有流感病毒顆粒的液體培養基中分離流感病毒顆粒的 方法，改進之處在於在分離之前對所述液體培養基進行滲濾以提供包含低電導率緩衝液的 含病毒顆粒滲餘物。
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本發明還提供了一種從含有病毒顆粒的液體培養基中分離流感病毒顆粒的方法， 所述方法包括以下步驟(i)滲濾該液體培養基以提供包含低電導率緩衝液的含病毒顆粒 滲餘物；和然後(ii)通過選自親和捕獲、偽親和捕獲、層析或吸附的方法從滲餘物中捕獲 病毒顆粒。通過這些方法獲得的滲餘物和病毒顆粒可用於製備流感疫苗。滲濾利用透性膜濾器根據溶液和懸浮液組分的分子大小將它們分離。小組分可通 過膜形成濾液，而較大的組分(如病毒顆粒)則無法通過而被保留。可利用滲濾來降低鹽、 溶劑或液體培養基中其它低分子量種類的濃度，並任選用來引入新的種類(例如用來交換 緩衝液)。滲濾可以是連續或不連續的。連續滲濾包括以與濾液生成速度基本相同的速度 在緩衝液或樣品中加水來洗出最初的低分子量種類。如果將緩衝液用於滲濾，則樣品中的 新緩衝鹽的濃度會以與被除去種類的濃度成反比的速度提高。採用連續滲濾，用所選緩衝 液進行6當量樣品體積洗滌後通常可除去超過100%可滲透溶質中的99. 5%。不連續滲濾 用大量的水或緩衝液稀釋樣品，然後濃縮回原始體積。本發明優選不連續滲濾。典型的培 養基滲濾包括至少2(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或更多)倍滲濾體積(即在滲濾開始時至少 2x樣品體積)。滲濾可採用任何合適的膜(例如，PES、纖維素等，如上文所述)以任何合適方式 (例如，中空、盒式、螺旋等等)進行。所述膜保留病毒顆粒的截斷值為，例如，500kDa。滲濾步驟可在超濾步驟之前進行，例如，以便濃縮液體培養基。濃度將通常濃縮至 少2倍，例如，> 2倍、> 3倍、> 4倍、> 5倍、> 10倍，等等。超濾/濃縮和隨後的滲濾可 採用相同設備進行。滲濾之前進行濃縮能降低完成滲濾所需的液體體積，因此是有利的。滲濾之後的滲餘物含有低電導率緩衝液。合適的緩衝液包括磷酸鹽緩衝液、Tris/ HCl緩衝液、TES緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、硼酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液、甘氨酸緩衝液，等 等。滲餘物的電導率通常小於20mS/cm，例如0. 5-10mS/cm，或者是1.0-1.4mS/cm。可採用 IOmM磷酸鹽緩衝液。可採用親和捕獲、偽親和捕獲、層析或吸附從滲濾滲餘物中捕獲病毒顆粒。已知適 用於流感病毒的合適技術。例如，已知可採用歐衛矛(Euonymuseuropaeus)凝集素[21]或 用Cellufine Sulfate(CS)或硫酸化S印hadex柱進行親和捕獲或偽親和捕獲。可吸附於， 例如，聚電解質[22]、硫酸鋇[23]或磷酸鈣[24]，等等。在使用捕獲材料之前用滲餘物中 存在的低電導率緩衝液進行平衡是有益的。因此，例如，可用IOmM磷酸鹽緩衝液平衡捕獲 樹脂。相同的緩衝液也可用來洗滌捕獲材料，然後釋放捕獲的病毒顆粒。流感病毒本發明可用來從包括甲型、乙型和丙型流感病毒在內的任何合適的流感病毒中制 備抗原。尤其可用於感染人類的甲型病毒株。用於疫苗的流感病毒株隨季節而變。在目前的大流行間期，疫苗一般包括兩種A 型流感毒株(Hmi和H3N2)和一種B型流感毒株，一般是三價疫苗。本發明可使用這種流 行間病毒，但也可使用來自大流行毒株(即疫苗接受者和普通人群未曾免疫接觸的毒株) 的病毒，尤其是甲型流感病毒。因此，本發明可採用選自下組的任何甲型流感病毒血凝素亞 型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 或 H16。所述病毒可額 外具有以下任何NA亞型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9。
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本發明尤其適用大流行甲型流感病毒毒株，如H5W毒株。大流行毒株的特徵有 (a)與目前流通的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即數十年沒有在人群中發現 的血凝素(如H2)，或者從未在人群中發現的血凝素(如H5、H6或H9，通常只出現在鳥群 體中)，從而疫苗受者和常規人群對該毒株的血凝素沒有免疫力；(b)它能夠在人群中水平 傳播；和(c)它能使人致病。大流行毒株H2、H5、H7或H9亞型毒株有，例如，H5N1、H5N3、 H9N2.H2N2.H7N1和H7N7毒株。H5亞型的病毒可分成許多進化支，如進化支1或進化支2。 已經鑑定出進化支2的6個亞進化支，其中亞進化支1、2和3具有不同的地理分布，並且由 於它們可感染人類而尤其受到重視。乙型流感病毒通常不顯示不同的HA亞型，但乙型流感病毒確實可分成兩種不同 的譜系。這些譜系在20世紀80年代晚期出現，具有在抗原性上和/或遺傳上明顯相互不 同的HA[25]。目前的乙型流感病毒毒株類似於B/Victoria/2/87或B/Yamagata/16/88。 這些毒株在抗原上通常不同，但也可用胺基酸序列的差異來區別兩種譜系，例如，B/ Yamagata/16/88樣毒株通常(但不是總是)具有胺基酸殘基164缺失的HA蛋白，上述編號 是根據『Lee40』 HA序列定的[26]。本發明可用於任一譜系的乙型流感病毒抗原。流感病毒可被減毒。流感病毒可以是溫度敏感型。流感病毒可以是冷適應性病毒。 然而，當使用活病毒作為疫苗抗原時這三個特徵更加典型。流感病毒可以是對抗病毒治療有抗性(例如對奧塞米韋[27]和/或扎那米韋有 抗性)的毒株，包括抗性大流行毒株[28]。可用於本發明的流感病毒可以是再分類毒株，並可通過逆向遺傳學技術獲得。逆 向遺傳學技術[如29-33]能夠用質粒在體外製備含有所需基因組區段的流感病毒。該技術 一般包括表達(a)例如，由poll啟動子或噬菌體RNA聚合酶啟動子編碼所需病毒RNA分子 的DNA分子，和(b)例如，由polll啟動子編碼病毒蛋白的DNA分子，以便在細胞中表達兩 種類型的DNA，導致組裝成完整的感染性病毒顆粒。DNA優選提供所有病毒RNA和蛋白質， 但也可能用輔助病毒提供一些RNA和蛋白質。優選採用不同質粒產生各病毒RNA的基於質粒的方法[34-36]，這些方法也包括 使用質粒來表達所有或一些病毒蛋白(例如，僅PB1、PB2、PA和NP蛋白)，在一些方法中最 多使用12種質粒。為了降低所需的質粒數量，近期方法[37]將多個RNA聚合酶I轉錄盒 (用於合成病毒RNA)合併到同一質粒(如編碼1、2、3、4、5、6、7或所有8種流感A vRNA區 段的序列)上，並且將多個蛋白編碼區與RNA聚合酶II啟動子合併到另一個質粒(如編碼 1、2、3、4、5、6、7或所有8種流感々!111 ^轉錄物的序列)上。參考文獻37方法的優選方麵包 括(a)PBl、PB2和PA mRNA編碼區在同一質粒上；和(b)所有8個vRNA編碼區段在同一質 粒上。一個質粒上包含NA和HA區段而另外六個區段位於另一質粒上也可能是有利的。Poll啟動子是種特異性的，因此可選擇與發生反向遺傳學的細胞類型相匹配的啟 動子，例如在犬細胞中優選使用犬poll啟動子[38，39]。然而，作為使用poll啟動子來編 碼病毒RNA區段的替換方式，可使用噬菌體聚合酶啟動子[40]。例如，可方便地使用SP6、 T3或T7聚合酶的啟動子。由於poll啟動子的物種特異性，噬菌體聚合酶啟動子可能較適 合許多細胞類型，但也必須用編碼外源性聚合酶的質粒轉染細胞。在其它技術中，可能使用po 11和po 1II雙啟動子由一個模板同時編碼病毒RNA和 可表達的mRNA [41，42]。
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因此，流感A病毒可包含來自A/PR/8/34病毒的一個或多個RNA區段(一般是 來自A/PR/8/34的6個區段，HA和N區段來自疫苗毒株，即6:2再造毒株)。也可包含 來自A/WSN/33病毒，或用於產生疫苗製劑的再造病毒的任何其它毒株的一個或多個RNA 區段。甲型流感病毒包括不到6個(即0，1，2，3，4或5)個來自AA/6/60流感病毒(A/ AnnArbor/6/60)的病毒區段。乙型流感病毒包括不到6個(即0，1，2，3，4或5)個來自 AA/1/66流感病毒(B/ArmArbor/1/66)的病毒區段。本發明一般保護免受能夠在人之間傳 播的毒株的感染，因此該毒株的基因組通常包含源自哺乳動物(如人)流感病毒的至少一 個RNA區段。它可包含源自禽流感病毒的NS區段。流感病毒生長和病毒顆粒純化可對含有流感病毒顆粒的原料進行本發明的方法。這些病毒顆粒可以是病毒在卵 (例如，無特定病原體的卵)或在細胞培養物中生長的產物。目前培養流感病毒的標準方法 採用含胚的雞蛋，由雞蛋內容物(尿囊液)純化病毒。然而，更近一段時間以來，已經在動 物細胞培養物上培養病毒，出於速度和患者變態反應的原因，優選這種培養方法。用來生長流感病毒的細胞系通常是哺乳動物來源的。合適的哺乳動物細胞來源包 括但不限於倉鼠、牛、靈長動物(包括人和猴)和犬細胞，但不優選使用靈長動物細胞。可 採用各種細胞類型，例如腎細胞、成纖維細胞、視網膜細胞、肺細胞等。合適的倉鼠細胞的例 子是稱為BHK21或HKCC的細胞系。合適的猴細胞是(例如)非洲綠猴細胞，例如腎細胞， 如Vero細胞系[43-45]。合適的犬細胞是(例如)腎細胞，例如CLDK和MDCK細胞系。因此，合適的細胞系包括但不限於=MDCK ；CHO ；CLDK ；HKCC ；293T ；BHK ；Vero ； MRC-5 ；PER. C6[46] ；FRhL2 ;WI_38 ；等等。合適的細胞系可由各種來源獲得，例如美國典型 培養物保藏中心(ATCC) [47]、Coriell細胞庫[48]或歐洲細胞培養物保藏中心(ECACC)。 例如，ATCC供應各種不同Vero細胞，目錄號為CCL-81、CCL-81. 2、CRL1586和CRL-1587，還 供應MDCK細胞，目錄號為CCL-34。PER. C6可獲自ECACC，保藏號為96022940。最優選的細胞系是具有哺乳動物類糖基化的細胞系。哺乳動物細胞系的一個較不 優選的替代方式是，可以在禽細胞系上培養[例如參考文獻49-51]，包括衍生自鴨(如鴨視 網膜)或雞的細胞系。禽細胞系的例子包括禽胚胎幹細胞[49.52]和鴨視網膜細胞[50]。 合適的禽胚胎幹細胞包括衍生自雞胚胎幹細胞的Ebx細胞系、EB45、EB14和EB14-074 [53]。 也可利用雞胚成纖維細胞(CEF)。然而，除了使用禽細胞，使用哺乳動物細胞意味著疫苗可 不含禽DNA以及卵蛋白(如卵清蛋白和卵類黏蛋白)，從而降低變應原性。用於培養流感病毒的最優選細胞系是衍生自Madin Darby狗腎的MDCK細胞 系[54-57]。原始MDCK細胞系可購自ATCC (CCL-34)，但也可利用該細胞系的衍生細胞 系。例如，參考文獻54公開了適合懸浮培養的MDCK細胞系(『MDCK 33016，，保藏號 DSM ACC 2219)。類似地，參考文獻58公開了在無血清培養基(『B-702，，保藏號FERM BP-7449)中懸浮培養的MDCK衍生細胞系。參考文獻59公開了非致瘤性MDCK細胞，包 括 『MDCK-S，(ATCC PTA-6500)、『MDCK-SF 101，(ATCC PTA-6501)、『MDCK-SF 102，(ATCC PTA-6502)和『MDCK-SF103，(PTA-6503)。參考文獻60公開了非常易於感染的MDCK細胞 系，包括『MDCK. 5F1，細胞(ATCC CRL12042)。可使用任何這些MDCK細胞系。可以在貼壁或懸浮培養的細胞中培養病毒。也可採用微載體培養。因此，在一些 實施方式中，細胞可能適合懸浮培養。
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優選在無血清培養基和/或無蛋白培養基中培養細胞系。在本發明中，如果培養 基中沒有人或動物來源的血清的添加劑，則稱為無血清培養基。生長在該培養物中的細胞 通常本身就含有蛋白質，但無蛋白應理解為在不含蛋白質、生長因子、其它蛋白添加劑和非 血清蛋白質的情況下發生細胞增殖的培養物，但可任選包含諸如胰蛋白酶和其它蛋白酶等 可能是病毒生長所必需的蛋白質。在病毒複製期間，支持流感病毒複製的細胞系優選低於37°C生長[61](例如， 30-36°C，或約 30°C，31°C，32°C，33°C，34°C，35°C，36°C )。在培養細胞中增殖流感病毒的方法通常包括以下步驟用待培養的菌株接種培 養的細胞，將感染細胞培養所需時間以使病毒增殖，例如通過病毒效價或抗原表達來確 定所需時間(如接種後24-168小時)，然後收穫增殖的病毒。用1 500-1 1，優選 1 100-1 5，更優選1 50-1 10的病毒(由PFU或TCID50測定)細胞比接種培養 的細胞。將病毒加入細胞懸液中，或施加於細胞單層，在25-40°C，優選28-37°C下，使病毒 吸附於細胞至少60分鐘，但通常小於300分鐘，優選90-240分鐘。可通過凍融或酶作用去 除感染的細胞培養物(如單層)，以提高收穫的細胞上清液的病毒含量。然後，可滅活或冷 凍儲存收穫的液體。可以約0. 0001-10、優選0. 002-5、更優選0. 001-2的感染複數(「m. ο. i.「)感染培養的細胞。更優選地，以約0. 01的m. ο. i.感染細胞。可以在感染後30-60 小時收穫感染的細胞。優選在感染後34-48小時收穫細胞。更優選在感染後38-40小時收 獲細胞。通常在細胞培養期間加入蛋白酶(一般是胰蛋白酶)，以使病毒釋放，可以在培養 的任何合適階段加入蛋白酶，例如在接種前、接種時或接種後[61]。在優選的實施方式中，尤其是採用MDCK細胞時，超過40群體倍增水平時細胞系不 從主工作細胞庫傳代。病毒接種物以及病毒培養物優選不含(即經測試且得到陰性汙染結果)單純皰疹 病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠狀病毒、腺病毒、鼻病毒、呼腸孤病毒、多瘤病 毒、雙RNA病毒、環病毒和/或細小病毒[62]。特別優選不存在單純皰疹病毒。流感病毒在卵或細胞培養物中生長之後可獲得含有病毒顆粒的液體。本發明可用 來從這種液體製備抗原，且通常的第一個步驟是從所述液體中純化(或濃縮)病毒顆粒。 純化可通過各種方法實現[63，64]。例如，可使用區帶離心法[65]，例如採用線性蔗糖梯度 溶液。密度梯度離心可使用差速區帶離心或連續流轉頭[66]。也可採用沉澱法，例如使用 聚乙二醇[67]。可採用親和捕獲或偽親和捕獲，如上文所述(本發明的第五方面)。在這 種純化方法之前，可對含有病毒顆粒的液體進行過濾(例如，以除去細胞碎片)和/或超濾 (通常具有較大的分子量截斷值，如> 300kDa>、500kDa或更高)和/或滲濾(如本發明 的第五個方面所述)。病毒滅活本發明的方法通常包括滅活病毒以去除其感染性的步驟。滅活病毒的化學方法包 括用有效量的以下一種或多種物質處理去汙劑、甲醛(如福馬林)、β-丙內酯、亞甲基 藍、補骨脂素、羧基富勒烯(C60)或其任意組合。本領域已知其它病毒滅活方法，例如二乙 胺、乙醯氮丙啶、或Y輻照或UV照射。用β-氮丙啶處理尤其有用，如參考文獻68所述。在本發明的一些實施方式中， β「氮丙啶可存在於磷酸鹽緩衝液中。
在滅活之前的步驟中，通常如上文所述濃縮病毒顆粒。裂解用去汙劑(離子型或非離子型)和/或溶劑處理純化的病毒顆粒產生亞病毒顆 粒製品可獲得裂解病毒顆粒。如上所述，裂解流感病毒的方法是本領域熟知的，包括「吐 溫-醚」法。裂解通常在完整的感染性或非感染性病毒顆粒上進行。這種破壞導致病毒蛋 白的完全或部分溶解，改變病毒的完整性。BEGRIVAC 、FLUARIXtm、FLUZONE 和FLUSHIELD 產品是裂解疫苗。合適的裂解劑包括但不限於乙醚、聚山梨酸酯80、脫氧膽酸鹽、磷酸三丁酯、聚 氧乙烯烷基醚、N，N-二烷基-葡糖醯胺、Hecameg、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季銨化合物、 十二烷基肌氨酸鈉、溴化十六烷基三甲基銨(如Cetavlon )、磷酸三丁酯、十四烷基三甲 銨鹽、脂質轉染試劑、利非他明(lipofectamine)和DOT-ΜΑ、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇 (如曲通表面活性劑，如曲通X-100或曲通NlO 1)、壬基酚聚醚-9 (NP9) Sympatens-NP/090、 聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐溫表面活性劑)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一種有用的裂 解方法使用脫氧膽酸鈉和甲醛的連續作用，最初病毒顆粒純化過程中(例如在蔗糖密度梯 度溶液中)發生裂解。優選的裂解劑是離子型(例如，陽離子型)去汙劑，如溴化十六烷基三甲基銨 (CTAB)。裂解可在存在緩衝液，如磷酸鹽緩衝液時進行。緩衝液宜具有微酸性PH，如在7. 1 和9. 0之間，在7. 2和8. 0之間，或者約7. 5。裂解通常是水溶液中發生，如緩衝的水溶液。如上所述，溶液的離子強度為IOOmM 或更高，例如彡 200mM、彡 300mM、彡 400mM、彡 500mM、彡 600mM、彡 700mM、彡 800mM，等等。去汙劑交換裂解步驟之後通常通過吸附除去裂解去汙劑。例如，參考文獻14報導了在CTAB/ 吐溫裂解步驟之後加入安伯萊特XAD-4(—種交聯的大網絡芳香聚合物)以除去去汙劑。然 後通過過濾除去該聚合物。一些情況下，需要將去汙劑保留在最終的藥物製劑中以溶解某些活性成分。在此 例中，從病毒顆粒製備流感抗原的以前方法在離子型裂解去汙劑(如CTAB)之前或與之同 時加入了非離子型去汙劑(如聚山梨酸酯)。然後徹底除去離子型去汙劑(例如通過安伯 萊特吸附)，但出於溶解目的保留了非離子型去汙劑。也可採用非離子型去汙劑來溶解抗 原，從而，在除去離子型去汙劑期間不吸附它們，例如，確保安伯萊特吸附除去CTAB但不除 去血凝素。這種方法的一個問題是，很難達到非離子型去汙劑的所需終濃度，因為在裂解之 後保留在溶液中的非離子型去汙劑的量取決於裂解步驟之前存在的蛋白質、脂質等的量 加入物質的水平越低則非離子型去汙劑的殘餘濃度越高，反之亦然。為避免該問題，在本發明的一些實施方式中，在裂解步驟之前不使病毒顆粒接觸 去汙劑。裂解時使病毒顆粒接觸所需濃度的第一去汙劑(例如離子型去汙劑，如CTAB)。然 後除去第一去汙劑，但替換成第二去汙劑(例如非離子型去汙劑，如聚山梨酸酯80)，即將 第一去汙劑換成第二去汙劑。該步驟可包括在除去第一去汙劑的同時加入第二去汙劑； 加入第二去汙劑，隨後除去第一去汙劑；或者除去第一去汙劑隨後加入第二去汙劑。交換之
10後存在的第二去汙劑的量可能低於、高於或等於交換之前存在的第一去汙劑的量。但重要 的是，該步驟之後殘餘的第二去汙劑的濃度是可控且可確定的(例如，相對於流感抗原的 量)，而過早加入第二去汙劑可導致除去裂解去汙劑之後剩餘的量可變。裂解之後不一定要立即發生去汙劑交換。例如，在裂解之後但在去汙劑交換之前 可能需要進一步純化抗原，例如可以從裂解病毒顆粒中純化表面抗原(見下文)再進行交 換。對裂解病毒顆粒的進一步處理本發明提供了流感病毒裂解工藝的各種改進，因此可用來製造裂解病毒疫苗。然 而，除此之外，可進一步處理按照本發明製備的裂解病毒顆粒以提供，例如，純化的流感病 毒表面抗原(血凝素以及通常還包括神經氨酸酶)。如上所述，製備該類疫苗的方法是本領 域熟知的，FLUVIRIN 、AGRIPPAL 和INFLUVAC 產品都是此類疫苗。例如，可採用超離心裂 解病毒顆粒來製備純化的表面抗原。類似地，可對裂解病毒顆粒進行區帶梯度離心(見參 考文獻9的實施例1)。因此，本發明的分裂流感病毒顆粒的方法可作為製備裂解病毒疫苗或製備純化表 面抗原疫苗的總過程的一部分。在該過程中，將通過以本發明所述方法分裂流感病毒顆粒 的方法從病毒獲得含有血凝素的抗原製品。然後用所述含有血凝素的抗原製品來製備疫 苗，也如本文所述。HA是現有滅活流感疫苗中的主要免疫原，參考一般通過SRID試驗測定的HA水平 使疫苗標準化。現有疫苗一般含有約15 μ g HA/毒株，但(例如)兒童使用時，或者在大流行 情況下，或當使用佐劑時也可採用較低劑量。採用了分數劑量如( S卩7. 5 μ g HA/毒株)、 1/4和1/8，以及較高劑量(如3x或9x劑量[69，70])。因此，疫苗可包含0. 1-150 μ g HA/ 流感毒株，優選 0. 1-50 μ g,例如 0. 1-20 μ g、0. 1-15 μ g、0. 1-10 μ g、0. 1-7. 5 μ g、0. 5-5 μ g 等。具體劑量包括例如，約45、約30、約15、約10、約7. 5、約5、約3. 8、約1. 9、約1.5yg等 /毒株。用於兒童時理想劑量是1.5 μ g/毒株。疫苗可包含一種或多種(如1、2、3、4或更多種)流感病毒毒株，包括甲型流感病 毒和/或乙型流感病毒的抗原。疫苗包含一種以上流感毒株時，一般單獨培養不同毒株，收 獲病毒後將它們混合在一起，然後製備抗原。對於含有一種以上流感毒株抗原的疫苗而言， 本發明的方法可在製備單價原料抗原期間使用，然後混合多個單價原料而製成多價疫苗。 因此，本發明方法可包括混合一種以上流感毒株的抗原(含有血凝素的抗原製品)的步驟。本發明所用HA可以是天然HA，如病毒中發現的天然HA，或者可以是經修飾的HA。 例如，已知修飾HA以去除導致病毒在禽類動物中具有高度致病性的決定簇(如HAl和HA2 之間切割位點周圍的超鹼性區域(hyper-basicregion))，因為這些決定簇可導致病毒不能 在雞蛋中生長。疫苗可包含基質蛋白以便受益於定位在該抗原內的額外的T細胞表位。因此，包 含血細胞凝集素和神經氨酸酶的疫苗還可包含Ml和/或M2基質蛋白。有用的基質片段披 露於參考文獻71。也可存在核蛋白。佐劑本發明疫苗組合物可包含佐劑，佐劑的作用是增強在接受組合物的患者中引起的 免疫應答(體液免疫和/或細胞免疫)。可用於本發明的疫苗佐劑包括但不限於
·包含鈣鹽和鋁鹽(或其混合物)的含礦物質組合物。鈣鹽包括磷酸鈣(如參考 文獻72公開的「CAP」顆粒)。鋁鹽包括氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等，所述鹽取任何合適形 式(如凝膠、晶體、無定形等)。優選吸附於這些鹽。也可將含有礦物質的組合物製成金屬 鹽的顆粒[73]。可使稱為氫氧化鋁和磷酸鋁的佐劑。這些名稱是常規名稱，僅為方便使用， 因為它們都不是所代表的實際化合物的準確描述[例如參見參考文獻157的第9章]。本 發明可採用通常用作佐劑的任何"氫氧化物"或"磷酸鹽"佐劑。稱為"氫氧化鋁"的 佐劑一般是羥基氧化鋁鹽(通常至少部分為晶體)。稱為"磷酸鋁"的佐劑一般是羥基磷 酸鋁，也常常含有少量硫酸鹽(即羥基磷酸硫酸鋁)。可通過沉澱獲得這些佐劑，沉澱期間 的反應條件和濃度影響磷酸根取代該鹽中羥基的程度。本發明可使用氫氧化鋁和磷酸鋁 的混合物。在這種情況下，磷酸鋁比氫氧化鋁多，例如重量比為至少2 1，例如彡5 1、 彡6 1、彡7 1、彡8 1、彡9 1等。給予患者的組合物中Al+++的濃度優選小於IOmg/ ml，例如彡 5mg/ml、彡 4mg/ml、< 3mg/ml、< 2mg/ml、彡 lmg/ml 等。優選範圍是 0. 3-lmg/ ml。最大值優選為0. 85毫克/劑量。-皂苷[參考文獻157的第22章]是在許多種類 植物的樹皮、葉、莖幹、根甚至花中發現的留醇糖苷和三萜糖苷的異質群體。已廣泛研究了 作為佐劑的來自皂樹(Quillaia saponaria) Molina樹皮的皂苷。皂苷也可購自麗花菝葜 (Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、滿天星(Gypsophilla paniculata)(婚紗花)和肥皂草 (Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐劑製劑包括純化的製劑，例如QS21，以及脂質 製劑，例如ISC0M。QS21以商標Stimulon 出售。已採用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。 已鑑定了用這些技術純化的特定組分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH_A、QH-B和QH-C。皂 苷優選QS21。製備QS21的方法參見參考文獻144。74.皂苷製劑也可包含留醇，如膽固醇 [75]。·皂苷和膽固醇的組合可用於形成稱為免疫刺激複合物(ISCOM)的獨特顆粒[參 考文獻157的第23章]。ISCOM—般還含有磷脂，例如磷脂醯乙醇胺或磷脂醯膽鹼。任何 已知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM優選包含QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。參考文 獻75-77中進一步描述了 ISC0M。任選地，ISCOM可不含其它去汙劑[78]。開發基於皂苷 的佐劑的綜述可參見參考文獻79和80。·細菌ADP-核糖基化毒素(如大腸桿菌(E.coli)不耐熱腸毒素"LT"、霍亂毒 素〃 CT"或百日咳毒素〃 PT")，尤其是其脫毒衍生物，如稱為LT-K63和LT-R72[81]或 CT-E29H[82]的突變毒素。參考文獻83中描述了將脫毒的ADP-核糖基化毒素用作黏膜佐 劑，參考文獻84中描述了將其用作胃腸道外佐劑。·生物粘附劑和黏膜粘附劑，如酯化透明質酸微球[85]或殼聚糖及其衍生物 [86]。 由可生物降解和無毒材料(例如聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己 酸內酯等)，優選丙交酯-乙交酯共聚物形成的微粒(即直徑約100ηπι-150μπι，更優選約 200nm-30 μ m,最優選約500nm-10 μ m的顆粒)，任選處理以具有帶負電錶面(如用SDS處 理)或帶正電錶面(例如用陽離子去汙劑如CTAB處理)。·脂質體(參考文獻157第13和14章)。適合用作佐劑的脂質體製劑的例子見 參考文獻87-89所述。·胞壁醯肽，例如N-乙醯胞壁醯-L-蘇氨醯-D-異穀氨醯胺(thr-MDP)、N-乙
12醯_去甲胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺(去甲MDP)、N-乙醯葡萄糖胺醯-N-乙醯胞 壁醯-L-Al-D-異穀氨醯-L-Ala-二棕櫚醯丙醯胺(〃 DTP-DPP〃或〃 TheramideTM// )和 N-乙醯胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺醯-L-丙氨酸-2-(1' -2' -二棕櫚醯-sn-甘 油-3-羥基磷醯氧基)-乙胺(MTP-PE)。·聚氧(polyoxidonium)聚合物[90，91]或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。 甲基肌苷5'-單磷酸酯(〃 MIMP「 )[92]。·多聚羥化吡咯雙烷類化合物[93]，如下式化合物式中，R選自氫，直鏈或支鏈、未取代或取代、飽和或不飽和的醯基、烷基(如環 烷基)、烯基、炔基和芳基，或其藥學上可接受的鹽或衍生物。例子包括但不限於木麻黃 (casuarine)、木麻黃_6_ α -D-吡喃葡萄糖、3_表-木麻黃、7_表-木麻黃、3，7_ 二表-木 麻黃等。 ⑶Id配體，如α-糖基神經醯胺[113-120](例如α -半乳糖苷神經醯胺)、含有 植物鞘氨醇的α -糖基神經醯胺、OCH、KRN7000[(2S，3S，4R)-l-0-(a -D-半乳糖苷吡喃糖 基)-2- (N- 二十六烷基氨基)-1，3，4-十八烷三醇]、CR0NY-101、3 「 -0-磺基-半乳糖苷 神經醯胺，等等。· y 菊粉[102]或其衍生物，如 algammulin。 水包油乳液。多種這類乳液是已知的，它們一般包含至少一種油和至少一種表面 活性劑，油與表面活性劑是可生物降解(可代謝)和生物相容性的。進一步的細節如下。·免疫刺激性寡核苷酸，例如含有CpG基序的寡核苷酸(含有通過磷酸鍵連接於 鳥嘌呤殘基的未甲基化胞嘧啶殘基的二核苷酸序列)、或CpI基序(含有連接於肌苷的胞 嘧啶的二核苷酸序列)，或雙鏈RNA、或含有迴文序列的寡核苷酸、或含有聚(dG)序列的寡 核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸可包含核苷酸修飾/類似物，如硫代磷酸酯修飾，可以是雙 鏈或(除RNA外)單鏈。參考文獻103、104和105公開了可能的類似取代，例如用2』 -脫 氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷。參考文獻106-111中進一步討論了 CpG寡核苷酸的佐劑作用。 CpG序列可能導向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT [112]。CpG序列可特異性誘導Thl免 疫應答，例如CpG-A ODN(寡脫氧核糖核苷酸)，或更特異地誘導B細胞應答，例如CpG-B ODN0參考文獻113-115中討論了 CpG-A和CpG-B ODN。CpG優選是CpG-A 0DN。優選構建 CpG寡核苷酸時使其5』端可為受體所識別。任選將兩個CpG寡核苷酸序列的3』端相連接 形成「免疫聚體」。參見例如，參考文獻112和116-118。有用的CpG佐劑是CpG7909，也稱 為 ProMune (科雷製藥集團公司(Coley Pharmaceutical Group, Inc.))。另一種是 CpG 1826。或者或此外，為了使用CpG序列，可使用TpG序列[119]，這些寡核苷酸可不含非甲 基化CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸可能富含嘧啶。例如，它可能含有一個以上連續的胸 腺嘧啶核苷酸(例如，參考文獻119所公開的TTTT)，和/或它的核苷酸組成中可能含有> 25%胸腺嘧啶(例如> 35%、> 40%、> 50%、> 60%、> 80%等)。例如，它可能含有一 個以上連續的胞嘧啶核苷酸(例如，參考文獻119所公開的CCCC)，和/或它的核苷酸組成 中可能含有>25%胞嘧啶(例如>35%、>40%、>50%、>60%、>80%等)。這些寡核苷酸可以不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸一般含有至少20個核苷酸。它 們可含有少於100個核苷酸。基於免疫刺激性寡核苷酸的特別有用的佐劑被稱為ic-31 [120]。因此，本發 明佐劑可包含⑴和(ii)的混合物(i)包含至少一個(優選多個)CpI基序的寡核 苷酸(例如15-40個核苷酸)，和(ii)聚陽離子聚合物，如包含至少一個(優選多個) Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(如5_20個胺基酸)。寡核苷酸可以是含有26-聚體序列 5' -(IC)13-3' (SEQ ID NO:—)的脫氧核苷酸。聚陽離子聚合物可以是含有11-聚體氨 基酸序列 KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO:—)的肽。· 3-0-脫醯化單磷醯脂質A(' 3dMPL'，也稱為'MPL ' ) [121-124]。在水性條 件下，3dMPL可形成不同大小，如直徑 500nm的膠束聚集體或顆粒。其中一種 或兩種可用於本發明，可通過常規實驗選擇更好的顆粒。本發明優選使用小顆粒(如小到 足以產生澄清的3dMPL水懸液)，因為它們活性高[125]。優選顆粒的平均直徑小於220nm， 更優選小於200nm，小於150nm，或小於120nm，它們的直徑甚至可以小於lOOnm。然而在大 多數情況下，平均直徑不小於50nm。·咪唑並喹啉化合物，如咪喹莫特(〃 R-837 「 ) [126，127]、瑞喹莫德 (「R-848" ) [128]和其類似物；及其鹽(如鹽酸鹽)。有關免疫刺激性咪唑喹啉的其它細 節可參見參考文獻129-133。 縮氨基硫脲化合物，如參考文獻134所述的化合物。參考文獻134中也描述了配 制、製備和篩選活性化合物的方法。縮氨基硫脲在刺激人外周血單核的細胞產生細胞因子， 例如TNF-α中特別有效。色胺酮化合物，如參考文獻135所述的化合物。參考文獻135中也描述了配製、制 備和篩選活性化合物的方法。縮氨基硫脲在刺激人外周血單核的細胞產生細胞因子，例如 TNF-α中特別有效。·核苷類似物，如(a)埃索他賓(Isatorabine) (ANA-245 ；7_硫雜_8_氧代鳥苷)
及其前藥
權利要求
1.一種分裂流感病毒顆粒的方法，所述方法包括以下步驟(i)在不存在去汙劑時獲 得包含流感病毒顆粒的組合物；(ii)在不存在去汙劑時滅活所述流感病毒顆粒；(iii)用 包含第一去汙劑的試劑裂解滅活的病毒顆粒；和(iv)用第二去汙劑交換第一去汙劑。
2.一種分裂流感病毒顆粒的方法，所述方法包括以下步驟(i)獲得包含流感病毒顆 粒的組合物；(ii)通過接觸用離子強度為IOOmM或更高的緩衝液配製的去汙劑來裂解所述 病毒顆粒。
3.—種分裂流感病毒顆粒的方法，所述方法包括以下步驟(i)在存在磷酸鹽緩衝液 時獲得包含流感病毒顆粒的組合物；(ii)在存在磷酸鹽緩衝液時滅活所述流感病毒顆粒； 和(iii)在存在磷酸鹽緩衝液時裂解所述滅活的流感病毒顆粒。
4.一種製備流感疫苗的方法，其中，(a)通過採用任一項上述權利要求所述方法分裂 流感病毒顆粒的方法而從病毒獲得包含血凝素的抗原製品，和(b)所述含血凝素的抗原制 品被用於製備疫苗。
5.如任一項前述權利要求所述的方法，其特徵在於，所述流感病毒顆粒來自甲型流感病毒。
6.如任一項前述權利要求所述的方法，其特徵在於，所述流感病毒顆粒來自H5血凝素 亞型甲型流感病毒。
7.如任一項前述權利要求所述的方法，其特徵在於，所述流感病毒顆粒是從雞蛋製備的。
8.如任一項前述權利要求所述的方法，其特徵在於，所述流感病毒顆粒是從哺乳動物 細胞培養物製備的。
9.如權利要求4-8中任一項所述的方法，其特徵在於，所述疫苗含7.5 μ g血凝素/毒株。
10.如權利要求4-9中任一項所述的方法，其特徵在於，所述疫苗包含佐劑。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述佐劑包含水包油乳液。
12.一種在患者中產生免疫應答的方法，所述方法包括給予通過權利要求4-11中任一 項所述方法製備的疫苗的步驟。
全文摘要
公開了從裂解的流感病毒製備疫苗抗原的許多改進。裂解步驟之後可以是去汙劑交換。裂解可在存在較高離子強度的緩衝液和/或存在磷酸鹽緩衝液時進行。
文檔編號A61K39/145GK101998990SQ200980110089
公開日2011年3月30日 申請日期2009年3月18日 優先權日2008年3月18日
發明者B·賈伯斯特, C·豪斯曼, F·豪斯希爾德 申請人:諾華有限公司