製備表達苯甲醛脫氫酶的轉化體及使用所述轉化體製備2,6－萘二甲酸的方法

2023-05-29 11:30:46 2

專利名稱：製備表達苯甲醛脫氫酶的轉化體及使用所述轉化體製備2,6－萘二甲酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種製備轉化體的方法，所述轉化體攜帶編碼來源於溶芳烴鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas aromaticivorans)KCTC 2888的苯甲醛脫氫酶的基因並表達所述酶，以及所述轉化體在通過將2-甲醯基-6-萘甲酸(在下文中稱為「FNA」)轉化為2，6-萘二甲酸(在下文中稱為「NDA」)以高純度純化粗萘二甲酸(在下文中稱為「cNDA」)中的應用，所述粗萘二甲酸通過2，6-二甲基萘(在下文中稱為「2，6-DMN」)的氧化得到，並伴生有FNA。
背景技術：
在諸如聚酯和聚醯胺的高性能聚合材料的製備中，萘二甲酸的二酯得到了廣泛且有效的應用。2，6-萘二甲酸二甲酯(在下文中，稱為「NDC」)是代表性的二酯。通過NDC與乙二醇縮合，製備了聚2，6-萘二甲酸乙二醇酯(在下文中，稱為「PEN」)，一種這樣的高性能聚酯。在強度和熱性能方面，發現由PEN製成的纖維和薄膜優於聚對苯二甲酸乙二醇酯(在下文中，稱為「PET」)。由於其優秀的物理性能，PEN被用於形成在磁記錄帶和電磁部件製備中使用的薄膜。此外，因為其對氣體擴散的優良抵抗，特別是對二氧化碳、氧氣和水蒸氣擴散的抵抗，由PEN製成的膜可應用於製造食品容器、特別是「熱裝罐」型食品容器。同樣地，PEN可用於製造在輪胎帘布製備中使用的高強度纖維。
現今，如圖1所示，NDC一般通過將DMN氧化為粗萘二甲酸(cNDA)，接著通過酯化來生產。在當前大多數情況下，NDC用作合成PEN的主要原料。但是，與NDA相比，NDC存在一些問題。首先，NDC縮合成PEN伴生有甲醇，帶有爆炸的危險，而NDA縮合產生的是水。其次，因為其是通過NDA酯化和純化獲得的，因此與NDA相比，NDC需要更多的處理。同樣地，NDC不能利用現有的PET生產設備。儘管存在著這樣的缺點，一般還是使用NDC而不是NDA用於PEN合成，因為NDA無法以足夠供PET合成使用的純度被製備。
正如圖2中所看到的，DMN氧化產生cNDA，由於不完全氧化的結果，伴生有副產物，例如2-甲醯基-6-萘甲酸、2-萘甲酸等。雜質特別是FNA，如果存在的話，在PEN聚合為聚合材料的過程中會引起斷裂，由此對聚合物的性質產生不利的影響。為了將cNDA應用於PEN合成，必須事先將FNA從其中除去，但這是困難的。
已知有多種方法用於從cNDA反應中除去FNA。例如，業已提出重結晶純化NDA，重複氧化以及在甲醇的存在下將cNDA轉化為NDC，接著水合或氫化為純的NDA。此外，業已進行了通過溶劑洗滌、熔體結晶、高壓結晶、超臨界萃取等方法除去FNA的嘗試。但是，這些技術剛好導致了NDA不夠的純度。從另一方面來說，除非犧牲產率，常規的方法才能增加NDA的純度，所以它們難以在實踐中使用。
如上所述，用於NDA生產的化學和物理方法存在著問題，包括產生環境汙染、由於高溫和高壓產生爆炸的可能性、由於大型設備而增加的生產成本、大量的能源消耗等。為了在聚合為高性能聚合材料中直接使用，2，6-萘二甲酸必須是高純度的，這是使用常規方法難以達到的。額外的純化處理，即使能得到高純度的NDA，還是會導致生產率降低和過程延長。
因而，近來已廣泛地注意到生物學方法，特別是使用微生物的生物學方法。先前，本發明人使用在韓國專利申請號2002-0087819中披露的新的芽孢桿菌開發出FNA的除去方法，並提出一種在如韓國專利申請號2002-7005344中披露的在二甲苯單加氧酶存在下製備芳族醛和羧酸的方法。沒有任何先前的文獻描述了使用來源於溶芳烴鞘氨醇單胞菌的苯甲醛脫氫酶將FNA轉化為NDA。

發明內容
本發明已經關注在現有技術中出現的上述問題，因此，本發明的一個目的是提供一種製備轉化體的方法，所述轉化體表達由xylC基因編碼的苯甲醛脫氫酶，能用於純化NDA。
本發明的另一個目的是提供一種純化cNDA的方法，其中在轉化體的存在下將cNDA中含有的FNA氧化為NDA。
根據本發明的一個方面，提供了一種製備表達苯甲醛脫氫酶的轉化體的方法，包括構建攜帶編碼來源於溶芳烴鞘氨醇單胞菌KCTC 2888的苯甲醛脫氫酶的SEQ ID NO1的基因(xylC)的重組表達載體，以及使用所述重組表達載體轉化宿主細胞。
根據本發明的另一個方面，提供了通過所述方法製備的轉化體。
根據本發明的再一個方面，提供了一種生產苯甲醛脫氫酶的方法，包括在25～45℃下培養所述轉化體，並以0.1～2.0mM的量添加IPTG到轉化體培養物中以誘導苯甲醛脫氫酶表達。
根據本發明的又一個方面，提供了一種純化粗萘二甲酸的方法，包括將所述粗萘二甲酸與轉化體反應以將粗萘二甲酸中含有的2-甲醯基-6-萘甲酸轉化為2，6-萘二甲酸。


根據以下詳細說明及附圖，本發明的上述和其他目的、特徵以及優點將會得到更清楚的理解，其中圖1是顯示通過常規氧化方法，2，6-二甲基萘轉化為萘二甲酸和萘二甲酸酯的反應路線。
圖2是顯示伴生有2-甲醯基-6-萘甲酸的2，6-二甲基萘氧化為2，6-萘二甲酸的反應路線。
圖3是攜帶編碼來源於溶芳烴鞘氨醇單胞菌的苯甲醛脫氫酶的基因的重組表達載體pET20-xylC的基因圖譜。
具體實施例方式
以下將給出本發明的詳細說明。
根據本發明的一個方面，提供了一種製備表達苯甲醛脫氫酶的轉化體的方法。為了該目的，將xylC(一種編碼苯甲醛脫氫酶的基因)從溶芳烴鞘氨醇單胞菌克隆並插入重組表達載體中，接著將所述載體導入合適的宿主細胞中。
苯甲醛脫氫酶(BZDH)是一種同源二聚體並為xylC基因所編碼。使用遺傳學人工改造以表達xylC的大腸桿菌，可以氧化苯甲醛、3-甲基苯甲醛、4-甲基苯甲醛、3-硝基苯甲醛和氯取代的苯甲醛(參見Inoue等，J.Bacteriol.，1771196-1201，1995)。
使用溶芳烴鞘氨醇單胞菌可以實現表示為SEQ ID NO1並編碼苯甲醛脫氫酶的xylC基因的克隆。為克隆xylC基因，使用一組基於xylC合成的引物5′-GGAGAATTCATATGGCTACGCAGT-3′(SEQ ID NO2)和5′-GTCTTGCAGTGAGCTCGTTTCTCC-3′(SEQ ID NO3)以及來自溶芳烴鞘氨醇單胞菌(KCTC 2888)的質粒DNA(pNL1)作為模板，進行聚合酶鏈式反應(PCR)。
使用攜帶xylC基因(SEQ ID NO1)的重組表達載體創建表達苯甲醛脫氫酶的轉化體。所述重組表達載體可通過將克隆的xylC基因與啟動子功能性連接而獲得。
至於圖3，其是攜帶有編碼來源於溶芳烴鞘氨醇單胞菌的苯甲醛脫氫酶的基因的重組表達載體pET20-xylC的基因圖譜。正如圖3所看到的，表示為SEQ ID NO1的約1.5kbp長的DNA片段被插入pET-20b(+)載體中以形成重組載體pET20-xylC。
如在此所披露和要求的，編碼來源於溶芳烴鞘氨醇單胞菌(KCTC 2888)的xylC的SEQ ID NO1所示序列意在包括「保守序列修飾」，即不顯著影響或改變所述核苷酸序列編碼的或含有所述胺基酸序列的酶的催化特性的核苷酸和胺基酸序列修飾。這樣的保守序列修飾包括核苷酸和胺基酸取代、添加和缺失。可通過本領域已知的標準技術如位點定向誘變和PCR介導的誘變引入修飾。保守胺基酸取代包括其中任何一個胺基酸殘基為具有類似側鏈的胺基酸殘基所取代。
在本發明中使用的表達載體並不特別受限。任何本領域眾所周知的表達載體皆可利用，包括例如帶有T7啟動子、T3啟動子或Sp6啟動子的pForexT載體、pUC載體、pBluescript載體、pET載體等。
可以本領域眾所周知的方法使用重組表達完成轉化體的製備。根據本發明，藉助於使用苯甲醛脫氫酶表達載體轉化的微生物將2-甲醯基-6-萘甲酸轉化為2，6-萘二甲酸。因此，優選轉化的微生物能以高水平表達苯甲醛脫氫酶。就pET-20b(+)載體來說，在T7啟動子控制下，結構基因的表達受調節，以便其可被異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(在下文中稱為「IPTG」)所誘導。
適合用於轉化體製備的宿主細胞是腸道菌群， 例如MC1061(大腸桿菌)、JM109(大腸桿菌)、XL1-Blue(大腸桿菌)和DH5α(大腸桿菌)。可使用熱激、電穿孔、顯微注射或粒子轟擊方法將表達載體導入宿主細胞，這些方法並不被解釋為限制本發明。
與此同時，可通過使用限制性內切酶消化或鹼基測序證實xylC基因克隆入表達載體中。
轉化體在25～45℃，優選在37℃的溫度下充分生長，然後在100ml的LB培養基中以1％(v/v)的量接種。當觀察到0.4～0.5的OD600時，以0.1～2.0mM，優選0.5mM的量添加IPTG以誘導苯甲醛脫氫酶表達，接著在37℃下溫育。應當注意到可以使用本領域已知的任何方法來實現轉化體生長和蛋白表達，而不受限於上述方法。
根據本發明，可通過藉助於其中苯甲醛脫氫酶以高水平表達的轉化的微生物將在粗萘二甲酸中含有的2-甲醯基-6-萘甲酸轉化為2，6-萘二甲酸，來純化粗萘二甲酸。
為了供轉化所用，將回收自培養物的轉化的微生物的生物質懸浮在生理鹽水中。
在所述酶存在下，在pH 6.0～10.0，優選在pH 8.0的緩衝液中，粗萘二甲酸中含有的2-甲醯基-6-萘甲酸到2，6-萘二甲酸的轉化得以發生。
可用於酶促轉化的緩衝液的例子包括碳酸鈉緩衝液(Na2CO3/NaHCO3)、甘氨酸緩衝液(甘氨酸/NaOH)、磷酸鉀緩衝液(KH2PO4/KOH、K2HPO4/KOH、KH2PO4/NaOH、K2HPO4/NaOH)、磷酸鈉緩衝液(Na2HPO4/NaH2PO4)、琥珀酸緩衝液(琥珀酸/NaOH)、醋酸鈉緩衝液(醋酸鈉/醋酸)、檸檬酸緩衝液(檸檬酸/檸檬酸鈉)、焦磷酸鈉緩衝液(Na4P2O7/HCl)、硼酸緩衝液(硼酸/NaOH)和四硼酸鈉緩衝液(四硼酸鈉/HCl)，根據酶活性，優選磷酸鹽緩衝液。
非強制性選擇地，可添加有機溶劑到酶反應中以便溶解cNDA。合適的有機溶劑的例子包括二甲亞碸(DMSO)、N，N-二甲基甲醯胺(DMF)、N，N-二甲基乙醯胺(DMA)和四氫呋喃(THF)，根據酶活性，優選5％DMSO。優選地，有機溶劑的量不超過反應物總重量的20％。
轉化優選在25～45℃，最優選在30℃下進行以使反應速率最優化。至於足以將2-甲醯基-6-萘甲酸轉化為2，6-萘二甲酸的反應時間，其在0.5～48小時內變動，優選0.5～24小時，更優選6小時。
轉化體XL1-Blue(pET20-xylC)接種在含有1,000ppm的cNDA和100mg/L的氨苄青黴素的LB培養基中，並在37℃下攪拌溫育足夠的時間。上清液的HPLC分析顯示表達的苯甲醛脫氫酶(xylC)除去了FNA，產生高純度的2，6-NDA。
通過以下實施例可獲得對本發明的更好理解，其在於說明，而不視為對本發明的限制。
實施例1xylC基因的克隆為了克隆編碼來自溶芳烴鞘氨醇單胞菌(KCTC 2888)的苯甲醛脫氫酶的xylC基因，首先，從其中分離出攜帶xylC基因的質粒(pNL1)(參見Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。對於PCR，使用分離的質粒DNA(pNL1)作為模板，基於公開的xylC的DNA鹼基序列(可獲得自GenBank序列資料庫，NC 002033)合成引物1，5′-GGAGAATTCATATGGCTACGCAGT-3′(SEQ ID NO2)和引物2，5′-GTCTTGCAGTGAGCTCGTTTCTCC-3′(SEQ ID NO3)。使用該組引物，用於克隆全長xylC基因的PCR起始於在94℃下預變性5分鐘，並進行在94℃變性溫度下1分鐘，在56℃退火溫度下1分鐘和在72℃延伸溫度下1.5分鐘的40個循環，最後在72℃下延伸額外10分鐘。由PCR反應，分離了約1.5kbp長的DNA片段，並用NdeI和SalI消化。將其插入已用相同的限制性內切酶切割的質粒pET-20b(+)中，以便構建如圖3所示的重組表達載體pET20-xylC。
實施例2克隆基因的分析為了對實施例1中克隆入重組載體(pET20-xylC)中的基因進行鹼基測序，基於兩個載體M13mp18和M13mp19的基因圖譜，使用不同的酶切割該重組載體。將這樣獲得的DNA片段亞克隆入M13mp18和M13mp19中，然後通過ABI PRISM BigDye引物循環-測序試劑盒(Perkin-Elmer，USA)，在AmpliTaq DNA聚合酶存在下進行鹼基測序分析。為了雙向讀出目的DNA的兩條鏈，部分合成核苷酸片段。通過與來自GenBank的鹼基序列比較，確定克隆的DNA是xylC基因。
實施例3製備表達BZDH的轉化體使用氯化鈣法(參見Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryManual第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)，用pET20-xylC載體轉化大腸桿菌XL1-Blue，並在補充有氨苄青黴素(100mg/L)、X-gal、IPTG和細菌培養用瓊脂(15g/L)的LB平板(酵母提取物，5g/L；Trypton，10g/L；NaCl，10g/L)上生長，以選擇轉化的大腸桿菌XL1-Blue(pET20-xylC)。
實施例4xylC基因的表達為研究xylC基因在轉化的微生物中的表達，在相同的條件下培養實施例3中獲得的轉化體XL1-Blue(pET20-xylC)和作為對照的野生型XL1-Blue，測定每種類型細菌所表達的苯甲醛脫氫酶的活性。在這點上，在各自的LB培養基中接種實施例3的轉化體和對照，在37℃下培養足夠的時間，然後以1％(v/v)的量置於100ml LB培養基中。當在600nm處的吸光度達到0.4～0.5時，添加0.5mM IPTG以誘導xylC表達，接著在37℃下溫育。
實施例5使用表達的BZDH將2-甲醯基-6-萘甲酸(FNA)轉化為2，6-萘二甲酸(NDA)通過離心實施例4中表達苯甲醛脫氫酶的微生物培養物回收細胞團塊，用0.85％生理鹽水洗滌並在30℃的容器中與表1的反應溶液溫育6小時，接著進行高效液相色譜(HPLC)分析。在表1的反應溶液中，緩衝液的pH設定在8.0，DMSO的濃度為5％，NDA中FNA的含量為9％。
下表2給出了分析結果。正如表2所看到的，在將FNA轉化為NDA的能力方面，轉化體XL1-Blue(pET20-xylC)遠勝於野生型。在表3所列條件下進行HPLC分析。
表1

表2

表3

工業實用性如上文所述，根據本發明製備的轉化體對於從粗萘二甲酸中除去2-甲醯基-6-萘甲酸是非常有效的。因此，本發明的方法可以經濟有利和環境友好的方式用於生產高純度的2，6-萘二甲酸，提供了高的工業實用性。
儘管業已披露本發明的優選實施方案作為說明的目的，但是本領域技術人員應當意識到不同的修飾、添加或替換是可能的，而不背離所附權利要求所披露的本發明的範圍和精神。
序列表110株式會社曉星120製備表達苯甲醛脫氫酶的轉化體及使用所述轉化體製備2，6-萘二甲酸的方法1603170Kopatentln 1.7121012111506212DNA213溶芳烴鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas aromaticivorans)4001atggctacgc agttgagaag tgcagaaaac gaatacggga tcaagtccga gtacggccac 60tatatcggcg gcgagtggat cgccggggac agcggcaaga ccatcgatct gctcaatccc120tcgaccggca aggtgctgac caagattcag gccggcaacg ccaaggatat cgaacgcgcg180attgccgccg ccaaggcggc gtttcccaag tggtcgcaga gcctgcccgg cgagcgccaa240gaaatcctga tcgaggttgc gcgtcgtctg aaggcacgcc attcgcacta tgccaccctc300gaaacgctca acaacggcaa gccgatgcgc gaatcgatgt atttcgatat gccgcagacg360atcgggcagt ttgagctgtt cgccggtgcc gcctatggcc tgcacggcca gacgctcgat420tatcccgacg cgatcggcat cgtccaccgc gaaccgctcg gcgtctgcgc gcagattatc480ccatggaacg tgccgatgtt gatgatggcg tgcaagatcg cgcccgcgct ggcctcgggc540aacactgtcg ttctgaagcc ggccgaaacg gtctgccttt cggtgattga attcttcgtg600gaaatggctg atctgttgcc gccgggtgtg atcaacgtcg tcaccggcta tggcgcggac660
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212DNA213溶芳烴鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas aromaticivorans)4003gtcttgcagt gagctcgttt ctcc2權利要求
1.一種製備表達苯甲醛脫氫酶的轉化體的方法，包括構建攜帶編碼來源於溶芳烴鞘氨醇單胞菌KCTC 2888的苯甲醛脫氫酶的SEQ ID NO1的基因(xylC)的重組表達載體；以及使用所述重組表達載體轉化宿主細胞。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述宿主細胞是腸道菌群。
3.一種通過權利要求1的方法製備的轉化體。
4.一種生產苯甲醛脫氫酶的方法，包括在25～45℃下培養權利要求3的轉化體；和以0.1～2.0mM的量添加IPTG到轉化體培養物中以誘導苯甲醛脫氫酶表達。
5.一種純化粗萘二甲酸的方法，包括將所述粗萘二甲酸與權利要求3的轉化體反應以將粗萘二甲酸中含有的2-甲醯基-6-萘甲酸轉化為2，6-萘二甲酸。
6.如權利要求5所述的方法，其中粗萘二甲酸與所述轉化體的反應在含有0～20％有機溶劑的緩衝溶液中進行，所述有機溶劑選自二甲亞碸、二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺和四氫呋喃。
7.如權利要求5所述的方法，其中反應在25～45℃下進行0.5～48小時。
8.如權利要求5所述的方法，其中粗萘二甲酸與所述轉化體在含有有機溶劑的緩衝溶液中反應，所述緩衝溶液是磷酸鉀溶液(KH2PO4/KOH、K2HPO4/KOH、KH2PO4/NaOH、K2HPO4/NaOH)，pH在6.0～10.0範圍內。
全文摘要
在此披露的是一種製備轉化體的方法，所述轉化體攜帶編碼來源於溶芳烴鞘氨醇單胞菌KCTC 2888的苯甲醛脫氫酶的基因並表達所述酶，還披露了通過應用所述轉化體將FNA轉化為萘二甲酸所實現的粗萘二甲酸的生物學純化，所述粗萘二甲酸通過2，6－二甲基萘的氧化得到，並伴生有2－甲醯基－6－萘甲酸。
文檔編號C12N15/09GK101084313SQ200580044056
公開日2007年12月5日 申請日期2005年12月23日 優先權日2004年12月30日
發明者李種桓, 崔龍福 申請人:株式會社曉星