生產具有靶向基因組修飾的卵母細胞或卵的體外方法

2023-05-29 11:24:16

專利名稱：：生產具有靶向基因組修飾的卵母細胞或卵的體外方法生產具有靶向基因組修飾的卵母細胞或卵的體外方法
技術領域：
：本發明涉及在卵母細胞或卵中引入靶向基因組修飾(modificationg紐omiquecibl6e)的體外方法以及在宿主細胞基因組中進行隨機插入的方法。轉基因是一種分子遺傳學技術，採用這種技術將外源DNA引入到多細胞生物的基因組中，並傳遞給其後代。這種傳遞給後代使所述DNA穩定整合在該胚胎的基因組中，並且在發育早熟期(stadepr6coce)也如此。目前，採用最多的其中一種轉基因技術是在哺乳動物卵中微量注射裸DNA的技術，該技術在許多情況下導致一部分微量注射的DNA分子整合在該卵基因組中。一些其它技術可用於轉基因，特別是在活細胞中引入外源DNA的技術，這些技術是本領域技術人員熟知的，具體地是電穿孔，藉助磷酸鈣沉澱、脂質體或修飾脂質例如lipofectamine⑧(INVITROGEN)的轉染。在外源DNA靶向整合在基因組中的情況中，需要利用同源重組機制。在這種情況下，外源DNA應該具有與在該基因組中耙向整合位點存在的核酸序列同源的核酸序列。因此這些同源重組機制在大多數生物體內是在極低的頻率下進行的。最近，使用在"內含子歸巢"機制中酵母內所涉及的核酸內切酶(它們屬於"大範圍核酸酶(m6ganucl6ase)"家族)允許在細胞培養中，尤其在哺乳動物胚胎千細胞中大大提高這些同源重組的頻率(COHEN-TANNOUDJI等人，Mol.Cell.Biol.，vol.18(3)，第1444-1448頁，1998)。在這些細胞中，誘導外源大範圍核酸酶的表達引起在大尺寸特異核酸序列(大範圍核酸酶/-5^/的18個鹼基對)處基因組DNA雙鏈斷開，接著在外源DNA分子序列與圍繞這個斷開位點的同源序列之間發生同源重組。因此，這些大範圍核酸酶能夠使該基因組DNA中的感興趣的序列置換或缺失，或把外源序列引入到該基因組DNA中，並且以"耙向(dbl6e)"方式引入。令人驚奇地，本發明人已證明，在卵中引入外源核酸序列和大範圍核酸酶/-5^/時，應在其基因組中有一個被與外源核酸序列同源的序列圍繞的/-&"位點，以得到具有靶向基因組修飾的卵，這種修飾相應於在基因組/-&"位點通過同源重組插入外源核酸序列。本發明人的發現能夠證明，如果在體內可以實施用大範圍核酸酶的同源重組機制，所述機制也可以足夠的效率直接在卵母細胞或卵中進行，不影響所述生物體發育的程序進行時也如此。因此，本發明的方法能夠得到具有靶向基因組修飾的卵或卵母細胞，並且可能直接得到遺傳修飾的成熟生物，它具有一個這樣的靶向基因組修飾，並且其全部細胞都如此。所述靶向基因組修飾這時可能相應於缺失或插入，特別地插入與野生序列相比突變的序列。卵或卵母細胞的細胞與正常細胞相比含有大量的細胞質，這樣使得難以進入含有遺傳物質的核中。另外，特別是用於保護卵的卵周圍的膜(卵黃膜)和絨毛膜的存在制約進入該細胞。這些障礙物一般需要採用特別的技術，如直接注射細胞。可採用技術的複雜性制約了可能通過實驗在幾百個卵中進行處理的卵數量。在卵或卵母細胞中靶向基因組修飾方法的可行性因此需要誘導靶向基因組修飾進行的頻率足以使本領域技術人員能夠在實施這樣一種方法時有獲得成功的合理期望。顯然，這樣一種合理的成功期望在採用本發明的方法之前是不存在的。事實上，沒有大範圍核酸酶時，同源重組機制在卵中是一種非常稀少的遺傳過程。這樣一種同源重組頻率很可能低於或等於在胚胎幹細胞中觀察的同源重組頻率，即每百萬細胞約一次事件。使用提高同源重組頻率的大範圍核酸酶，特別是在胚胎幹細胞中(ES;COHEN-TANNOUDJI等人，1998，同前)，不再能使本領域技術人員實現合理的成功期望。事實上，即使在這種情況下提高同源重組頻率，該頻率至多達到頻率6x10—6，這非常明顯地使所述技術不可用於卵。相反，COHEN-TANNOUDJI等人的文章(1998,同前)建議本領域技術人員採用基於培養物中胚胎幹細胞的同源重組方法，這些細胞的優勢在於能夠大量獲得，並且在往胚泡期胚胎中注射獲得靶向基因組修飾的稀少細胞後有可能得到轉基因動物。因而，如果得到的轉基因生物同時有由開始胚胎衍生的細胞和注射的遺傳修飾的胚胎幹細胞，這種轉基因生物就稱之"嵌合(mosaique)"。這時需要在這些所得動物之間進行雜交，以便得到所有細胞都是遺傳修飾的動物。本發明的方法能夠直接得到轉基因動物，它們所有細胞都具有靶向基因組修飾。另外，在沒有分離出胚胎幹細胞的任何品系(lign6e)的生物的情況下，現有技術建議本領域技術人員分離這樣一些細胞，並且本發明的方法決不能由這樣一些生物的卵直接獲得轉基因動物。SEGAL和CAROLL的文章(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.92，第806-810頁，1995)描述了在大範圍核酸酶/-&6/存在下在x6nope卵母細胞中的同源重組機制。然而，在有/nSce-J位點而在基因組DNA中沒有任何所述大範圍核酸酶的位點的環形質粒中進行所述同源重組。另外，如果這篇文章證明在所述質粒獲得同源重組，也不能預言應用基因組DNA機制的足夠效率。與大範圍核酸酶同時注射非常大量的這種質粒，該大範圍核酸酶/-^^/沒有固定在其位點時是不太穩定的。這個大量/-&"位點與這種共注射有利於該大範圍核酸酶的穩定，但不能夠在任何情況下預測在稀少位點存在下獲得的同源重組頻率，因為至多定位在該基因組DNA的幾個拷貝中，並且因該基因組DNA緊密結構而增加了接近困難。能夠合理地知道，染色質的結構和位點稀有性不能讓大範圍核酸酶在其沒有降解之前到達其中一個位點。因此，本發明的第一個目的相應於生產具有耙向基因組修飾的非人脊椎動物卵母細胞或卵的體外方法，該方法包括a)核酸內切酶在卵母細胞或卵核中的表達步驟，其特徵在於所述核酸內切酶以外源方式引入，其特徵還在於所述卵或卵母細胞的基因組DNA具有至少一個所述核酸內切酶的識別位點，該識別位點相應於具有至少12個鹼基對的特異核酸序列，因此允許(i)核酸內切酶特異序列固定在上述的識別位點；(ii)在所述的識別位點或在鄰近區，優選地在所述識別位點的100個鹼基對以下的區域內，通過所述核酸內切酶連續誘導在基因組DNA中的雙鏈斷開，然後(iii)通過同源重組機制修復所述雙鏈斷開；以及b)鑑定具有所需的靶向基因組修飾的卵或卵母細胞的步驟。卵應該理解是雄配子使雌配子授精而得到的單個細胞，並且它們包含了形成新生物所需要的全部潛力。更簡單地，這種卵相應於細胞期的胚胎。卵母細胞應該理解是卵子發生(ovoger^se)成熟期時所得到的雌胚芽細胞。優選地，本發明的方法是生產具有靶向基因組修飾的非人脊椎動物卵的體外方法。作為在本發明方法中可以使用卵或卵母細胞的非人脊椎動物實例，可以列舉哺乳動物，如嚙齒類動物、羊、牛或非人靈長類動物，爬行動物；兩棲動物，如x6nope;禽類，如母雞；昆蟲，如蒼蠅，以及魚，如斑馬魚或青鏘魚(M6daka)。優選地，在本發明方法中使用的卵或卵母細胞是魚的卵或卵母細胞，所述魚如鮭魚、鱒魚、金槍魚、庸鰈、鯰魚、斑馬魚、青鯔魚、鯉魚、剌魚、astyanax、羅非魚、金魚、狼艫、鱘魚或鱈魚。特別優選地，使用的卵或卵母細胞是斑馬魚(/^m'o^n》)或青鏘魚(Oiz/o/a^as)的卵或卵母細胞。本發明的方法還毫無困難地應用於其它水生種類，如蛙、x6nope、蝦、海膽。識別位點應該理解是一種特異核酸序列，它長度為至少12個鹼基對，所述核酸內切酶特異性地固定在其上，並且在該核酸內切酶固定在所述序列後能夠通過所述核酸內切酶誘導該DNA中的雙鏈斷開。優選所述識別位點相應於至少16個鹼基對、特別優選至少18個鹼基對的特異核酸序列。特異核酸序列應該理解是DNA序列，優選是雙鏈DNA序列。可以採用本領域技術人員熟知的技術實施該鑑定步驟。作為實例，這個鑑定步驟可以釆用對從獲得的卵或卵母細胞中分離的基因組DNA進行鑑定的Southern或PCR技術，這些技術分別採用探針或特異引物。在所述靶向基因組修飾相應於插入包含報告基因的外源核酸序列的情況下，所述鑑定步驟可以採用檢測所述報告基因活性的技術。這樣一些檢測技術是隨使用的報告基因而改變的，並且是本領域技術人員熟知的。在所述靶向基因組修飾相應於插入包含選擇基因的外源核酸序列的情況下，所述鑑定步驟相應於所述卵或卵母細胞在合適培養基中的培養步驟。這樣一個步驟的培養條件是隨使用的選擇基因而改變的，並且是本領域技術人員熟知的。根據一個特別實施方式，所述核酸內切酶的所述特異核酸序列相應於所述核酸內切酶確定的固定共有序列，或相應於由所述共有序列衍生的序列。事實上，某些核酸內切酶能被固定在一些序列上，而這些序列與其共有序列沒有完全的相同性，並且在這種固定後能在其共有序列或鄰近區發生雙鏈斷開。有利地，所述特異序列與所述共有序列具有90%以上的相同性，優選具有95%以上、特別優選具有98%以上的相同性。相同性百分比應該理解是在所述特異序列與所述核酸內切酶確定的所述固定共有序列之間具有相同性質與位置的核酸百分數。根據使用的核酸內切酶，或者在所述特異識別位點，或者在所述識別位點的鄰近序列中，優選地在所述識別位點的100個鹼基對以下，優選地在50個鹼基對以下，特別優選地在20pb以下的鄰近序列中，有可能在DNA中獲得的雙鏈斷開。有利地，由核酸內切酶誘發的雙鏈斷幵位於該基因組DNA中的識別位點。所述識別位點可以存在於野生個體的基因組DNA中，或者通過轉基因可以引入到所述基因組DNA中。根據本發明的優選實施方式，通過轉基因將所述識別位點引入所述卵或卵母細胞的基因組DNA中。能夠以靶向方式或隨機方式將這個識別位點引入該基因組DNA中。有利地，或者在本發明方法中使用的所述卵母細胞或卵中，或者在能發育為性成熟的生物且來自於本發明方法使用的卵母細胞或卵的卵母細胞、卵或細胞中，進行通過轉基因的所述引入。根據所述優選實施方式的一個特別實施方式，以靶向方式進行所述識別位點的引入。可以根據本領域技術人員熟知的技術通過同源重組進行這樣一種靶向引入。作為實例，COHEN-TANNOUDJI等人(1998，同上)描述了在核中注射含有選擇基因和大範圍核酸酶的識別位點的載體，它們被與該基因組DNA的靶序列同源的核酸序列圍繞。在選擇已穩定整合該構建體的細胞後，特別地在使用合適的培養基時，鑑定在該基因組DNA中在期望的位置整合這種構建體的這些細胞，尤其採用Southern印跡法或採用PCR法。由於在這些條件下重組率低，所以具有靶向插入的細胞數也極低。有利地，通過同源重組將所述核酸內切酶的識別位點靶向引入該基因組DNA中。根據所述優選實施方式的第二個特別實施方式，以隨機方式進行所述識別位點的引入。為此，可以採用不同的技術。作為實例，CHOULIKA等人(1998'《Mol.Cell.Biol.》，15(4)，第1968-1973頁，1995年)描述了使用逆轉錄病毒載體將大範圍核酸酶/-&6/的識別位點整合在基因組DNA中。PCT申請WO03/025183描述了另一種方法，將大範圍核酸酶的識別位點通過同時在其核中微量注射大範圍核酸酶和具有被兩個/-^^/識別位點圍繞的報告基因的DNA片段而隨機整合在魚卵基因組DNA中。還可能採用在這些實施例中描述的本發明核酸序列隨機整合方法。有利地，採用在專利申請WO03/025183中描述的核酸序列隨機整合方法或者採用在實施例中描述的核酸序列隨機整合方法，將所述核酸內切酶的識別位點隨機引入基因組DNA中。許多核酸內切酶能與具有至少12個鹼基對的特異序列連接，接連地在所述特異序列中或在其鄰近區誘導DNA雙鏈斷開，最後通過同源重組機制修復所述雙鏈斷開，這些核酸內切酶是本領域技術人員已知的。作為這樣一些核酸內切酶實例，可以列舉大範圍核酸酶。大範圍核酸酶組成一個酶家族，這些酶以非常低的頻率使該DNA的雙鏈斷開。事實上，所述大範圍核酸酶具有12-40個鹼基對的識別位點，而通常的限制酶具有一般約4-8個鹼基對的識別位點。在該基因組DNA中，這樣一個識別位點的存在概率因此是極低的。這些大範圍核酸酶還能從結構和機制觀點充分進行表徵。根據保守胺基酸基序可將這些大範圍核酸酶分成四個不同的家族。十二肽家族(dod6camSre、DOD、DOD、Dl-D2、LAGLI6DADG、Pl-P2)是最重要的家族，有150個以上的序列，這些序列按照它們具有十二個胺基酸保守基序(十二肽)的一個拷貝(Z-Cew/、/-Oe/)或兩個拷貝(/-C/iw/、/-Csm/、/-Dwo/、/-屍朋/、/-&e/、/-&e//、7-5be///、/-&eiy、F-&e/、屍/-如/、屍/-如/、P/-Cew/、屍/-Cz>/、屍/國CVW、屍/-Dra/、P/H屍/-耀/、屍/-Mgo/、屍/,a/、iV-緣oT、屍/-Me/、iV-Mh//、戶/者淑、屍/-屍淑/、戶/-屍/w/、戶/畫/Vzo/、iY-屍Ao/、屍/-/、戶/-/附"/、屍/U、戶/-鄉/、屍/-，/、屍/-窗、屍/-77///、屍/,/、iV-7Jp//、屍/-~/、屍/H屍/-攀/、屍/-Mga/、屍/-Mgfl//、屍/H屍/-MmaT、P/H屍/-Myw//、iY-Mf/z/,P/-r"g/、屍/-77^/7)再分組。具有一個十二肽的大範圍核酸酶具有約20kDa的分子量，並且以同型二聚體形式起作用。具有兩個十二肽的大範圍核酸酶具有約25-50kDa的分子量，其中在這兩個基序之間有70-150個殘基，並且它們是單體形式活性的。GIG家族具有完全保守基序KSGIY-X1m-YTGS(/-A/cT/、/-A^r//、/朋//、/-7^7)或部分保守基序(/-7^/7)，並且這個家族的酶將該DNA在與其識別位點不同的位點切割。HC家族具有富含組氨酸和半胱氨酸的序列(/^o;/、/-1^>/、/-/^"/、/-//mW/i)，一般還有大致相應於"SHLC-G-G-H-C"的保守序列。這個家族表徵最好的大範圍核酸酶是酶/-/^0/。HNH家族具有在35個殘基窗(fen§trede35residues)中的共有序列"HH-N-H-H"與DNA切割的特別性質(/-7^//7)。然而，還曾鑑定不能併入這四個家族的不同大範圍核酸酶。迄今，這些大範圍核酸酶總共五個，相應於F&e/、i^ce//(7/0、F-5W/、F-rev/禾口FU。然而，所有這些大範圍核酸酶都能在具有識別位點的DNA中誘導雙鏈斷開，在其中或在其鄰近區中特別如此。另外，許多大範圍核酸酶具有核定位信號(NLS)。這種蛋白序列能夠有利於所述大範圍核酸酶進入核，因此由其介導同源重組。大範圍核酸酶/-5^/是這樣一種大範圍核酸酶的實例。然而，在野生大範圍核酸酶沒有這樣一種核定位信號的情況下，本領域技術人員可以構建具有這樣一種信號的衍生的大範圍核酸酶，可以根據生產重組蛋白的熟知的分子生物學技術進行。根據本發明方法的第二個優選實施方式，使用的核酸內切酶是一種大範圍核酸酶或由這樣一種大範圍核酸酶衍生的酶，其可以是合成的。作為大範圍核酸酶的實例，可以列舉大範圍核酸酶/-(^"/、/-CVe/、/-C7m/、/-C《w/、/國Z)mo/、/-屍""/、/-Sce/、/-5^//、7-5fce///、7-&e/K、F-&e/、F-&e//、屍/-如/、戶/如/、屍/-Cew/、戶/-0/、屍J-ar/、屍/-"ra/、/Y-Mn7"、屍/-単/、iV-Mgo/、屍/-攀/、屍/-廳/、屍/-她/、屍嵐w/、iV-Mfwffl、屍/"P/w/、iY-屍/zo/、屍/-/W、屍/卻/、屍/-腸/、屍/-5^/、屍/-5^/、iV-^fw/、/Y-7W、iY-打氾、P/-Kp/、屍/-7^//、i^-^p/、/YHW-,a/、iV-Mga/、iV-Mg"//、屍/H屍/-M廳/、屍/HiY-Myw//、iV-M/2/、屍/-rag/、屍/-772_y//、/-Mr/、/-H/-服、/-屍op/、/-A>/、/-//mw/、/-Www//、/-rev//、/-7fev///、F-5be/、f/f0、F-S"v/、屍-7^//#^-7^//或由其中一種衍生的大範圍核酸酶。這些不同大範圍核酸酶的識別位點與特異性是本領域技術人員熟知的，並且特別地在http://rebase.neb.com中描述。優選地，所述大範圍核酸酶是在專利US6,238,924中描述的大範圍核酸酶/-5^/。衍生的大範圍核酸酶或由大範圍核酸酶衍生的酶應理解是一種重組蛋白，其具有野生大範圍核酸酶序列並且能識別與所述野生大範圍核酸酶不同的識別位點和/或在不同部位或者根據與所述野生大範圍核酸酶不同的機制使DNA雙鏈斷開。所述衍生的大範圍核酸酶還能夠通過同源重組機制修復所述雙鏈斷開。作為這樣衍生的大範圍核酸酶的實例，特別地可以列舉重組大範圍核酸酶，其與DNA連接的結構域衍生自與該DNA連接的其它蛋白，如IIS型的限制核酸內切酶或轉錄因子。作為這樣衍生的大範圍核酸酶的實例，還可以列舉重組大範圍核酸酶，其具有一或多個其衍生自的野生大範圍核酸酶沒有的核定位位點。該核酸內切酶能夠以外源方式以不同形式，即以蛋白形式或以能夠在卵或卵母細胞中表達所述核酸內切酶的核酸序列形式引入所述卵或卵母細胞中。根據本發明方法的第三個優選實施方式，核酸內切酶以蛋白形式引入卵或卵母細胞中。能夠以蛋白形式引入這樣一種核酸內切酶的技術是本領域技術人員熟知的。作為這樣一些技術的實例，特別地可以列舉微量注射法。有利地，以外源方式引入的所述核酸內切酶的濃度是每微升每個卵或卵母細胞為0.1-5單位，優選地每微升0.5-2.5單位，特別優選地每微升l-2單位。每個卵或卵母細胞注射的體積是本領域技術人員一般知識的一部分，是其體積的約10%。作為實例，能注射到斑馬魚或青鏘魚的卵或卵母細胞中的體積是300pl至lnl。因此每卵或卵母細胞引入核酸的量是0.3xl0"至5xl0一3單位，優選地是1.5xl0—"至2.5xl0—單位，特別優選地是0.3xl0—s至2xl0_3單位。根據本發明方法的第四個優選實施方式，以能夠在所述卵或卵母細胞中表達核酸內切酶的核酸分子的形式引入所述核酸內切酶。所述核酸分子因此包括能在所述卵或卵母細胞中表達所述核酸內切酶的調節序列控制下的編碼核酸內切酶的開放讀框。核酸分子應該理解是DNA、RNA分子與DNA/RNA雜合分子，其可以是單鏈或雙鏈形式。作為可用於本發明方法的核酸分子的實例，可以列舉編碼核酸內切酶的mRNA分子或含有編碼所述核酸內切酶的開放讀框的表達載體。表達載體應該理解是一種核酸分子，其能輸送並能表達以可操縱方式與其連接的感興趣的核酸序歹lj。這樣一種表達載體含有能在卵或卵母細胞中表達所述核酸內切酶的啟動子序列。作為這樣啟動子的實例，特別地可以列舉on-微管蛋白或a-肌動蛋白的啟動子，或本領域技術人員熟知的強組成型啟動子，例如巨細胞病毒啟動子(CMV)。所述表達載體還能含有其它的調節序列，其相應於複製起點、核糖體固定位點、一或多個插入位點、多腺苷酸化位點或轉錄終止位點。在本發明方法中可使用的表達載體可以非限制性地相應於YAC(人工酵母染色體)、BAC(人工細菌染色體)、病毒載體、質粒載體、噬菌粒、粘粒、RNA載體、由杆狀病毒、噬菌體、轉座子或線'性或環狀RNA或DNA分子衍生的載體。這樣的載體是本領域技術人員熟知的。作為病毒載體的實例，特別地可以列舉逆轉錄病毒、腺病毒、細小病毒、冠狀病毒、正黏病毒、彈狀病毒、副粘病毒、小RNA病毒、甲病毒屬、腺病毒、皰疹病毒、痘病毒。優選地，使用的表達載體是質粒載體。在卵或卵母細胞中引入核酸分子的技術是本領域技術人員熟知的。作為這樣技術的實例，可以列舉微量注射、電穿孔、藉助脂質體或修飾的脂質的轉染，例如lipofectamine⑧(INVITROGEN)或藉助磷酸鈣沉澱的轉染。優選地，採用微量注射進行這種引入。在同源重組之後在DNA的雙鏈斷開位點處引入的靶向基因組修飾可以是在斷開位點兩側的兩個基因組DNA的同源序列之間進行重組的情況下的基因組序列缺失，或者是在外源核酸序列與基因組DNA之間在同源區進行重組的情況下的插入。根據本發明方法的第五個優選實施方式，所述方法還包括在卵母細胞或卵中引入外源核酸序列的步驟，該序列與位於基因組DNA中的核酸內切酶的識別位點上下遊的核酸序列具有同源性。外源核酸序列應該理解是引入卵或卵母細胞中的雙鏈DNA序列，該序列可以為線性或環狀形式。優選地，所述外源核酸序列為環狀形式。有利地，給予每個卵或卵母細胞的核酸序列濃度是每微升l-50ng，優選地每微升5-40ng，特別優選地每微升10-30ng。如前所述，注射每個卵或卵母細胞的體積是本領域技術人員的一般知識的一部分，是其體積的約10%。作為實例，在斑馬魚或青鏘魚的卵或卵母細胞中能注射的體積是300pl至lnl。因此每個卵或卵母細胞引入的核酸量是0.3-50pg，優選地1.5-40pg，特別優選地3-30pg。根據所述優選實施方式的特別實施方式，所述外源核酸序列衍生自基因組序列，特別是所述基因組序列的突變形式或來自其它個體或其它生物的所述基因組序列的同種型。在這種情況下，同源重組機制引起外源核酸序列插入，這與"取代"基因組序列類似。根據所述優選實施方式的第二個特別實施方式，所述外源核酸序列包括感興趣的核酸序列，其被兩個不同核酸序列圍繞，這些核酸與分別定位於基因組DNA中核酸內切酶識別位點上下遊的核酸序列具有同源性。所述感興趣的核酸序列可能相應於基因或調節序列(如啟動子或激活劑)，希望採用本發明方法測定得到的轉基因脊椎動物中其相關活性和/或表型。該感興趣的核酸序列可以包括報告基因，如p-半乳糖苷酶、GFP(綠色螢光蛋白)、RFP(紅色螢光蛋白)或對潮黴素磷酸轉移酶、組氨醇脫氫酶或胸腺嘧啶核苷激酶的選擇基因，如新黴素磷酸轉移酶。使用這樣一種選擇報告基因可能有利於鑑定具有尋求的靶向基因組修飾的卵或卵母細胞。優選地，所述報告基因或選擇基因不包括相關啟動子序列，以便鑑定具有相應於尋求的靶向基因組修飾的期望表達譜的卵或卵母細胞。有利地，這種或這些核酸序列與位於核酸內切酶的識別位點上下遊的核酸序列具有同源性，它們的長度是至少50個鹼基對，優選地至少100個鹼基對，特別優選地至少250個鹼基對。所述這些序列可以有較大的尺寸，然而IOOO個鹼基對以上的尺寸並不能提高同源重組的效率。還有利地，所述同源核酸序列與位於基因組DNA中的核酸內切酶識別位點上下遊的核酸序列具有至少80%的序列相同性，優選地至少90%的相同性，特別優選地至少95%的相同性。兩個核酸序列之間的相同性相應於位於兩個核酸序列之間相同位置的相同核苷酸的百分數。許多程序或算法都能夠計算相同性百分數，其中包括FASTA或BLAST。這些程序特別地從NCBI(國家生物技術信息中心；http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得。優選地，採用BLAST程序確定這種同源性，特別優選地採用使用BLOSUM62矩陣的BLAST程序確定這種同源性。有利地，所述外源核酸序列是一種載體。載體應該理解是一種能轉運一種與其連接的感興趣核酸序列的核酸序列。作為本發明方法可使用的載體實例，非限制性地可以列舉YAC(人工酵母染色體)、BAC(人工細菌染色體)、合適的病毒載體例如腺病毒、質粒載體、噬菌粒或粘粒。優選地，使用的載體是質粒載體。有利地，所述外源核酸序列沒有該核酸內切酶的任何識別位點。核酸序列引入卵或卵母細胞中的技術是本領域技術人員熟知的。作為這樣技術的實例，可以列舉微量注射法、電穿孔法、藉助脂質體或修飾脂質的轉染，例如lipofectamine(INVITROGEN)，或藉助磷酸鈣沉澱的轉染。優選地，採用微量注射技術進行這種引入。相對於核酸內切酶序列或與有可能表達所述核酸內切酶的核酸分子，可以不同或同時引入所述外源核酸序列。優選地，它們的引入是同時的。根據本發明方法的第六個優選實施方式，本發明的方法還包括在適當條件下培養具有靶向基因組修飾的預先授精的卵母細胞或卵以便能使非人脊椎動物發育的步驟。有利地，採用的培養條件能使非人脊椎動物發育。這些培養條件以及卵母細胞授精技術是本領域技術人員熟知的，並且隨本發明方法中使用的生物而改變。作為實例，對於斑馬魚或青賄魚卵，這個培養步驟相應於在溫度約28'C(高或低1或2"C)下溫育這些卵。根據本發明方法的第七個優選實施方式，所述方法還包括在培育步驟前的一個步驟，該步驟相應於在低於該培育溫度5-2(TC、優選地低於10-15'C的溫度下溫育這種卵，期間能夠保持卵的成活力(即達到直到孵化的卵數)高於5%，優選地高於10%，特別優選地高於15%。本領域技術人員可以很簡單地確定這些卵或卵母細胞能保持的最長時間，而這個時間隨使用卵或卵母細胞在所述溫度的耐受而改變。有利地，進行這樣一種溫育的時間是1-24小時，優選地1-20小時，特別優選地1-10小時。作為實例，在青鏘魚卵的情況下，這個預先步驟相應於在溫度10-25°C，優選地12-19"C，特別優選地13-18X:下溫育。有利地，使用授精後所述卵或卵母細胞發育時得到的非人脊椎生物的細胞，優選地使用來自成熟的非人脊椎生物的細胞，進行具有尋求的靶向基因組修飾的卵或卵母細胞的鑑定步驟。通過下面的實施例將體會到本發明的其它優點與特徵。實施例l:在青鏘魚的基因組中隨機插入I-SceI位點npqTI-EGFP-I構建體已通過在質粒pa!TI-EGFP中(Goldman等人，《TransgenicRes.》，10(1)，第21-33頁，2001年；HIEBER等人，《J.Neurobiol.》，37(3)，第429-440頁，1998年))，在斑馬魚的a-微管蛋白啟動子與EGFP(增強型綠色螢光蛋白)的報告基因之間插入大範圍核酸酶的識別位點得到構建體paiTI-GFP-I。在第一個步驟，用酶加Aw/Z/(BIOLABS)消化構建體paJI-EGFP,然後純化該消化的構建體。用S"m/Z/消化的構建體paiTI-EGFP再進行脫磷酸化，然後再進行純化。最後，在用萬a附H/消化並脫磷酸化的構建體pa,TI-EGFP與含有位點/-&6/(以黑體字表示)的雙鏈寡核苷酸以及與消化位點相容的粘性自由末端之間進行連接反應(有義寡核苷酸(SEQIDNO:1):5'畫GATCATAGGGATAACAGGGTAATA-3';反義寡核苷酸(SEQIDNO:2):5'-GATCTATTACCCTGTTATCCCTAT-3')。通過測序證實了在a,微管蛋白的啟動子序列與EGFP的開放讀框序列之間5aw/f/位點的的識別位點的插入和定向以及與讀框的一致性。2)pact-GFPI2構建體如THERMES等人所述(《MechanismsofDevelopment,第118巻，第91-98頁，2002年)得到了構建體pact-GFPI2。已通過測序證實了分別在斑馬魚的a-肌動蛋白啟動子上遊與GFP(綠色螢光蛋白)的報告基因下遊的大範圍核酸酶的兩個功能識別位點的插入和定向。3)構建體pqTI-EGFP-I和pact-GFPI2的線性化:用酶Wo/和力//(810!^68)消化構建體pa!TI-EGFP-I已得到線性化形式的轉基因a,TI-EGFP-I。然後用柱QIAEXII⑧(QIAGEN)純化了含有該轉基因的片段XhoI-AflII，再用柱Elutip-D(SCHLEICHERANDSCHUELL)過濾。用大範圍核酸酶(ROCHEDIAGNOSTICS)消化構建體pact-GFPI2得到了線性化形式的轉基因act-GFPI2。含有該轉基因的片段I-scel-I-Scel再如前所述進行純化。4)微量注射轉基因和大範圍核酸酶/-&6/根據Thermes等人(2002，同前)描述的方案，在有或沒有大範圍核酸酶的情況下，將不同的DNA注射到細胞期的青鏘魚卵中。在進行的這些實驗中，注射了線性化形式(片段XhoI-AflII)的轉基因a,TI-EGFP-I以及線性化形式(片段Iscel-I-Scel)或環狀形式(pact-GFPI2)的轉基因act-GFPI2。5)轉基因在卵(FO)中的表達:為了跟蹤轉基因在這些微量注射卵中的表達，在配備紫外燈(在370-420nm激發)與GFP的455nm發射濾光片的放大鏡LEICAMZFLIII下觀察了胚胎的螢光。在預備實驗中，其中在細胞期的卵中微量注射了僅僅環狀形式的質粒paiTI-EGFP,結果表明在神經發生期間並且直到孵化(授精後9天，st,39)在SNC中可檢測GFP的螢光。更確切地，構建體pa,TI-EGFP的瞬時表達實驗揭示了在青鏘魚中，主要在增殖過程的細胞中，斑馬魚的on-微管蛋白啟動子在中樞神經系統被激活。該構建體的比活性因此顯示出與GOLDMAN等人(20(U，同前)描述的斑馬魚中的比活性類似。對於轉基因a!TI-EGFP-I，結果表明與卵中構建體pa,TI-EGFP類似的表達譜。轉基因act-GFPI2表達譜本身與THERMES等人(2002，同前)觀察到的類似。在不同微量注射實驗中表達這些轉基因的胚胎比例列於下表I中。表Itableseeoriginaldocumentpage19沒有大範圍核酸酶時，觀察到在微量注射後還存活的近50°/。胚胎沒有顯示出螢光。相反地，在大範圍核酸酶存在下微量注射這些不同轉基因時，觀察到表達GFP的胚胎比例有很大的增加。因此，這些結果表明在大範圍核酸酶存在下，轉基因ct,TI-EGFP-I表達的陰性胚胎是所有注射胚胎的約10%(12%，n=116)，即低於使用轉基因act-GFPI2達到的比例(16%)。通過共注射該大範圍核酸酶大大改善了F0代的轉基因的瞬時表達。6)轉基因傳遞給後代:選擇表達所述轉基因的FO代魚作為可能的起始生物(fondateur)。飼養這些起始生物直到它們性成熟，這時與野生夥伴雜交。分析後代(F1)胚胎的轉基因表達。結果列於下表II中。表IItableseeoriginaldocumentpage20這些結果表明，在對照注射的情況下(沒有與/-See/共注射)，大多數試驗魚的GFP不是陽性的。這意味著在F0生殖品系(lign6egerminale)的細胞中沒有所述轉基因。在被兩個/-5^/識別位點圍繞的轉基因act-GFPI2的情況下，觀察到近30%個體穩定地將該轉基因整合在其基因組中。提出的機制相應於THERMES等人(2002，同前)描述的機制，根據這個機制，所述大範圍核酸酶能夠將被兩個其識別位點圍繞的轉基因整合在基因組中。按照提出的模型，該轉基因會被大範圍核酸酶切除，該大範圍核酸酶保護自由末端，然後還能將切除的轉基因隨機整合在基因組中。令人驚奇地觀察到，在與轉基因^TI-EGFP-I和ASbe/共注射的並試驗傳遞的19個胚胎中，4個(即21%，n二19)產生了表達GFP的後代。因此似乎THERMES等人(2002，同前)提出的模型沒有考慮在大範圍核酸酶存在下轉基因的插入機制，因為沒有位於這些末端的立即末端(proximit6imm6diate)的唯一一個識別位點的存在還能以很高頻率將該轉基因穩定整合在該基因組中。通過轉基因a,TI-EGFP-I整合得到的4個起始生物個體稱之F0.191、F0.25I、F0.34I和F0.36L來自這些起始生物的Fl個體在SNC中有均勻的綠色螢光，而該綠色螢光在早神經胚期從神經發生開始也是可觀察到的(25hpf,st.17)。在起始生物？0.251的情況下，來自它的F1個體具有多種GFP表達水平。通過螢光增加順序區分低、中、高表達GFP的個體(分別稱之F0.25-1、F0.25-2和F0.25-3)。Fl的這樣一些變化可能歸因於FO中整合在該基因組中的不同轉基因聯體(concagm§res)分離成三個在遺傳上不同的整合位點。這些胚胎(F1)培養直到孵化，孵出僅僅具有低和中等螢光的胚胎，生出性成熟的成體魚。該轉基因傳遞到下一代(即F2、F3和F4)依然是均一的，這證實了該轉基因的穩定整合。根據在陽性Fl個體後代中轉基因的表達估算了起始生物個體的平均傳遞比率。得到的比率變化很大，且低於50%。在轉基因a,TI-EGFP-I的情況下，該平均值是30±12.5%。四個起始魚中的唯一一個(F0.19I)這時會明顯地達到50%的傳遞，這相應於半合子傳遞百分數。在這種情況下，可能的是在FO中，在生殖品系的所有細胞中該轉基因被整合在唯一一個位點。最終，這些結果表明在兩個或單個I-SceI位點存在下，該轉基因整合在生殖品系中的效率明顯提高。7)轉基因整合在該基因組中的分析:根據SAMBROOK等人描述的方案(CSHLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,1989)，使用蛋白酶K和苯酚，由Fl成體轉基因魚提取基因組DNA。7-A.轉基因qTI-EGFP-I:對於使用轉基因a,TI-EGFP-I的Southern印跡實驗，用Sac/或WW/消化基因組DNA，使用0.8。/。瓊脂糖凝膠(TAElx)分離，再通過毛細作用轉移到硝酸纖維素膜上，該膜已用特異探針雜交，而該探針已隨機地用放射性核苷酸("P)進行標記。這個探針相應於EGFP序列。在用銀膠片曝光幾小時後用感光成像儀(phosphoimager)顯示轉基因的雜交。這些結果示於圖l中。對於品系F0.19,用S^/消化(用所述探針識別所述區域外存在的位點)揭示有兩個大小約4kb的強條帶和多個小尺寸條帶(2kb與約3kb)。兩個約4kb的條帶可能分別相應於類型I的正向串聯與反向串聯的轉基因插入(分別見圖2A和2B)。對於小尺寸條帶(2kb與約3kb)，它們非常可能相應於在整合的DNA與基因組DNA之間的連接片段。與該連接片段相比，兩個4kb條帶的強度表明在該基因組中大量存在這兩類串聯，並且比例相似。對於品系F0.25-l和-2，結果表明存在兩個4kb診斷條帶中的唯一一個(圖l，箭頭)。與F0.19的譜比較表明，或許涉及類型I的反向串聯的聯體形式(圖2B)。這些條帶的低強度暗示了在這些品系中存在少量的轉基因拷貝。通過^4ge/(所述探針識別區域之外；未顯示數據)和消化(在該轉基因中沒有位點；未顯示數據)證實了這三種品系的這些結果。使用iVw/消化能夠分析品系的類型II的反向串聯形式的存在(圖2C)。這些結果表明，僅品系F0.19具有這樣一些整合(圖1，星號)。分析品系F0.36的基因組DNA揭示與品系F0.19的DNA的相同的消化譜(未顯示數據)。因此，兩個品系F0.25具有插入譜，其具有多個單一聯體與少量拷貝(類型I的反向串聯)。7-B.轉基因act-GFPI2:THERMES等人(2002，同前)描述了用這種轉基因得到的轉基因品系的分析結果。這些結果還表明在不同試驗品系的基因組DNA中有少量轉基因拷貝(l-8個拷貝)的插入譜。最後，使用大範圍核酸酶/-&"和有其一或兩個識別位點的構建體，在大多數分析的品系中都能夠得到在單一拷貝或少量拷貝形式的基因組中穩定整合的報告基因。因此與在基因組中觀察到大量插入的轉基因中通常採用的技術相比(HACKETT,《BiochemistryandMolecularBiologyofFishes》，Elsevier,第207-240頁，1993年；IYENGAR等人，《TransgenicRes.》，第5巻，第147-166頁，1996年)，這兩種隨機插入技術是優秀的技術。8)整合的I-Scel位點的完整性:在期望使用這些得到的轉基因品系進行用大範圍核酸酶/-5^/的同源重組並且特別有可能靶向整合感興趣基因的情況下，重要的是在該基因組中這個或這些整合的/nSce/位點應是功能性的。為了體外試驗在品系F0.25-1、-2、F0.19和F0.36的基因組中整合的I-Scel位點的完整性，純化了這些品系的基因組DNA。所述基因組DNA然後採用PCR藉助特異引物進行擴增，該引物定位於/-&^/識別位點兩側(圖3A)。擴增的DNA片段長度是500個鹼基對。得到的PCR產物然後用酶/-5^/(ROCHEDIAGNOSTICS)按照生產商的產品說明書進行消化，最後置於電泳凝膠上。這些結果示於圖3B。該反應產物在凝膠上的遷移顯示有約500pb的條帶，該條帶相應於未斷開的DNA，還有200和300pb的兩個其它小條帶(斷開的DNA，圖3A和3B)。500pb條帶的存在可能是由不完全的酶消化或存在突變的/-5^/位點造成的。在所有這些情況下，這些結果表明4個分析的品系都具有未突變的功能性/-&￡/位點，它們的數量隨分析的品系而改變。實施例2:在具有I-Scel位點的青鏘魚轉基因品系的基因組中轉基因的耙向插入1)修復構建體(constructionder印aration，CR):為了以靶向方式將轉基因整合在青鯔魚的基因組中，我們試驗了缺口(br&he)修復技術。為此，我們使用了含有wii^示蹤基因(單體紅色螢光蛋白)的第二種轉基因，其兩側被至少500pb序列圍繞，該序列與圍繞轉基因aiTI-EGFP-I的/-&6/位點的區域完全同源(01，修復構建體)。5'同源區相應於啟動子aiTI的內含子序列，這樣因此排除了游離型(6pisomale)形式的m//^7表達的任何可能性。為了實現這種構建體，純化相應於位於/-&"位點兩側同源區的質粒piTI-EGFP(1.7kb)的Sacl-Notl片段，並在通過&c/-A^/消化進行線性化的載體pCRII-TOPO⑧(Invitrogen)中克隆。通過測序證實獲得了RH載體。同時，相應於mRFP]的ORF的質粒mRFP廣pRSETB的BamHI-EcoRI片段(Campbell等人，《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》,99(12)，第7877-82頁，2002年)在EGFP位置，在BamHI與Notl位點之間在質粒pJI-EGFP中已進行亞克隆(sousclon6)。得到的構建體作為在每個末端添加BglII位點時採用PCR擴增序列mRFP,-PolyA的模板(有義引物(SEQIDNO:3):5'國GAAGATCTCTTAAGCATGGCCTCCTCCGAGGAC-3';反義引物(SEQIDNO:4):5'-CCTAGATCTGCTAGCATACATTGATGAGTTTGGAC-3')。得到的PCR產物克隆在質粒pCRII-TOPO(Invitrogen)中，並且通過測序證實了該序列。然後在進行這種構建體的Sg/II消化時分離片段mRFP,-PolyA。最後，在構建體RH的BamHI位點引入片段mRFPrPolyA(^g/11消化)時產生了修復構建體(CR)。在構建體PlTI-EGFP中引入這同一片段mRFPrPolyA時產生了對照構建體pa,TI-mRFPl-EGFP。2)微量注射修復構建體和大範圍核酸酶I-Scel根據Thermes等人(2002，同前)描述的方案，將環狀形式的修復構建體與大範圍核酸酶I-SceI共注射到細胞期的青鏘魚卵中。使用的卵來自轉基因魚品系(F3、F0.25-l和-2、F0.19和F0.36)。用試劑盒Midiprep⑧(Qiagen)擴增並過濾(0.2jim過濾器)後，在濃度為每^1個單位的I-Scel存在下，注射終濃度約lOng/pl的環狀修復構建體(CR)。在注射細胞期青鏘魚卵後，把卵置於28t:的孵箱中直到孵化。同時，為了檢査mRFPl的正確表達，按照同樣的方案，在細胞期的青鏘魚卵中只是注射對照構建體ponTI-mRFPl-EGFP。注射該構建體導致mRFPi在該胚胎中很好表達，沒有綠色螢光。3)mRFPl在卵(T0)中的表達為了跟蹤在這些微量注射的卵中在其過程中的轉基因表達，在配備紫外燈(在580-590nm激發)與mRFPl在607nrn發射的濾光片的放大鏡LEICAMZFLIII下觀察了胚胎的螢光。這些注射胚胎在接近期28期(30個體節(somites),64hpf)和32期(體節發生(somitogen6se)結束，授精後4天)在該放大鏡下觀察到其綠色和紅色(特別)螢光。這些實驗能夠分離來自品系F0.25-l的陽性mRFPl胚胎(簡單聯體形式的低GFP表達和轉基因整合)。紅色螢光只是在SNC中檢測到這種螢光弱而均勻，因此暗示該轉基因在這些初期卵裂球(premiersblastomferes)中同等分酉己(^partition6gale)。如果(i)這種表達譜相應於用構建體pa,TI-mRFPl-EGFP得到的譜和(ii)該修復構建體沒有功能a,微管蛋白的啟動子，則可能的是得出下述結論基因mRFPl被特異性地整合，並通過同源重組，整合在(X,微管蛋白的啟動子上遊，並在與預先整合在品系F0.25-l基因組中的至少一個I-Scel位點處。這些結果因此表明，可以用大範圍核酸酶在青鏘魚卵基因組中獲得共注射的轉基因的特異插入(通過同源重組)，所述青鯔魚卵基因組有幾個拷貝的這樣一種大範圍核酸酶的識別位點。4)微量注射條件改變:由2)描述的條件出發，或者彼此獨立地，或者全部地，試驗了該方案的不同變化。試驗變化表如下-增加修復構建體的量直到最高50ng/ml;-增加大範圍核酸酶的量直到最高2單位/W-降低注射後卵的孵化溫度，直到這些卵置於28'C之前在最低13°C下2-16小時。如前所述，在得到的胚胎中跟蹤mRFP的表達。結果列於表III。表IIIcomplextableseeoriginaldocumentpage26這些結果表明，獲得特異插入的最有利的條件是2單位/ml大範圍核酸酶I-Scel和25ng/mlDNA。另外，這些結果還表明，微量注射後接著在低於28"C的溫度下孵化卵能夠顯著提高具有標記的個體率(微量注射後在13t:孵化4h時接近3%)。實施例3:藉助其它大範圍核酸酶在青鏘魚轉基因品系基因組中耙向插入轉基因首先按照實施例1的方案進行隨機整合，但使用大範圍核酸酶I-Crel和I-Ceul與分別在斑馬魚a/微管蛋白啟動子與EGFP報告基因之間含有大範圍核酸酶I-Crel的識別位點(SEQIDNO:5;5'-CTGGGTTCAAAACGTCGTGAGACAGTTTGG-3')禾卩I-Ceul的識別位點(SEQIDNO:6:5'-CGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAA-3')的構建體。這些構建體與進行靶向插入所採用的方案與前面實施例2描述的相同，但是使用大範圍核酸酶I-Crel禾口I-Ceul(NEWENGLANDBIOLABS)。權利要求1、生產具有靶向基因組修飾的非人脊椎動物卵母細胞或卵的體外方法，該方法包括如下步驟a)在卵母細胞或卵的核中表達核酸內切酶，其特徵在於以外源方式引入所述核酸內切酶，其特徵還在於所述卵或卵母細胞的基因組DNA具有至少一個所述核酸內切酶的識別位點，該識別位點相應於至少12個鹼基對的特異序列，因此允許(i)該核酸內切酶特異序列固定在所述的識別位點；(ii)在所述的識別位點或在其鄰近區，優選地所述鄰近區在所述識別位點的100個鹼基對以內，通過所述核酸內切酶連續誘發該基因組DNA雙鏈斷開，然後(iii)通過同源重組機制修復所述的雙鏈斷開；以及b)鑑定具有所需靶向基因組修飾的卵或卵母細胞。2、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於在該基因組DNA中存在的所述識別位點通過轉基因引入。3、根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述核酸內切酶是大範圍核酸酶。4、根據權利要求3所述的方法，其特徵在於該大範圍核酸酶選自/-Cew/、/-Oe/、/-C7m/、/-Csw/、/-Z)mo/、/-屍朋/、/-Sce/、/-5^//、7-Scei7J、7U、F-&e厶FH屍"ae/、屍/-如/、P/-Ce"/、P/-Cz>/、屍/-0/、P/-i>a/、屍/-Mav/、iV-，、iV-Mgo/、屍/-畢/、屍/-施/、iYU、屍慮"/、iY-M威/、J°/-iW//、戶/-，/、戶/-屍M、屍/-屍W、戶/,/、屍/A廳/、屍ASbe/、屍/-&//、屍/-^7^/、iV-77//、iY-77氾、屍J-7Jp/、屍/-7^//、屍/-萬《/7/、屍/-McW、iY-澤/、/Y-M一、屍7-Mga//、屍/-倫/、屍/-M廳/、屍/插柳仏P/-Mf/z/、屍/-7^/、戶/-77^//、/H/-細//、/一7fev/、/-屍op/、/-DW、/-//mw/、/-//mw//、/-7fev//、/-rev///、屍-&"、F-&e//(^Q)、F-<Swv/、F-7fev/和F-revi7或由它們衍生的大範圍核酸酶。5、根據權利要求1-4中任一項權利要求所述的方法，其特徵在於每個卵或卵母細胞以外源方式並以蛋白形式引入的所述核酸內切酶的濃度是每微升0.1-5單位，優選地每微升0.5-2.5單位。6、根據上述權利要求中任一項權利要求所述的方法，其特徵在於在斷開位點的靶向基因組修飾相應於缺失或插入。7、根據權利要求6所述的方法，其特徵在於該方法還包括在卵母細胞或卵中引入外源核酸序列的步驟，該外源核酸序列與位於該基因組DNA中核酸內切酶識別位點上下遊的核酸序列具有同源性。8、根據權利要求7所述的方法，其特徵在於該引入的外源核酸序列沒有任何所述核酸內切酶的識別位點。9、根據權利要求7或8所述的方法，其特徵在於給予每個卵或卵母細胞的核酸序列的濃度是l-50ng/|Lil，優選地5-40ng/]id。10、根據權利要求7-9中任一項權利要求所述的方法，其特徵在於所述外源核酸序列包括被兩個不同的核酸序列圍繞的感興趣的序列，這些不同的序列與分別位於該基因組DNA中核酸內切酶的識別位點上遊和下遊的核酸序列具有同源性。11、根據上述權利要求中任一項權利要求所述的方法，其特徵在於非人脊椎動物卵或卵母細胞是哺乳動物、爬行動物、兩棲動物、禽類、昆蟲或魚類的卵或卵母細胞。12、根據權利要求11所述的方法，其特徵在於非人脊椎動物的卵或卵母細胞是選自鮭魚、鱒魚、金槍魚、庸鰈、鯰魚、斑馬魚、青鏘魚、鯉魚、刺魚、astyanax、羅非魚、金魚、狼鱸、鱘魚和鱈魚的卵或卵母細胞。13、根據上述權利要求中任一項權利要求所述的方法，其特徵在於該方法還包括在適合於能使非人脊椎動物發育的條件下培養具有耙向基因組修飾的預先受精的卵母細胞或卵的步驟。14、根據權利要求13所述的方法，其特徵在於該方法在該培養步驟之前還包括一個步驟，該步驟相應於在低於該培養溫度5-2(TC、優選低於10-15-C的溫度下孵化所述卵或卵母細胞，且在孵化期間能夠保持相應於達到孵化的卵的卵成活力高於5%，優選地高於10%。15、根據權利要求14所述的方法，其特徵在於在該培養步驟之前的所述步驟相應於進行孵化1-24小時，優選地1-20小時。全文摘要本發明涉及生產具有靶向基因組修飾的非人脊椎動物卵母細胞或卵的方法，還涉及在宿主細胞基因組DNA中隨機整合外源核酸序列的方法。文檔編號C12N15/90GK101175858SQ200580043072公開日2008年5月7日申請日期2005年12月19日優先權日2004年12月17日發明者F·索姆,J-S·若利,V·瑟姆斯申請人:國立農業研究所-Inra