一種經血源性子宮內膜幹細胞的分離提取方法與流程

2023-05-28 19:47:31 2

本發明涉及一種子宮內膜幹細胞的分離提取方法，特別是涉及一種經血源性子宮內膜幹細胞的分離提取方法。
背景技術：
：近年來，細胞療法的興起激發了對各種幹細胞的研究熱潮，而存在於骨髓、臍帶、臍帶血、脂肪、經血等多種成體組織中的成體幹細胞(AdultStemCells，ASCs)，不僅克服了胚胎幹細胞取材難、分化不確定及倫理問題等限制，同時能保持高效增殖能力和多向分化潛能，為細胞治療提供了良好的種子細胞。子宮作為人體中具有超強再生能力的器官，其子宮內膜在每個月經周期中會增長約5～7mm，而以這種增長速率，子宮內膜會在婦女育齡期經過500次左右有規律的脫落和再生過程，這不僅表明經血源性子宮內膜幹細胞(Menstrualblood-derivedEndometriumStemCells，MenESCs)的來源豐富，同時也暗示MenESCs具有較強的增殖活性。作為ASCs家族的重要成員，MenESCs除表達CD29(>99％)、CD44(>99％)、CD73(>99％)、CD90(>95％)及CD105(>99％)等ASCs表面標誌物外，同時表達多向分化潛能標誌物Oct-4、SSEA-4、Sox-2及Nanog，暗示MenESCs具有較高分化潛能。此外，相較於骨髓間充質幹細胞(BMSCs)和臍帶血來源的ASCs等，MenESCs不僅具有更佳的增殖活性，同時亦具有較強的遺傳穩定性(傳至68代時核型無畸變)。同時，研究表明，MenESCs不表達MHCΙΙ類受體，微量表達MHCΙ類受體，暗示MenESCs具有較低的免疫原性。因此，MenESCs一經報導，憑藉其來源豐富、無創傷的分離方式以及較高的增殖活性和分化潛能等方面的優勢，獲得了國內外的廣泛關注。在臨床應用MenESCs的安全性獲得保障的前提下，其已在成骨、心肌、肝臟、子宮內膜及中風等疾病的治療過程中展示了令人滿意的效果。目前，從經血樣本中分離提取MenESCs的方法主要是依賴Ficoll淋巴細胞分離液，通過密度梯度離心後收集白膜層中的有核細胞，進一步洗滌後進行後續培養。雖然利用該方法可成功分離提取MenESCs，但仍然存在以下不足：首先，分離MenESCs時所用的Ficoll淋巴細胞分離液主要有葡聚糖和泛影酸鈉組成，其密度為1.077±0.0001g/mL，可分離比人淋巴細胞密度小的單個核細胞。在使用過程中，如果所需分離的標本量較少，使用細胞分離液能形成較好的單核細胞層，也方便收集；但如果需要分離的標本量較多，不但分離液使用量大，且離心後部分紅細胞仍然懸浮在分離液中，致使收集細胞中混雜較多紅細胞，而紅細胞層內也混雜有核細胞，致使細胞收率較低。對於捐獻者在一個月經周期中可收集到的經血樣本超過50mL，等比例稀釋到保存液中後超過100mL，完全通過密度梯度離心不僅會消耗掉大量淋巴細胞分離液，增加操作的經濟和時間成本，同時由於樣本量較多，勢必會降低MenESCs的收率，而較長時間的離心對細胞活性的損傷較多。其次，經血樣本相比外周血樣本較為複雜，存在較多粘液物質及大量血凝塊，在密度梯度離心後不僅可見明顯的白膜層，同時可見大量懸浮的脫落子宮內膜碎片。實驗發現，懸浮的脫落子宮內膜碎片中含有大量的MenESCs，而許多脫落的子宮內膜碎片由於與血液形成血凝塊，因此通過密度梯度分離後會與血細胞沉澱在離心管最底層，從而降低了MenESCs的收率。技術實現要素：基於此，本發明的目的在於，提供一種經血源性子宮內膜幹細胞的分離提取方法，其能夠快速、有效地分離提取經血源性子宮內膜幹細胞，而且操作簡單，細胞收率高，細胞活性的損傷少。一種經血源性子宮內膜幹細胞的分離提取方法，包括以下步驟：1)取經血樣本，加入樣本保存液混勻，然後進行離心，收集沉澱物；2)將步驟1)得到的沉澱物加入紅細胞裂解液中，混勻後靜置進行裂解，然後進行離心，收集沉澱物；3)將步驟2)得到的沉澱物用細胞培養基重懸，然後進行細胞培養，收集培養獲得的細胞，即為所述的經血源性子宮內膜幹細胞(MenESCs)。優選地，所述的樣本保存液為含有50～150U/mL青黴素、0.8～1.2mg/mL鏈黴素、0.05～0.1mg/mL兩性黴素B和0.2～0.5mg/mLEDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)的PBS緩衝液。更優選地，所述的樣本保存液為含有100U/mL青黴素、1mg/mL鏈黴素、0.1mg/mL兩性黴素B和0.3mg/mLEDTA-Na2的PBS緩衝液。優選地，所述的紅細胞裂解液為含有120～180mmol/LNH4Cl、5～15mmol/LKHCO3和0.05～0.15mmol/LEDTA-Na2的水溶液。更優選地，所述的紅細胞裂解液為含有150mmol/LNH4Cl、10mmol/LKHCO3和0.1mmol/LEDTA-Na2的水溶液。優選地，所述的紅細胞裂解液的pH值為7.2～7.4，優選為7.2。優選地，所述的細胞培養基為含有10％胎牛血清的DMEM高糖培養基。優選地，在步驟1)中，經血樣本與樣本保存液的用量體積比為1:1～1:3；離心的轉速為1200～1500rpm，離心的時間為5～10分鐘。優選地，在步驟2)中，紅細胞裂解液與經血樣本的用量體積比為1:2～1:3；裂解的時間為5～10分鐘；離心的轉速為1200～1500rpm，離心的時間為5～10分鐘。優選地，在步驟3)中，所述細胞培養的接種密度為5～10×104cells/cm2；所述的細胞培養是在37℃、5％CO2的細胞培養箱中進行培養。優選地，在步驟3)中，所述的細胞培養是將步驟2)得到的沉澱物用細胞培養基重懸後，在37℃、5％CO2的細胞培養箱中培養2天，用PBS緩衝液洗掉未貼壁的細胞，再加入細胞培養基繼續培養，此後每隔3天更換一次細胞培養基，直至細胞融合至80％後進行傳代。本發明所述的經血源性子宮內膜幹細胞的分離提取方法，通過採用所述的紅細胞裂解液對經血樣本進行裂解，可最大限度地保留子宮內膜，能夠顯著提高目標細胞的收率；同時，該分離提取過程的離心轉速低(僅需1200～1500rpm)、時間短(僅需5～10分鐘)，能夠顯著降低對細胞活性的損傷。本發明的分離提取方法無需淋巴細胞分離液，無需採用密度差異來分離提取有核細胞，避免了使用淋巴細胞分離液所必需的1800rpm下離心20分鐘的高速離心過程，因而能夠有效減少高速離心對細胞造成的機械損傷。本發明的分離提取方法操作簡單，能夠快速、有效地分離提取得到所述的經血源性子宮內膜幹細胞，降低經濟和時間成本。本發明的分離提取方法所採用的樣本保存液，通過加入EDTA-Na2，能夠有效發揮抗凝血的作用，並且通過青黴素、鏈黴素和兩性黴素B的聯合使用，能夠有效發揮抗細菌、抗真菌作用，且不會影響MenESCs的細胞活性。EDTA-Na2可與經血樣本中的鈣離子結合成螯合物，使鈣離子失去凝血作用，從而阻止血液凝固，避免經血樣本凝固對MenESCs分離造成影響；青黴素、鏈黴素具有良好的殺菌、抑菌作用，而兩性黴素B對樣本收集部位(陰道)所存在真菌具有較強的殺菌、抑菌作用，三者聯合使用具有更強、更廣譜的抗菌作用。本發明的分離提取方法所採用的紅細胞裂解液，通過NH4Cl、KHCO3和EDTA-Na2的合理搭配，能夠形成良好的低滲環境，使無核的紅細胞吸水膨脹裂解，但對有核細胞的影響較小，且裂解作用柔和，可最大限度保護有核細胞的活性。該紅細胞裂解液與經血樣本的用量體積比優選為1:2～1:3，裂解時間優選為5～10分鐘，既能保證無核細胞的有效裂解，又能最大限度保護有核細胞的活性。本發明的紅細胞裂解液中，NH4+離子無法透過細胞膜，Cl-離子和HCO3-離子則可跨膜進入細胞內，提高細胞內離子濃度，在溶液中形成低滲環境，同時EDTA通過螯合Mg2+和Ca2+可降低細胞膜穩定性，由於紅細胞缺乏細胞核，其細胞骨架結構相對於有核細胞較為脆弱，對膨脹耐受力差，在上述低滲環境中通過低滲作用吸水破裂，發生溶血，而低滲環境對MenESCs等有核細胞的影響較小。本發明的紅細胞裂解液，通過NH4Cl、KHCO3和EDTA-Na2濃度的嚴格控制，能夠保證紅細胞徹底裂解，同時保證不會損害甚至裂解MenESCs等有核細胞。本發明的分離提取方法中，優選採用含10％胎牛血清的DMEM高糖培養基作為細胞培養基，DMEM培養基更適合MenESCs細胞的生長，高糖成分能夠給MenESCs細胞的體外增殖提供充足的能量來源，而胎牛血清能夠為MenESCs細胞的生長提供豐富的營養因子，從而確保MenESCs細胞的規模化培養。附圖說明圖1為MenESCs細胞成脂、成骨、成軟骨誘導分化檢測圖。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。實施例一：採集經血樣本樣本保存液的配製：取PBS緩衝液，分別加入終濃度為100U/mL的青黴素、終濃度為1mg/mL的鏈黴素、終濃度為0.1mg/mL的兩性黴素B及終濃度為0.3mg/mL的EDTA-Na2，充分混合均勻。招募處於月經周期前3天的健康女性志願者10名，分別收集其經血樣本各5～15mL，然後將各經血樣本分別轉移至預先裝有15mL樣品保存液的50mL離心管中，擰緊管蓋後上下顛倒充分混勻，得到經血樣品保存液10份。將各經血樣品保存液置於4℃下保存，在48小時內完成MenESCs的分離提取。實施例二：採用本發明的方法(紅細胞裂解法)分離提取MenESCs紅細胞裂解液的配製：在純化水中，分別加入終濃度為150mmol/L的NH4Cl、終濃度為10mmol/L的KHCO3及終濃度為0.1mmol/L的EDTA-Na2，充分混合均勻後，調節pH值至7.2。取實施例一製得的經血樣品保存液10mL，轉移至15mL無菌離心管中，以1500rpm的轉速離心5分鐘，棄上清液，收集沉澱物。取15mL無菌離心管，加入10mL紅細胞裂解液，將沉澱物加入紅細胞裂解液中，充分吹打混勻後，在室溫下靜置裂解5分鐘，然後以1200rpm的轉速離心5分鐘，棄上清液，收集有核細胞及子宮內膜沉澱物。將有核細胞及子宮內膜沉澱物用PBS緩衝液洗滌2次後，加入5mL含有10％胎牛血清的DMEM高糖培養基重懸，調整細胞密度，以5～10×104cells/cm2接種細胞培養瓶，在37℃、5％CO2的細胞培養箱中培養2天，然後用PBS緩衝液洗掉未貼壁的細胞，再加入培養基繼續培養，此後每隔3天更換一次培養基，直至細胞融合至80％左右，然後用0.25％的胰酶消化，傳代。收集培養獲得的細胞，即為所述的經血源性子宮內膜幹細胞(MenESCs)。實施例三：採用傳統方法(密度梯度離心法)分離提取MenESCs取實施例一製得的經血樣品保存液10mL，緩慢加入到10mLFicoll淋巴細胞分離液中，以1800rpm的轉速水平離心25分鐘，得到4層分離液，小心除去最上層的分離液，將中間的白膜層物質及懸浮的子宮內膜碎片轉移至15mL無菌離心管中，用PBS緩衝液洗滌2次後，加入5mL含有10％胎牛血清的DMEM高糖培養基重懸，調整細胞密度，以5～10×104cells/cm2接種細胞培養瓶，在37℃、5％CO2的細胞培養箱中培養2天，然後用PBS緩衝液洗掉未貼壁的細胞，再加入培養基繼續培養，此後每隔3天更換一次培養基，直至細胞融合至80％左右，用0.25％的胰酶消化，傳代。收集培養獲得的細胞，即為所述的經血源性子宮內膜幹細胞(MenESCs)。實施例四：MenESCs細胞收率測定取實施例一製得的經血樣品保存液20mL，平均分為2份，每份10mL，分別採用本發明的紅細胞裂解法(實施例二)以及傳統的密度梯度離心法(實施例三)分離獲得原代經血源性子宮內膜幹細胞(MenESCs)，然後分別加入6mL含有10％胎牛血清的DMEM高糖培養基重懸，並接種於6孔細胞培養板中，上述兩種方法所獲得的細胞各接種3孔。將細胞培養板置於37℃、5％CO2的細胞培養箱中培養2天，然後用PBS緩衝液洗掉未貼壁的細胞，再加入培養基繼續培養，繼續培養3天後用4％多聚甲醛固定。經常規結晶紫染色後，分別計算通過上述兩種方法所獲得的原代MenESCs細胞克隆數，測定結果如下表1所示。表1MenESC細胞收率測定結果樣本細胞克隆數紅細胞裂解法63±11個/孔密度梯度離心法38±9個/孔測定結果表明，採用本發明的紅細胞裂解法所獲得的原代MenESCs細胞克隆數顯著高於採用傳統密度梯度離心法所獲得的原代MenESCs細胞克隆數，證明本發明的紅細胞裂解法能夠顯著增加MenESCs細胞收率，有效提高經血樣本的利用率。實施例五：MenESCs表面標誌物檢測分別取實施例二、實施例三所獲得的P3代MenESCs細胞懸液，調整細胞密度至1×106cells/ml。取實施例二、實施例三的細胞懸液各100μL，分別加入單克隆流式抗體CD29-FITC、CD44-FITC、CD73-FITC、CD90-FITC、CD105-PE、CD34-FITC、CD45-FITC、HLA-ABC-FITC及HLA-DR-FITC，混勻後於4℃避光孵育30分鐘，然後用PBS緩衝液洗滌2次，再加入培養基重懸。然後分別用流式細胞儀檢測實施例二、實施例三的細胞表面標誌物表達情況，檢測結果如下表2所示。表2MenESCs表面標誌物檢測結果測定結果表明，採用本發明的紅細胞裂解法和傳統的密度梯度離心法所獲得的MenESCs細胞表面標誌物的表達，均符合國內外對成體幹細胞表面標誌物表達的要求，表明上述兩種方法均可成功分離獲得MenESCs，且二者之間在表面標誌物表達陽性率上沒有顯著性差異。實施例六：MenESCs細胞成脂、成骨及成軟骨誘導分化檢測分別取實施例二、實施例三所獲得的P3代MenESCs細胞懸液，以1×104cells/cm2的密度分別接種於12孔培養板中進行培養，待細胞融合達50％，分別進行成脂、成骨、成軟骨誘導及鑑定。成脂誘導培養：採用DMEM高糖培養基，加入5％胎牛血清、1μmol/L地塞米松、200μmol/L吲哚美辛、0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、10μmol/L胰島素；每隔3天更換一次培養基，誘導培養21天。成骨誘導培養：採用DMEM高糖培養基，加入5％胎牛血清、0.1μmol/L地塞米松、50μmol/L左旋抗壞血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉；每隔3天更換一次培養基，誘導培養21天。成軟骨誘導培養：採用DMEM高糖培養基，加入5％胎牛血清、0.1μmol/L地塞米松、0.2mmol/L左旋抗壞血酸、1％胰島素-轉鐵蛋白-硒酸鈉、10ng/mL轉化生長因子-β3；每隔3天更換一次培養基，誘導培養21天。誘導培養結束後，分別用PBS緩衝液洗滌2次，然後用4％多聚甲醛固定30分鐘，再用PBS緩衝液洗滌3次。成脂、成骨、成軟骨誘導培養的細胞分別用油紅O、茜素紅、阿爾新藍染色，然後置於倒置顯微鏡下觀察，結果如圖1所示。圖1的檢測結果表明，採用本發明的紅細胞裂解法和傳統的密度梯度離心法所獲得的MenESCs細胞，均具有多向分化潛能，可在特定誘導培養基的誘導下向成脂、成骨和成軟骨方向分化，符合國內外對成體幹細胞多向分化潛能的要求，表明上述兩種方法均可成功分離獲得MenESCs細胞。以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但並不能因此而理解為對發明專利範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬於本發明的保護範圍。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp