一種同步檢測三種魚病病毒的試劑盒及其檢測方法
2023-05-29 07:41:36 2
專利名稱：一種同步檢測三種魚病病毒的試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種水生動物特別是魚類病毒的檢測用試劑盒，特別是一種同步檢測魚傳染性造血器官壞死症病毒、傳染性胰臟壞死症病毒和病毒性出血性敗血症病毒的試劑盒，本發明還涉及前述同步檢測的檢測方法。
背景技術：
病毒性出血性敗血症病毒(VHSV)、傳染性胰臟壞死症病毒(IPNV)和魚傳染性造血器官壞死症病毒(IHNV)是同被列為《中華人民共和國進境動物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》的二類傳染病，VHS和IHN分別是《中華人民共和國動物防疫法》規定的二類和三類疫病，這三種是國際獸疫局OIE名錄中的疾病。IHN和VHS病毒均屬於彈狀病毒科單鏈RNA病毒，IHN病毒引起鮭科多種魚的致死性疾病，通過汙染的水、飼料和糞便等傳播，幼魚和魚苗死亡率可達100％，成魚感染可終身帶毒並散毒，VHS病毒可引起各種年齡的鮭科多種魚發病，死亡率達80-100％，IPN病毒屬雙RNA病毒科雙鏈RNA病毒，引起包括鮭科魚在內的很多水生動物的急性高度傳染性疾病。這3種病毒病均是由RNA病毒引起的急性高度傳染性疾病，可侵害多種海水和淡水養殖魚類，在歐、美、日、韓及部分亞洲國家流行，可通過魚體及所產卵、精液、尿、糞便以及汙染的飼料、水等傳播，對養殖場造成致命打擊，危害非常嚴重。對上述3病的最好的控制方法是加強對養殖場檢測，防止病毒傳入魚群。目前還沒有對這三種魚病進行檢測的試劑盒，目前對三種魚病普遍採用的檢測方法是用病料接種敏感魚及細胞進行病毒增殖，分離純化病毒，然後用血清中和、免疫螢光和酶聯免疫檢測方法進行病毒鑑定，其操作步驟複雜繁瑣，時間長達2-4周。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種同步檢測魚傳染性造血器官壞死症病毒、傳染性胰臟壞死症病毒和病毒性出血性敗血症病毒的試劑盒，用該試劑盒可以對上述3種病毒同步進行快捷、方便、迅速的檢測。
本發明還公開了一種應用上述試劑盒同步檢測傳染性造血器官壞死症病毒、傳染性胰臟壞死症病毒和病毒性出血性敗血症病毒的檢測方法。
本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種同步檢測魚傳染性造血器官壞死症病毒、傳染性胰臟壞死症病毒和病毒性出血性敗血症病毒的試劑盒，其特點是，它由下列物品構成，(1)陰性對照，不含IHNV、IPNV和VHSV 3種病毒核酸成分的組織提取液，1支；(2)陽性對照，含有IHNV、IPNV和VHSV 3種病毒核酸成分的溶液，1支；(3)dNTP，1支；(4)含Mg2+的PCR緩衝液，1支；(5)引物對ihnf/ihnr，各1支；ihnf為5』-gttaacttcaacgccaacagg，ihnr為5』-tgaagtacccctccccgagcatcc；(6)引物對ipnf/ipnr，各1支；ipnf為5』-ccgcaacttacttgagatccattatgc，ipnr為5』-cgtctggttcagattccacctgtagtg；(7)引物對vhsf/vhsr，各1支；vhsf為5』-cgaccagctcaactcaggtgtcc，vhsr為5』-ccaggtcggtcttgatccattctgtc；(8)DNA聚合酶，1支；(9)逆轉錄酶，1支；(10)RNA酶抑制劑，1支；(11)100％DEPC溶液，1支；(12)包裝盒子1個，泡沫板1塊，其大小與包裝盒子的底面相同，裝於盒子中；泡沫板上有若干數量的小孔，分別用於放置上述物品。
本發明所要解決的技術問題還可以通過以下的技術方案來進一步實現。以上所述的一種同步檢測魚傳染性造血器官壞死症病毒、傳染性胰臟壞死症病毒和病毒性出血性敗血症病毒的試劑盒，其特點是，它還可以含有以下物品(1)RNA提取用Trizol液，1支；(2)氯仿，1支；(3)異戊醇，1支；(4)70％乙醇，1支；(5)含0.01％DEPC的水溶液，1支。
本發明所要解決的技術問題還可以通過以下的技術方案來進一步實現。本發明是一種同步檢測魚傳染性造血器官壞死症病毒、傳染性胰臟壞死症病毒和病毒性出血性敗血症病毒的檢測方法，其特點是，採用上述的試劑盒，其步驟如下，(1)樣品中RNA模板的提取取易感組織樣品勻漿液或可疑病毒感染懸液100-500μl，加入500-800μl Trizol試劑，旋渦30s，加入200μl按24∶1比例配製的氯仿與異戊醇混合液，旋渦30s，10000-15000r/min離心5-3min，取上清，加入等量異丙醇溶液同上離心，取沉澱，加入300μl的70％乙醇溶液同上離心後，去上清，風乾，加入50μl的0.01％DEPC水溶液，取2-10μl用於RT-PCR；(2)RT-PCR預混合液的配製先按下列術式預先加入各試劑並混合好，各試劑加入前需離心數秒鐘，
dNTP 1μl；含Mg2+的PCR緩衝液， 5μl；引物對ihnf/ihnr2μl；引物對ipnf/ipnr， 2μl；引物對vhsf/vhsr， 2μl；DNA聚合酶，0.5μl；逆轉錄酶， 0.5μl；RNA酶抑制劑， 0.25μl；0.01％DEPC水溶液， 若干；然後在上述混合液中分別加入RNA模板，2-10μl，得RT-PCR預混合液A，總體積50μl；陰性對照，5μl，得RT-PCR預混合液B，總體積50μl；陽性對照，5μl，得RT-PCR預混合液C，總體積50μl；(3)將上述RT-PCR預混合液A、B、C裝入PCR反應管，置於基因擴增儀中，如儀器無熱蓋，加入1-2滴石蠟油封蓋，設置RT-PCR循環參數如下，進行擴增42℃×30min95℃×4min
72℃×10min25℃×1min或結束(4)擴增反應結束後，取10-15μl加入4μl溴酚藍混勻，經2％瓊脂糖凝膠電泳，電壓按5V/cm電泳30-40min後於紫外分析儀下觀察，陰性對照和陽性對照正確，樣品RNA提取液若在625bp、371bp、206bp處出現條帶，則分別為VHSV、IHNV和IPNV陽性，說明待測樣品中攜帶三種病毒，若出現其中之一條帶，則對應的病毒檢測結果為陽性，否則為陰性。
本發明的試劑盒既可用來同時檢測三種病毒，也可用來單獨檢測其中每一種病毒，單獨檢測時，只用其中一種病毒的特異性引物對，如單獨檢測IHNV時，加入ihnf/ihnr引物，不加入vhsf/vhsr及ipnf/ipnr引物，其他試劑不變，以此類推。
與現有技術相比，應用本發明的試劑盒及檢測方法可對IHNV、IPNV和VHSV三種病毒進行定性檢測，不僅可以用來進行對IHNV、IPNV和VHSV各種單一病毒單管RT-PCR檢測，也可以用來對3種病毒單管RT-PCR同步快速檢測。檢測時從制樣開始全過程可控制在5小時之內。本發明檢測方法避免了常規的先對RNA樣品進行逆轉錄RT成cDNA，再取少量逆轉錄產品進行PCR擴增的兩步複雜操作步驟及時間、試劑消耗，可對三種病毒進行定性檢測，簡便快速，特異性好，靈敏度高，可用於進出境魚類3種魚病的檢測和養殖場的疫情監測，防制疫病傳播流行，具有很高的實用價值。可應用於出口觀賞魚、魚類及其產品監測檢疫，對我國水生動物養殖場開展疫病診斷、疫情調查，以及進口水生動物及產品的檢測。本發明方法準確、可靠、快速，簡單、易操作、便於推廣。
附圖為本發明的RT-PCR擴增圖。泳道1DNA標記，從上到下1116，883，692，500，400，331，242，190，110bp；泳道2/3，5/6含有VHSV、IHNV和IPNV的陽性對照；泳道4/7陰性對照。
具體實施例方式
下面參照附圖，進一步描述本發明的具體技術實施方案。
實施例1。一種同步檢測魚傳染性造血器官壞死症病毒、傳染性胰臟壞死症病毒和病毒性出血性敗血症病毒的試劑盒，它由下列物品構成，(1)陰性對照，不含IHNV、IPNV和VHSV 3種病毒核酸成分的組織提取液，1支；(2)陽性對照，含有IHNV、IPNV和VHSV 3種病毒核酸成分的溶液，1支；(3)dNTP，1支；(4)含Mg2+的PCR緩衝液，1支；(5)引物對ihnf/ihnr，各1支；ihnf為5』-gttaacttcaacgccaacagg，ihnr為5』-tgaagtacccctccccgagcatcc；
(6)引物對ipnf/ipnr，各1支；ipnf為5』-ccgcaacttacttgagatccattatgc，ipnr為5』-cgtctggttcagattccacctgtagtg；(7)引物對vhsf/vhsr，各1支；vhsf為5』-cgaccagctcaactcaggtgtcc，vhsr為5』-ccaggtcggtcttgatccattctgtc；(8)DNA聚合酶，1支；(9)逆轉錄酶，1支；(10)RNA酶抑制劑，1支；(11)100％DEPC溶液，1支；(12)包裝盒子1個，泡沫板1塊，其大小與包裝盒子的底面相同，裝於盒子中；泡沫板上有若干數量的小孔，分別用於放置上述物品。
實施例2。實施例1中的試劑盒，它還含有以下物品(1)RNA提取用Trizol液，1支；(2)氯仿，1支；(3)異戊醇，1支；(4)70％乙醇，1支；(5)含0.01％DEPC的水溶液，1支。
實施例3。參照附圖。一種同步檢測魚傳染性造血器官壞死症病毒、傳染性胰臟壞死症病毒和病毒性出血性敗血症病毒的檢測方法，採用實施例1所述的試劑盒，其餘所需試劑由檢測者自備，其步驟如下，(1)樣品中RNA模板的提取取易感組織樣品勻漿液或可疑病毒感染懸液100μl，加入500μl Trizol試劑，旋渦30s，加入200μl按24∶1比例配製的氯仿與異戊醇混合液，旋渦30s，10000r/min離心5min，取上清，加入等量異丙醇溶液同上離心，取沉澱，加入300μl的70％乙醇溶液同上離心後，去上清，風乾，加入50μl的0.01％DEPC水溶液，取2μl用於RT-PCR；(2)RT-PCR預混合液的配製先按下列術式預先加入各試劑並混合好，各試劑加入前需離心數秒鐘，dNTP 1μl；含Mg2+的PCR緩衝液， 5μl；引物對ihnf/ihnr 2μl；引物對ipnf/ipnr，2μl；引物對vhsf/vhsr，2μl；DNA聚合酶， 0.5μl；逆轉錄酶， 0.5μl；RNA酶抑制劑，0.25μl；0.01％DEPC水溶液， 若干；然後在上述混合液中分別加入RNA模板，2μl，得RT-PCR預混合液A，總體積50μl；
陰性對照，5μl，得RT-PCR預混合液B，總體積50μl；陽性對照，5μl，得RT-PCR預混合液C，總體積50μl；(3)將上述RT-PCR預混合液A、B、C裝入PCR反應管，置於基因擴增儀中，如儀器無熱蓋，加入1-2滴石蠟油封蓋，設置RT-PCR循環參數如下，進行擴增42℃×30min95℃×4min 72℃×10min25℃×1min(4)擴增反應結束後，取10μl加入4μl溴酚藍混勻，經2％瓊脂糖凝膠電泳，電壓按5V/cm電泳30min後於紫外分析儀下觀察，陰性對照和陽性對照正確，樣品RNA提取液若在625bp、371bp、206bp處出現條帶，則分別為VHSV、IHNV和IPNV陽性，說明待測樣品中攜帶三種病毒，若出現其中之一條帶，則對應的病毒檢測結果為陽性，否則為陰性。
實施例4。參照附圖。一種同步檢測魚傳染性造血器官壞死症病毒、傳染性胰臟壞死症病毒和病毒性出血性敗血症病毒的檢測方法，採用實施例2所述的試劑盒，其步驟如下，
(1)樣品中RNA模板的提取取易感組織樣品勻漿液或可疑病毒感染懸液500μl，加入800μl Trizol試劑，旋渦30s，加入200μl按24∶1比例配製的氯仿與異戊醇混合液，旋渦30s，15000r/min離心3min，取上清，加入等量異丙醇溶液同上離心，取沉澱，加入300μl的70％乙醇溶液同上離心後，去上清，風乾，加入50μl的0.01％DEPC水溶液，取10μl用於RT-PCR；(2)RT-PCR預混合液的配製先按下列術式預先加入各試劑並混合好，各試劑加入前需離心數秒鐘，dNTP 1μl；含Mg2+的PCR緩衝液， 5μl；引物對ihnf/ihnr 2μl；引物對ipnf/ipnr，2μl；引物對vhsf/vhsr，2μl；DNA聚合酶， 0.5μl；逆轉錄酶， 0.5μl；RNA酶抑制劑，0.25μl；0.01％DEPC水溶液， 若干；然後在上述混合液中分別加入RNA模板，10μl，得RT-PCR預混合液A，總體積50μl；陰性對照，5μl，得RT-PCR預混合液B，總體積50μl；陽性對照，5μl，得RT-PCR預混合液C，總體積50μl；
(3)將上述RT-PCR預混合液A、B、C裝入PCR反應管，置於基因擴增儀中，如儀器無熱蓋，加入1-2滴石蠟油封蓋，設置RT-PCR循環參數如下，進行擴增42℃×30min95℃×4min 72℃×10min(4)擴增反應結束後，取15μl加入4μl溴酚藍混勻，經2％瓊脂糖凝膠電泳，電壓按5V/cm電泳40min後於紫外分析儀下觀察，陰性對照和陽性對照正確，樣品RNA提取液若在625bp、371bp、206bp處出現條帶，則分別為VHSV、IHNV和IPNV陽性，說明待測樣品中攜帶三種病毒，若出現其中之一條帶，則對應的病毒檢測結果為陽性，否則為陰性。
權利要求
1.一種同步檢測魚傳染性造血器官壞死症病毒、傳染性胰臟壞死症病毒和病毒性出血性敗血症病毒的試劑盒，其特徵在於，它由下列物品構成，(1)陰性對照，不含IHNV、IPNV和VHSV 3種病毒核酸成分的組織提取液，1支；(2)陽性對照，含有IHNV、IPNV和VHSV 3種病毒核酸成分的溶液， 1支；(3)dNTP，1支；(4)含Mg2+的PCR緩衝液， 1支；(5)引物對ihnf/ihnr， 各1支；ihnf為5』-gttaacttcaacgccaacagg，ihnr為5』-tgaagtacccctccccgagcatcc；(6)引物對ipnf/ipnr， 各1支；ipnf為5』-ccgcaacttacttgagatccattatgc，ipnr為5』-cgtctggttcagattccacctgtagtg；(7)引物對vhsf/vhsr， 各1支；vhsf為5』-cgaccagctcaactcaggtgtcc，vhsr為5』-ccaggtcggtcttgatccattctgtc；(8)DNA聚合酶， 1支；(9)逆轉錄酶， 1支；(10)RNA酶抑制劑， 1支；(11)100％DEPC溶液， 1支；(12)包裝盒子1個，泡沫板1塊，其大小與包裝盒子的底面相同，裝於盒子中；泡沫板上有若干數量的小孔，分別用於放置上述物品。
2.根據權利要求1所述的一種同步檢測魚傳染性造血器官壞死症病毒、傳染性胰臟壞死症病毒和病毒性出血性敗血症病毒的試劑盒，其特徵在於，它還可以含有以下物品(1)RNA提取用Trizol液， 1支；(2)氯仿， 1支；(3)異戊醇，1支；(4)70％乙醇， 1支；(5)含0.01％DEPC的水溶液， 1支。
3.一種同步檢測魚傳染性造血器官壞死症病毒、傳染性胰臟壞死症病毒和病毒性出血性敗血症病毒的檢測方法，其特徵在於，採用權利要求1所述的試劑盒，其步驟如下，(1)樣品中RNA模板的提取取易感組織樣品勻漿液或可疑病毒感染懸液100-500μl，加入500-800μl Trizol試劑，旋渦30s，加入200μl按24∶1比例配製的氯仿與異戊醇混合液，旋渦30s，10000-15000r/min離心5-3min，取上清，加入等量異丙醇溶液同上離心，取沉澱，加入300μl的70％乙醇溶液同上離心後，去上清，風乾，加入50μl的0.01％DEPC水溶液，取2-10μl用於RT-PCR；(2)RT-PCR預混合液的配製先按下列術式預先加入各試劑並混合好，各試劑加入前需離心數秒鐘，dNTP1μl；含Mg2+的PCR緩衝液， 5μl；引物對ihnf/ihnr 2μl；引物對ipnf/ipnr， 2μl；引物對vhsf/vhsr， 2μl；DNA聚合酶， 0.5μl；逆轉錄酶， 0.5μl；RNA酶抑制劑， 0.25μl；0.01％DEPC水溶液， 若干；然後在上述混合液中分別加入RNA模板，2-10μl，得RT-PCR預混合液A，總體積50μl；陰性對照，5μl，得RT-PCR預混合液B，總體積50μl；陽性對照，5μl，得RT-PCR預混合液C，總體積50μl；(3)將上述RT-PCR預混合液A、B、C裝入PCR反應管，置於基因擴增儀中，如儀器無熱蓋，加入1-2滴石蠟油封蓋，設置RT-PCR循環參數如下，進行擴增42℃×30min95℃×4min 72℃×10min25℃×1min或結束(4)擴增反應結束後，取10-15μl加入4μl溴酚藍混勻，經2％瓊脂糖凝膠電泳，電壓按5V/cm電泳30-40min後於紫外分析儀下觀察，陰性對照和陽性對照正確，樣品RNA提取液若在625bp、371bp、206bp處出現條帶，則分別為VHSV、IHNV和IPNV陽性，說明待測樣品中攜帶三種病毒，若出現其中之一條帶，則對應的病毒檢測結果為陽性，否則為陰性。
全文摘要
本發明提供一種同步檢測魚傳染性造血器官壞死症病毒(IHNV)、傳染性胰臟壞死症病毒(IPNV)和病毒性出血性敗血症病毒(VHSV)試劑盒。本發明還公開了應用該試劑盒進行檢測的檢測方法。應用該試劑盒及檢測方法可對三種病毒進行定性檢測，簡便快速，特異性好，靈敏度高，可用於進出境魚類3種魚病的檢測和養殖場的疫情監測，防制疫病傳播流行，具有很高的實用價值。
文檔編號C12Q1/04GK1687447SQ20051003888
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月12日 優先權日2005年4月12日
發明者段宏安, 張睿, 姚燕林, 王海濤, 周毅, 李金華, 劉小琴 申請人:中華人民共和國連雲港出入境檢驗檢疫局