水葫蘆生防真菌——鳳眼蓮鏈格孢的製作方法

2023-05-29 11:14:01 2

專利名稱：水葫蘆生防真菌——鳳眼蓮鏈格孢的製作方法
技術領域：
本發明涉及雜草的生物控制及微生物領域，特別是涉及一種水葫蘆生防真菌——鳳眼 蓮鏈格孢"Jtaraarz'a c_ras\s7》es0 。
背景技術：
水葫蘆(&c力/w/77ia cr3sw》a9)，又名水浮蓮，原產於南美，是世界十大害草之一， 也是侵入我國的最重要有害物種之一，已在我國17個省、市、自治區泛濫成災，其危害最 嚴重為浙江、福建、廣東、雲南和臺灣五省，主要是引起江河湖澤水庫等水域的汙染和阻 塞，阻礙水路交通運輸和幹擾水電站的正常運行，每年造成巨大的經濟損失。
目前，國內外對水葫戸主要採用人工打撈控制和化學除草劑防除，雖有一定成效，但 兩種措施的防除效果都非常有限，打撈僅能清除水葫蘆植株，留在水體中的種子仍能萌發 並很快形成新的雜草株群；而使用化學除草劑殺死雜草後，植株殘體可使水體有機化而造 成環境汙染，化學製劑本身也存在著藥物殘留和非靶標生物安全等環境汙染問題。因此， 近年來人們開展了對雜草的生物控制的探索，20世紀60年代，在研究利用水葫蘆象甲等草 食性昆蟲的同時，不少國家對水葫蘆病原菌也作了大量的調査研究工作，並且已經取得一 定的進展全世界已經報導了60多種侵染水葫蘆的病原真菌，在南非等國家已經篩選到的 諾曼尼尾孢(Cercos^ora i^Qfea^'i)和zR葫聲鏈格孢C4"e/77a_r_z'a eic/ / or/n'ae)對水葫盧 具有較強的抑制作用，其中諾曼尼尾孢防除水葫蘆的技術已獲國際專利保護，但是這種病 原菌對雜草的控制效果及應用範圍都相當有限，還未見其在其他國家或地區被應用的報 道。
我國也曾有人對水葫戸病害及病原真菌進行調査和研究，發現的水葫蘆致病真菌主要 有細極鏈格孢C^er/7ari3 te/7"i5"57-鵬)、尖孢尾孢(^7sofe5"/ ori湖0^7邵arww)、阿氏擬 盤多毛孢(屍e"a〗ot/c^sis so^sta) 、 7K葫戸單孢Oo/70spo2"j'LM e/c/ 力oi77iae)禾卩瓜亡革菌 (77 a朋tep/ or^ women's)等，但這些真菌對水葫蘆的致病作用都非常有限，沒有實際 應用價值，迄今也還沒有關於這些病菌的進一步研究和應用的詳細報導。
因此，尋求對水葫蘆有強致病性和生防控制作用的病原微生物，由此進一步研製無殘 留、不汙染環境的生物除草劑，將不僅具有重要的商業開發應用價值，而且能安全有效地 控制水葫蘆的危害，以避免由此造成的巨大經濟損失。

發明內容
本發明的目的是提供一種對水葫蘆有很強致病作用和控制效果的殺草真菌——鳳眼 蓮鏈格孢菌株。根據形態學特徵將其定為一個鏈格孢新種，通過試驗測定確定了它生長產 孢和侵染致病的最適條件，研究發現其通過產生毒素使雜草植株發病死亡的致病機理，分 析了病菌及其毒素的寄主專化性。
本發明目的是通過以下技術方案來實現的-
本發明的鳳眼蓮鏈格孢殺草菌株通過以下步驟分離純化而來-
在重慶地區不同季節多次採集水葫蘆自然發病植株，採用馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基 (PSA)，經室內組織培養和純化得到不同類型的真菌，用柯赫氏證病方法確定其中的致病 菌，最後經過致病性試驗比較篩選獲得對水葫蘆有很強致病作用的殺草病原真菌(AFTOOl
菌株)。
本發明的鳳眼蓮鏈格孢菌株已於2008年7月3日保藏於中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心(北京市朝陽區大屯路，郵編100101)，保藏號CGMCCN0.2569。 以下是鳳眼蓮鏈格孢的詳細描述
鳳眼蓮鏈格孢殺草菌株的形態特徵與分類鑑定在PSA培養基上菌落生長速度很快， 在25'C下全光照與全黑暗培養5d菌落直徑均可達到約70mm。菌絲部分埋生，部分表生， 氣生菌絲絨毛狀，菌落初為青綠色後漸變為黑灰色，背面黑綠色。分生孢子鏈生， 一般7 12個孢子，倒棒狀，卵形，倒梨形或近橢圓形，淡褐色至中度褐色，孢身24.7(12.5 37.5) X10. 1(7.5 12.5) Mm，具短喙或無喙，0 30 X 2.5-4nm。成熟孢子表面具小疣 突，具l 3個橫隔，0 4個縱隔，除頂端次生產孢外，常見於側面的任何部位產生短梗。 分生孢子梗直立，直或略彎，分隔，不分枝或分枝，極淡的褐色至淡褐色，隨著產孢作合 軸式(syrapodial)延伸，高倍鏡下可見表面生細疣突，23.5 70. 5 X 3.5 5um。根據 這些特徵，參考有關真菌及鏈格孢屬鑑定的文獻資料(如張天宇，2003中國真菌志—— 鏈格孢屬，科學出版社;http:〃www.doctorfungus.org/)鑑定，該菌為鏈格孢屬中細極鏈 格孢組"7ter朋/a te/7"i'sw'腿group)的一新個成員(member)，將其命名為鳳眼蓮鏈格孢， 拉丁學名為/^ter/7ar/acrs, w'pes。這是真菌分類學上的一個新種，其依據主要有1)査 閱現有鐮刀菌屬的相關分類文獻和其他參考資料，這種鏈格孢的形態特徵與其他種類有明 顯差異；這一點經國際鏈格孢屬真菌分類權威專家、山東農業大學的張天宇教授驗證；2) 在水葫蘆植物上迄今己經記載的病原鏈格孢菌有2種，即交鏈孢C^ter朋r2'a Wtema") 水葫蘆鏈格孢(力Ae/77ar^ e/c力/w/77/s),它們的分生孢子等結構的形態與該種鏈格孢區別很大，而且交鏈孢為一種弱寄生菌，其導致的病害症狀非常輕微，水葫蘆鏈格孢主要引起 一種"黑斑病"，症狀與本鏈格孢引起的"葉斑病"有根本性差別(Charudattan R ，2001. Biological control of water hyacinth by using pathogens, ACIAR Proceedings 102， 21-28; Shabana， YM et al, Biological control of water hyacinth by mycoherbicide in Egypt. ACIAR Proceedings 102' 53-56)。
鳳眼蓮鏈格孢的最佳培養和侵染條件該致病真菌在正常光照和黑暗條件下不容易產 孢，而在紫外光照射下產孢較快；菌落生長最適培養基為馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)，最適溫 度25-30。C，最適酸鹼度為pH7.0 10;病菌侵染致病的最佳條件是接種後保溼和暗光24 小時，並在整個侵染期保持溫度28 30。C。
鳳眼蓮鏈格孢的致病性和專化性鳳眼蓮鏈格孢對水葫蘆有良好的致病和生長抑制作 用，主要侵染植株葉片，接種後7天即可發病，病葉率達100%，初期葉片上出現大小不等 的圓形至不規則病斑，以後擴展至葉柄，病斑正反兩面著生灰褐色黴層，導致大面積葉片 甚至整個植株枯死。在適宜條件下用高濃度菌絲片段和分生孢子懸浮液接種試驗結果表 明，該真菌對水稻、小麥、玉米、豌豆、油菜、辣椒、番茄、棉花等重要作物在內的6科 16種水、旱作物都不致病，也不影響它們的種子萌發和植株生長，這說明鳳眼蓮鏈格孢是 水葫蘆的專性致病菌，若用於研製水葫蘆除草劑，可以保證生境中其它植物的安全。
鳳眼蓮鏈格孢粗毒素用真菌的培養液，經過乙酸乙酯萃取、旋轉蒸發器真空蒸餾得 到致病毒素。用該毒素的水液分別浸漬水葫蘆葉片和植株根系後24小時內即表現毒性症 狀，72小時內葉片黃化、植株萎蔫(但不退綠)。用此粗毒素溶液處理前述20種植物的種 子和植株後未觀察到毒性症狀，說明這種毒素也是高度專化的。


圖1為鳳眼蓮鏈格孢的形態特徵圖
1為PSA平板上的菌落初期，2為PSA平板上的菌落後期，3為分生孢子鏈，4為分生 孢子，5為分生孢子類型圖，6為分生孢子梗
圖2為鳳眼蓮鏈格孢及其毒素對水葫蘆的致病作用圖
7為用菌體處理第15天的水葫蘆植株，8為用菌體處理第15天的水葫蘆葉片，9、 10 為用毒素處理第3天的葉片和對照，11、 12為用毒素處理第3天的植株和對照。
本發明的優點是從自然環境中分離獲得的鳳眼蓮鏈格孢"7te277an'a crawipes)， 是首次發現並鑑定的一個真菌新種，其菌絲片斷和分生孢子接種體對世界十大惡性雜草水 葫戸(^/c力/wr/n'a crssw'pes)具有很強的致病控制作用，它分泌的毒素對這種雜草也具有很強的毒性致死功效。病菌的菌劑和毒素對重要作物及環境中其它植株都沒有不良影響， 表現出高度的專化殺草活性，可通過發酵菌體或仿生合成技術生產無殘留的環保型真菌性 除草劑，具有潛在的商業開發和應用價值，特別是在水葫蘆的生物防治實踐中具有重要的 開發應用前景。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步描述 實施例1:
病原菌的分離純化與篩選
(1) 真菌分離培養用馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基(PSA)，其配方是去皮的新鮮馬鈴薯200g， 蔗糖和瓊脂各20g，加自來水至lOOOml。先加水將馬鈴薯煮爛，雙層紗布過濾後加入蔗糖 和瓊脂，補充適量的水至1000ml，充分攪和均勻後裝入三角瓶中，放入消毒器中滅菌後放 置。使用前加熱熔融，倒入滅菌培養皿或試管中製成平板或斜面培養基，供真菌分離培養 或菌種保存用。
(2) 分離培養和純化從自然條件下採集具有典型病害症狀的水葫蘆植株樣品，漂 洗乾淨後剪取葉片病斑與健康部分交界的組織小塊兒(2 mm),放入5%次氯酸鈉溶液中表面 消毒以後用滅菌水漂洗3次，置於PSA平板中，在25"C溫箱中培養並每天觀察，待不同菌 落長出後適時分別割取菌絲先端，轉移到新的PSA平板上繼續培養成純的菌落，再轉移到 PSA試管斜面培養基上，並編號標明菌株，保存備用。
(3) 確定病原菌根據柯赫氏證病律步驟確定病原菌。用病葉組織分離純化後獲得 各種真菌給健康水葫戸植株葉片塗抹或針刺點滴接種，保證避光保溼24小時，在28。C下 生長，觀察發病情況。引起接種葉片發病、表現相同症狀的真菌即可確定為病原菌。
(4) 強致病菌篩選將上述試驗確定所有病原菌相同的方法(塗抹霧或針刺點滴)給 水葫盧植株接種，並在相同適宜條件下培養觀察接種植株上病害的嚴重程度，比較篩選出 引起水葫蘆發病嚴重的菌株，由此篩選獲得了鳳眼蓮鏈格孢。
實施例2:
病原菌的培養和接種條件試驗 (2)溫度試驗在培養5d的PDA平板上用打孔器取直徑為0. 5cm的AFT001菌株的 菌絲塊，接種於PDA培養基上，分別設5°C 、 10°C 、 15°C 、 20°C 、 25°C 、 30°C 、 35°C和40±0. 5°C 8個溫度處理，每個處理重複3次。置於8個預先設定好所需溫度的光照培養箱中培養， 並用垂直十字法逐日測量菌落大小，每24h測量l次，連續測量5次，記錄數據。PDA培養基的酸鹼度約為pH7. 0。由此確定鏈格孢菌的最適生長溫度。
(2) 酸鹼度實驗實驗採用PDA培養基，共設置11個酸鹼度處理。分別用1. 0 mol/L 的Na0H和HCl溶液將培養基的pH值分別調節到4.0、 5.0、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 9.0、 10.0、 11.0和12.0 (用電子pH計測定)，每個處理重複5次；病菌接種和生長測量 方法同上，接菌處理後置於25'C下培養，每24h測量一次菌落直徑，連續測量6次。由此 確定鏈格孢生長的最佳pH值。
(3) 培養基種類的篩選實驗共比較了 8種培養基對AFT001菌麥生長的影響，分別 為WA、 CAA、 PSA、 PDA、水葫戸葉片煎汁培養基(WLA)、燕麥片培養基(OSA)、 WLA+PDA和 WLA+PSA。病菌接種和生長測量方法同前述實例。各種培養基的酸鹼度約為pH7. 0，培養溫 度為25'C。由此確定病菌培養的最佳培養基。
(4) 光照對產孢量的影響試驗將長勢良好的AFT001菌株接種於PCA(馬鈴薯20g， 胡蘿蔔20g，瓊脂20g)培養基上，在近紫外燈(NUV)、日光燈(DL)和黑暗條件下培養20d， 每個處理重複3次。收集孢子計數，方法如下在培養基上加入lml的無菌水，用蓋玻片 輕刮培養基表面。然後將孢子懸液用100目的網篩過濾，取濾得的孢子液鏡檢，用血球計 數板計數。比較不同光照培養條件對產孢的影響，確定有利於病菌產孢的光源。
(5) 病菌接種條件優化 一般影響植物病原真菌侵染的影子主要有溫度、保溼時間 和光照。本發明中根據前述鳳眼蓮鏈格孢的最佳生長條件設置了位於20 30'C間的5個溫 度，保溼(％)時間0、 12、 24、 32和48h，光照設置為1200Lux， 3000Lux下照射0、 6、 12、 18和24h。每個溫度處理3株水葫戸，每株5-6個葉片。由此分析確定病菌的適宜接種發 病條件(溫度、保溼時間和光照)。
實施例3: 病原菌粗毒素分離
(1) 病菌培養濾液的準備在500ml三角瓶中分別倒入250ml馬鈴薯蔗糖(PS)培養 液，滅菌後待用。選取培養6 7d長勢良好的菌落，用打孔器取0)6mra大小的菌餅，接種 到裝有250mlPS培養液的三角瓶中，每瓶接種8片，在25"C培養箱中12h光照/天條件下 靜止培養20天。在超淨工作檯上，用定性濾紙(中速)過濾，即可得到培養濾液。由此準 備足夠的病菌培養濾液供毒素分離提取之用。
(2) 毒素的萃取及活性試驗選擇極性不同的有機溶劑石油醚、氯仿、苯酚和乙酸 乙酯等分別對培養濾液進行萃取，方法是將一定體積的培養濾液用等體積的有機溶劑萃 取3次，然後合併有機相，用旋轉蒸發儀蒸發濃縮，回收有機溶劑。將每種有機溶劑萃取
7的濃縮物用水溶解後用作對水葫蘆葉片浸漬處理，測定其活性。結果用乙酸乙酯萃取後的濃縮產物溶液對水葫蘆表現出很強的毒性。實施例4:
病原菌及其毒素的安全(專化)性測定
(1) 供測試的作物選擇了6個科的20種重要水旱作物，包括禾本科的水稻、小麥、玉米，茄科的番茄、辣椒和菸草，葫蘆科的黃瓜和西瓜，十字花科的蘿蔔、甘藍、油菜和白菜，豆科的花生、豌豆、蠶豆、大豆和綠豆，以及錦葵科的棉花。
(2) 種子萌發試驗選擇前述20種作物的健康種子，分別用菌絲和孢子懸浮液、病
菌粗毒素溶液和清水(對照)浸泡12 36小時(小粒種子處理時間短，大粒種子處理時間長)，放置在溼濾紙上，在25°C生長箱中萌發後記載種子萌發率。結果表明所測試的作物種子萌發率與對照都沒有顯著差異。
(3)作物植株生長試驗用溫水浸泡12 36h (根據種子大小而定)，放置在溼濾紙上，在25"C生長箱中催芽。待胚芽露出後播種到盆栽缽中。缽內加入經過水洗和高溫烘乾的沙土，然後加入一定量營養液(水中加入適量的尿素、硫酸銨和磷酸鉀)。播種後在溫室條件下生長，待植株長到適當大小時分別用菌絲和孢子懸浮液、病菌粗毒素溶液和清水(對照)噴霧處理，同時以處理水葫蘆植株為發病對照。處理後每天觀察記錄各種植物的病變情況，到第20天時收穫植株，測定不同處理的生長量。結果表明，用鏈格孢菌液和毒素液處理後水葫蘆植株分別在處理後第7天和第2天即表現出明顯的病害和毒素症狀，而所有20種作物植株在處理20天後也沒有任何病變，用菌液和毒素液處理後的植株生長量與清水對照植株的生長量之間沒有顯著差異。這說明病菌及其毒素對供試作物沒有任何不良影響。
權利要求
1、一種水葫蘆生防真菌——鳳眼蓮鏈格孢(Alternaria crassipes)，其特徵在於菌株為AFT001，該菌株的保藏號為CGMCC NO.2569。
全文摘要
一種水葫蘆生防真菌——鳳眼蓮鏈格孢(Alternaria crassipes)，從自然環境中分離獲得，該菌在紫外光照射下易於產孢，菌落生長最適培養基為馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)，最適溫度25～30℃，最適pH7.0～10；病菌侵染致病的最適條件是接種後暗光保溼24h和侵染期間保持28～30℃。其菌體製劑和毒素液對惡性雜草水葫蘆具有很強的致病殺草作用，經發酵菌體或毒素仿生合成技術可生產環保型真菌除草劑，具有潛在的商業開發應用價值。用真菌培養液經乙酸乙酯萃取、減壓蒸發得到致病粗毒素。該菌菌體懸浮液及其毒素液對水稻等20種重要作物都沒有不良影響。
文檔編號C12N1/14GK101508959SQ200810237208
公開日2009年8月19日 申請日期2008年12月23日 優先權日2008年12月23日
發明者君 周, 唐秀麗, 孫現超, 殷利利, 王利軍, 羅化東, 譚萬忠 申請人:西南大學