檢測對蝦白斑症候群病毒的環介導等溫擴增引物及其應用的製作方法

2023-05-29 07:20:06

專利名稱：檢測對蝦白斑症候群病毒的環介導等溫擴增引物及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測對蝦白斑症候群病毒的環介導等溫擴增引物及其應用。
背景技術：
對奸白斑綜合症病毒(white spot syndrome virus, WSSV)是近年來新發現的一種嚴重危害養殖對蝦的病毒，根據國際病毒分類委員會(ICTV)第7次報告，該病毒屬於線形病毒科(Nimaviridae)白斑病毒屬(Whispovirus)。該病毒宿主廣泛，除了感染對奸引起對蝦嚴重死亡外，還可以感染野生甲殼類、撓足類等其它40多種海洋環境生物。
由於WSSV危害嚴重，成為威脅對蝦養殖業的主要疾病之一，因此，1995年被國際獸疫局(0ΙΕ)、聯合各糧農組織(FAO)以及亞太地區水產養殖發展網絡中心(NACA)同時列為必報的水生動物疫病。目前，WSSV的檢測診斷方法主要包括聚合酶鏈反應(PCR)檢測技術、核酸探針技術和ELISA檢測技術等。其中，PCR檢測技術以其簡便快捷、特異性好、敏感性高等特點被OIE推薦為該病的檢測手段之一。
環介導等溫擴增(loopmediated isothermal amplification,LAMP)技術是2000 年Notomi等在PCR基礎上創建的另外一種形式的核酸擴增技術。與PCR技術相比，兩者最大的差異在於靶基因引物的設計上。其中，PCR只使用一對與靶基因兩端序列互補的上下遊引物，而LAMP則針對靶基因的6個不同區域，設計4種特異引物——內側引物對和外側引物對，必要時再加上環形引物對，對靶基因進行擴增，6個區域中任何區域與引物不匹配均不能進行擴增反應，因此其特異性和敏感性均比PCR更高。發明內容
本發明的目的是提供一種檢測對蝦白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增引物組。
本發明所提供的檢測對蝦白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增引物組為引物組A 或引物組B ;所述引物組A由引物I、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；所述引物組B由所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成；
所述引物I (F3)、所述引物2 (B3)、所述引物3 (FIP)、所述引物4 (BIP)、所述引物5 (LF)和所述引物6 (LB)的核苷酸序列分別為序列表中的序列I、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
所述引物組A中所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物 6 的摩爾比為(1-2) (1-2) (1-3) (1-3) : (1-2) : (1-2)，如 I :1 2 2 1 1 ;所述引物組B中所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比為(1-2) : (1-2) (1-3):(1-3)，如 I :1 2 :2。
在本發明的一個實施例中，所述引物I (F3)、所述引物2 (B3)、所述引物5 (LF) 和所述引物6 (LB)在環介導等溫擴增反應體系中的終濃度均為0.6μΜ，所述引物3 (FIP) 和所述引物4 (BIP)在環介導等溫擴增反應體系中的終濃度均為1.2μΜ。
所述引物組中，引物I (F3)和引物2 (Β3)組成外側引物對；引物3 (FIP)和引物44 (BIP)組成內側引物對；引物5 (LF)和引物6 (LB)組成環形引物對。序列I由21個核苷酸組成，序列2由19個核苷酸組成，序列3由43個核苷酸組成，序列4由40個核苷酸組成，序列5由22個核苷酸組成，序列6由20個核苷酸組成。
本發明的又一個目的是提供一種檢測對蝦白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增試劑。
本發明所提供的檢測對蝦白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增試劑具體可包括鏈置換型DNA聚合酶、甜菜鹼、dNTPs、Mg2+、Mn2+、鈣黃綠素和所述引物組。
當所述引物組為所述引物組A時，所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述Mn2+、所述鏈置換型DNA聚合酶、所述鈣黃綠素和所述甜菜鹼在所述擴增試劑中的配比為O. 3-1. 5 μ M :0. 3-1. 5 μ M : O. 6-3. 0μ M 0. 6-3. O μ M 0. 3-1. 5 μ M 0. 3-1. 5μ M 0. 4-3. 6mM l-9mM 0. 03-1. 25mM 4-40U :37· 5-125mM :0· 02-0. 2mM,具體如 O. 6 μ M :0· 6 μ M :1· 2 μ M :1· 2 μ M :0· 6 μ M : O. 6 μ M 2mM 7mM :0. 04mM 8U :0. 2mM ；
當所述引物組為所述引物組B時，所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述Mn2+、所述鏈置換型DNA聚合酶、所述鈣黃綠素和所述甜菜鹼在所述擴增試劑中的配比為O. 3-1. 5μΜ 0. 3-1. 5μΜ 0. 6-3. O μ M 0. 6-3. O μ M O. 4-3. 6mM l_9mM 0. 03-1. 25mM 4-40U 37. 5_125mM 0. 02-0. 2mM,具體如 0· 6 μ M : O. 6μΜ1.2μΜ1.2μΜ 2mM 7mM 0. 04mM 8U 0. 2mM。
在本發明中，所述鏈置換型DNA聚合酶具體可為Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。
在本發明的一個實施例中，所述試劑具體由Bst DNA聚合酶、所述Bst DNA聚合酶緩衝溶液、所述甜菜鹼、所述dNTPs、MnCl2、MgS04、所述鈣黃綠素和所述引物組A組成。所述 Bst DNA聚合酶和所述Bst DNA聚合酶緩衝溶液均為New England Biolabs公司產品。
在實際使用過程中，上述試劑的各組分在環介導等溫擴增反應體系中的終濃度為外側引物F3 (序列I)和B3 (序列2)，以及環形引物LF (序列5)和LB (序列6)各 O. 6 μ mol/L ；內側引物 FIP (序列 3)和 BIP (序列 4)各 I. 2 μ mol/L ；dNTPs 2mmol/L ； MgS047mmol/L ；MnCl2O. 04mmol/L ;甜菜喊(Betaine)O. 2mmol/L ；Bst DNA 聚合酶 8U 丐黃綠素(Calcein) 50mmol/L ;I XBstDNA 聚合酶緩衝溶液(ρΗ8· 8)。
本發明的還一個目的是提供一種檢測對蝦白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增試劑盒。
為了提高檢測結果的準確性，本發明所提供試劑盒除了含有所述引物組或所述擴增試劑外，還含有陽性對照質粒和/或陰性對照質粒。
所述陽性對照質粒為含有序列表中序列7所示核酸分子的質粒；所述陰性對照質粒為所述陽性對照質粒去除序列表中序列7所示核酸分子後形成的質粒。
在本發明的一個實施例中，所述陽性對照質粒具體為將序列表中序列7所示的核酸分子與PMD18-T載體相連後所得的質粒；所述陰性對照質粒具體為PMD18-T載體。
所述引物組在製備所述試劑盒中的應用也屬於本發明的保護範圍。
所述引物組，或所述試劑，或所述試劑盒在製備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有對蝦白斑綜合症病毒的產品中的應用也屬於本發明的保護範圍。5
應用所述引物組，或所述試劑，或所述試劑盒檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有對蝦白斑綜合症病毒的方法，包括如下步驟用所述引物組，或所述試劑，或所述試劑盒在60°C條件下對所述待測樣品進行時長60min的環介導等溫擴增反應，之後在80°C放置 5min終止反應，再置於10°C放置5min，按照如下方法確定所述待測樣品中是否含有對蝦白斑綜合症病毒通過肉眼直接觀察，如果所述待測樣品反應產物(液)出現黃綠色螢光，則說明所述待測樣品含有對蝦白斑綜合症病毒；如果所述待測樣品反應液沒有顏色變化，則說明所述待測樣品不含有對蝦白斑綜合症病毒；
所述待測樣品來源於淡水或海洋動物，如野生甲殼類、撓足類等水生動物，更加具體如對蝦。
本發明應用環介導等溫擴增技術原理，針對對蝦白斑症候群病毒基因組保守區的 0RF120序列，設計6條特異性擴增引物。其中，F3、B3為外引物，FIP、BIP為內引物，LF、 LB為環引物。通過利用特異性很強的鈣黃綠素氯化錳作為顯色劑，並全面優化各種反應條件，建立了可視化WSSV-LAMP檢測方法。經測試，該方法只能針對WSSV基因組DNA產生肉眼可見的黃綠色螢光擴增產物，其他對照樣品無顏色反應，呈陰性；該方法最低能檢測到 Ifg的WSSV 0RF120基因克隆質粒DNA。回收外引物F3和B3擴增產物進行測序，利用NCBI homepage中的BLAST分析軟體對測序結果進行分析。結果顯示，測序結果與GenBank中收錄的WSSV序列一致，說明本發明所設計的引物具有高度特異性，可用於對WSSV的檢測。本發明對250份來自廣西沿海地區養殖的對蝦樣品進行檢測，同時與WSSV-PCR檢測結果進行比較。結果顯示，WSSV-LAMP與WSSV-PCR方法均同時檢測到15份陽性樣品，另外3份 WSSV-LAMP檢測為陽性、WSSV-PCR檢測為陰性，兩種方法檢出率分別為7. 2%和6. 0%。這說明WSSV-LAMP對自然感染的臨床樣品陽性檢出率比WSSV-PCR高。本發明對於蝦苗引種和無特定病原體(SPF)種奸群培育以及對奸無公害健康養殖生產均有著十分重要的意義。高度靈敏的WSSV-LAMP檢測技術可以在一定程度上避免了由於病毒含量較低而導致的假陰性結果而導致的漏診，提高檢測結果的準確性，把病毒感染的威脅降低到最低。
總之，本研究建立的WSSV-LAMP檢測技術具有檢測速度快，敏感性高，特異性好， 對儀器要求不高，無需進一步染色或顯色，利用肉眼就可直接對結果進行判斷，十分適合於技術和設備均相對有限的基層單位應用。


圖I為檢測對蝦白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增試劑盒的特異性分析結果。其中，I為陽性對照質粒；2-5為WSSV陽性樣品；6為SPF種蝦組織樣品；7為IHHNV感染樣品； 8為TSV感染樣品；9為副溶血弧菌基因組樣品；10為大腸桿菌基因組樣品；11為陰性對照質粒。
圖2為檢測對蝦白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增試劑盒的靈敏度分析結果。其中，I為IOOng陰性對照質粒；2為IOOng陽性對照質粒；3為IOng陽性對照質粒；4為Ing 陽性對照質粒；5為IOOpg陽性對照質粒；6為IOpg陽性對照質粒；7為Ipg陽性對照質粒； 8為IOOfg陽性對照質粒；9為IOfg陽性對照質粒；10為Ifg陽性對照質粒。
圖3為WSSV-PCR檢測對蝦白斑綜合症病毒的靈敏度分析結果。其中，泳道I為 IOObp DNA標準；泳道2為IOOng陰性對照質粒；泳道3為IOOng陽性對照質粒；泳道4為IOng陽性對照質粒；泳道5為Ing陽性對照質粒；泳道6為IOOpg陽性對照質粒；泳道7為IOpg陽性對照質粒；泳道8為Ipg陽性對照質粒；泳道9為IOOfg陽性對照質粒；泳道10為IOfg陽性對照質粒；11為Ifg陽性對照質粒。圖4為使用檢測對蝦白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增試劑盒對臨床樣品的檢測結果。其中，I為陽性對照質粒；2-6為WSSV感染樣品；7-11為非感染樣品；12為陰性對照質粒。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒，購自天根生物技術公司；甜菜鹼(Betaine)、Bst DNA 聚合酶、MgSO4 購自 New England Biolabs 公司；|丐黃綠素及 MnCl2 購自 International laboratory USA ;PCR 試劑盒、dNTPs、pMD 18-T 載體購自大連 TaKaRa 公司。引物由invitrogen生物技術有限公司合成。對蝦白斑綜合症病毒(WSSV)、傳染性皮下和造血器官壞死病毒(IHHNV)、桃拉病病毒(TSV)記載在龐耀珊，謝芝勳，謝志勤等.二溫式PCR檢測對蝦白斑病病毒.中國獸醫雜誌，2003，39 (4) 43-45中，公眾可以從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得。副溶血弧菌、大腸桿菌記載在謝麗基，謝芝勳，龐耀珊等.貝類派琴蟲PCR檢測方法的建立及初步應用.2011,32 (I) 82-85中，公眾可以從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得。實施例I、檢測對蝦白斑症候群病毒的環介導等溫擴增試劑盒的製備及使用方法一、檢測對蝦白斑症候群病毒的環介導等溫擴增弓I物組的製備本實施例檢測對蝦白斑症候群病毒的環介導等溫擴增引物組由引物I、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成。這六個引物按照如下方法製備根據GenBank中對蝦白斑症候群病毒(WSSV)基因組保守區的0RF120序列(登錄號AF332093. I)，利用在線軟體Primer Explorer V4設計如下所不的LAMP引物F3 (序列 1，引物 1):5』-ACAGTGATGGAATTTCGTTTA-3』 (GENBANK AF332093. I 的第133399-133419 位)B3 (序列 2，引物 2) :5』 -TCAACCTTACGTCCAACTC-3』 (GENBANK AF332093. I 的第133583-133601位的反向互補序列)FIP (序列 3，引物 3):5』 -CGGTCGTTATTAATATAGGCGATCT-CTGACTGTCCATGCCAAT-3』前的序列為GENBANK AF332093. I的第133490-133514位的反向互補序列後的序列為GENBANK AF332093. I 的第 133432-133449 位)BIP (序列 4，引物 4):5』 -CCGTGAACTGCTCCTTGTCA-CGTTATCATTTCCCCACTCG-3，前的序列為GENBANK AF332093. I 的第 133523-133542 位後的序列為 GENBANK AF332093. I 的第133563-133582位的反向互補序列)LF (序列 5，引物 5):
5』 -GGGAATGTTAAATATGTATCGG-3，(GENBANK AF332093. I 的第 133451-133472 位的反向互補序列)LB (序列 6，引物 6):5』 -GTGTCTTATCCCAACAAGTC-3』 (GENBANK AF332093. I 的第 133543-133562 位)二、檢測對蝦白斑症候群病毒的環介導等溫擴增試劑的優化本實施例的檢測對蝦白斑症候群病毒的環介導等溫擴增試劑，包括BstDNA聚合酶、所述Bst DNA聚合酶緩衝溶液、甜菜鹼、dNTPs、MnCl2, MgSO4、鈣黃綠素和步驟I的引物組，其中所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述Mn2+、所述鏈置換型DNA聚合酶、所述鈣黃綠素和所述甜菜鹼在所述擴增試劑中的配比為 O. 6μΜ 0. 6μΜ 1. 2μΜ 1. 2μΜ 0. 6μΜ 0. 6μΜ 2mM 7mM :0. 04mM 8U 50mM 0. 2mM。該擴增試劑是通過建立並優化檢測對蝦白斑症候群病毒的LAMP反應體系 得出的，具體方法如下(I)待測樣品總DNA抽提參照龐耀珊等(龐耀珊，謝芝勳，謝志勤等.二溫式PCR檢測對蝦白斑病病毒.中國獸醫雜誌，2003，39 (4):43-45)方法，取臨床上確診感染了 WSSV的對蝦(謝芝勳，龐耀珊，鄧顯文等.多重RT PCR同時檢測鑑別三種對蝦病毒的研究與應用.病毒學報，2005年05期)的肝胰腺、鰓、肌肉組織等共約IOOmg進行組織勻漿，從中再取適量樣品，利用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒按說明書步驟(天根生化科技有限公司)抽提對蝦基因組DNA，置於-20°C保存備用。(2) WSSV 0RF120基因片段陽性質粒構建合成WSSV-PCR引物XZ 301和XZ 302。以步驟(I)獲得的對蝦基因組DNA為模板，利用該引物擴增WSSV ORF120基因片段，回收PCR產物並克隆到pMD 18-T載體，轉化至DH5ci感受態，並通過PCR和基因測序雙重驗證目的基因片段成功插入載體。將經測序表明攜帶有序列表中序列7所示DNA片段的重組質粒命名為PMD18-WSSV。提取陽性質粒PMD18-WSSV，置於_20°C保存備用。XZ 301 5/ -GATGAGACAGCCCAAGTTGTTAAAC-3'(序列 7 的第 1-25 位，GENBANK AF332093. I 的第 133111-133135 位)；XZ 302:5' -CGAAATTCCATCACTGTAATTGCTTG-3'(序列 7 的第 280-305 位的反向互補序列，GENBANK AF332093. I的第133390-133415位的反向互補序列)(3 ) LAMP反應條件優化以步驟(2)獲得的陽性質粒pMD18-WSSV為模板，利用25 μ L LAMP反應體系進行擴增。反應體系含以下試劑Bst DNA聚合酶緩衝溶液、Bst DNA聚合酶、引物、MgSO4、甜菜鹼、dNTPs、鈣黃綠素、MnCl2, H2O, DNA模板。為了能得到最佳的擴增，對其中的甜菜鹼(O. 04
0.2mmol/L)、Bst DNA 聚合酶(O. 16 O. 96U/μ L),MgSO4CO. 8 IOmmol/L),MnCl2CO. 02
1.25mmol/L)、 丐黃綠素(25 125mmol/L)、引物(O. 2 5 μ mol/L)和 dNTPs(0. 4 4mmoI /L)的用量以及溫度條件進行優化。結果顯示,在本研究所測試的WSSV-LAMP反應條件範圍內，除了甜菜鹼用量對擴增結果影響不大外，其它試劑，包括Bst DNA聚合酶、MgSO4、MnCl2、鈣黃綠素、引物和dNTPs用量，以及溫度條件對WSSV-LAMP擴增均有一定程度的影響。經研究分析，最終確定WSSV-LAMP的最佳反應體系為1 XBstDNA聚合酶緩衝溶液(pH8. 8)、8U Bst DNA聚合酶、7mmol/L MgS04、0. 2mmol/L 甜菜喊、O. 04mmol/LMnCl2、50mmol/L I丐黃綠素、2mmol/L dNTPs,
O.6 μ mol/L 引物 F3/B3/LF/LB，I. 2 μ mol/L 引物 FIP/BIP，DNA 模板適量，dH20 定容至總體積25 μ L。反應程序為60°C 60min,80°C 5min, 10°C 5min。在此條件下，通過肉眼直接觀察反應產物，如果所述待測樣品反應產物(液)出現黃綠色螢光，則說明所述待測樣品含有對蝦白斑綜合症病毒；如果所述待測樣品反應產物(液)沒有顏色變化，則說明所述待測樣品不含有對蝦白斑綜合症病毒。三、檢測對蝦白斑症候群病毒的環介導等溫擴增試劑盒的製備及使用方法該試劑盒包括三個成分，分別是酶反應液，陽性對照質粒和陰性對照質粒。(I)酶反應液即不含DNA模板和dH20的步驟二優化後環介導等溫擴增最佳反應體系；·(2)陽性對照質粒步驟二構建的pMD18-WSSV重組質粒；(3)陰性對照質粒pMD18_T質粒。該試劑盒可按照如下方法使用(a)取適量待測樣品，加入到上述步驟(I)的酶反應液中，用dH20補足至25yL。同時分別做一組陽性對照和陰性對照，即將待測樣品分別替換為適量的陽性對照質粒PMD18-WSSV和陰性對照質粒pMD18-T ；(b)將步驟(a)的待測樣品反應體系、陽性對照反應體系和陰性對照反應體系均按照如下反應程序進行反應60°C 60min,80°C 5min, 10°C 5min ；(c)取出反應管，觀察各樣品反應產物的顏色，根據如下標準對結果進行判斷如果陽性對照反應液出現黃綠色螢光，同時陰性對照反應液無顏色變化，則說明結果可信；在此前提下，所述待測樣品反應液出現黃綠色螢光，則說明所述待測樣品含有對蝦白斑綜合症病毒；如果所述待測樣品反應液沒有顏色變化，則說明所述待測樣品不含有對蝦白斑綜
合症病毒。實施例2、檢測對蝦白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增試劑盒的特異性分析
利用實施例I優化後的LAMP體系和反應程序，對25份PCR方法(引物為XZ 301和XZ 302)或測序方法驗證為WSSV陽性的樣品總DNA、5份其它對照樣品總DNA (包括從美國夏威夷海洋研究所SPF種蝦場引進)的SPF種蝦組織樣品總DNA、IHHNV感染的對蝦樣品總DNA (謝芝勳，龐耀珊，鄧顯文等.多重RT PCR同時檢測鑑別三種對蝦病毒的研究與應用.病毒學報，2005年05期)、TSV感染的對蝦樣品總DNA (謝芝勳，龐耀珊，鄧顯文等.多重RT PCR同時檢測鑑別三種對蝦病毒的研究與應用.病毒學報，2005年05期)、副溶血弧菌基因組DNA、大腸桿菌基因組DNA)、以及實施例I構建的陽性對照質粒pMD18-WSSV和陰性對照質粒PMD18-T進行擴增，通過擴增產物的顏色變化(判斷標準詳見實施例I步驟三中Ce 來判斷待測樣品陰、陽性的符合情況。結果顯示，25份PCR方法或測序方法驗證為WSSV陽性的樣品總DNA的擴增產物與陽性對照質粒擴增產物均呈肉眼可見的黃綠色螢光，為陽性反應；5份其它對照樣品總DNA的擴增產物與陰性對照質粒擴增產物的顏色均無變化，為陰性反應，檢測結果與預期一致，符合率為100%。其中部分樣品的檢測結果如圖I所示。進一步，對其中5份WSSV-LAMP檢測陽性的樣品，利用F3和B3外引物進行PCR擴增，擴增產物純化並連接到PMD18-T克隆載體後進行測序，所得測序結果利用NCBIhomepage網頁上提供的BLAST軟體與GenBank中的參考序列(GENBANK AF332093. I)進行比對，分析序列的同源性。測序結果分析表明，與GenBank中的WSSV參考序列(GENBANK AF332093. I)高度同源，進一步證實了擴增產物為WSSV目的序列。以上結果表明，本發明所提供的檢測對蝦白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增試劑盒有很好的特異性。 實施例3、檢測對蝦白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增試劑盒的靈敏度分析利用Beckman UV-800紫外分光光度計測定WSSV陽性質粒DNA(實施例I構建的陽性對照質粒PMD18-WSSV)的起始濃度，按10倍遞進稀釋法將WSSV陽性質粒DNA稀釋至Ifg/μ L，取I μ L各濃度稀釋液分別加入到實施例I優化後的LAMP體系和PCR反應體系(引物為XZ 301和XZ 302，龐耀珊，謝芝勳，謝志勤等.二溫式PCR檢測對蝦白斑病病毒.中國獸醫雜誌，2003，39 (4):43-45)中進行擴增，比較兩種方法的敏感性。WSSV-LAMP通過擴增產物的顏色變化(判斷標準詳見實施例I步驟三中(c))來判斷待測樣品的陰陽性；WSSV-PCR通過將擴增產品進行瓊脂糖凝膠電泳成像的方法來判斷待測樣品的陰陽性(陽性樣品有大小約為305bp的目的條帶)。實驗同時設置WSSV陰性對照(以濃度為IOOng/ μ L的陰性對照質粒pMD18-T作為待測樣品)。經測定，WSSV-LAMP對10倍系列稀釋的陽性克隆質粒DNA最低檢測量為Ifg (圖
2)，相同樣品PCR的最低檢測量為Ipg (圖3)，靈敏度提高了 1000倍，這提示WSSV-LAMP更適合於WSSV感染量較低或病毒感染初期的樣品檢測。高度靈敏的WSSV-LAMP檢測技術可以在一定程度上避免由於病毒含量較低而導致的假陰性結果而導致的漏診，提高檢測結果的準確性，把病毒感染的威脅降低到最低。實施例4、使用檢測對蝦白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增試劑盒檢測臨床樣品同時利用實施例I優化後的LAMP體系(WSSV-LAMP檢測技術)和PCR反應體系(弓I物為XZ 301和XZ 302，龐耀珊，謝芝勳，謝志勤等.二溫式PCR檢測對蝦白斑病病毒.中國獸醫雜誌，2003，39 (4):43-45) (WSSV-PCR技術)，分別對250份來來自廣西沿海地區不同養殖場的對蝦樣品總DNA進行檢測，比較兩種方法的檢出率。WSSV-LAMP通過擴增產物的顏色變化(判斷標準詳見實施例I步驟三中(c))來判斷待測樣品的陰陽性；WSSV-PCR通過將擴增產品進行瓊脂糖凝膠電泳成像的方法來判斷待測樣品的陰陽性(陽性樣品有大小約為305bp的目的條帶)。結果顯示，WSSV-LAMP和WSSV-PCR均同時檢測到的陽性樣品共有15份；另外，WSSV-LAMP檢測為陽性、而WSSV-PCR檢測為陰性的樣品有3份。計算WSSV-LAMP的陽性檢出率為7. 2%，WSSV-PCR的陽性檢出率為6. 0%。說明WSSV-LAMP對自然感染的臨床樣品陽性檢出率比WSSV-PCR高。部分樣品的WSSV-LAMP檢測結果見圖4。
權利要求
1.檢測對蝦白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增引物組，為引物組A或引物組B;所述引物組A由引物I、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；所述引物組B由所述引物I、 所述引物2、所述引物3和所述引物4組成；所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別為序列表中的序列I、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
2.根據權利要求I所述的引物組，其特徵在於所述引物組A中所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比為(1-2) :(1-2) :(1-3) (1-3): (1-2): (1-2);所述引物組B中所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比為(1_2) : (1-2) : (1-3) : (1-3)。
3.根據權利要求2所述的引物組，其特徵在於所述引物組A中所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比為I :1 :2 :2 :1 :1 ;所述引物組B中所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比為I :1 :2 :2。
4.檢測對蝦白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增試劑，包括鏈置換型DNA聚合酶、甜菜鹼、dNTPs、Mg2+、Mn2+、鈣黃綠素和權利要求1_3中任一所述的引物組。
5.根據權利要求4所述的試劑，其特徵在於所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述Mn2+、所述鏈置換型DNA聚合酶、所述鈣黃綠素和所述甜菜鹼在所述擴增試劑中的配比為O. 3-1. 5 μ M :0. 3-1. 5 μ M : O. 6-3. 0μ M 0. 6-3. 0μ M 0. 3-1. 5 μ M 0. 3-1. 5μ M 0. 4-3. 6mM l-9mM 0. 03-1. 25mM 4-40U 37. 5-125mM 0. 02-0. 2mM ;或所述弓I物I、所述弓I物2、所述弓I物3、所述弓I物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述Mn2+、所述鏈置換型DNA聚合酶、所述甜菜鹼和所述甜菜鹼在所述擴增試劑中的配比為O. 3-1. 5 μ M : O. 3-1. 5 μ M 0. 6-3. O μ M 0. 6-3. O μ M 0. 4-3. 6mM l-9mM 0. 03-1. 25mM 4-40U 37. 5-125mM 0. 02-0. 2mM。
6.根據權利要求5所述的試劑，其特徵在於所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述弓I物5、所述弓I物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述Mn2+、所述鏈置換型DNA聚合酶、 所述鈣黃綠素和所述甜菜鹼在所述擴增試劑中的配比為O. 6 μ M :0. 6 μ M :1. 2 μ M :1. 2 μ M : O. 6 μ M 0. 6 μ M 2mM 7mM 0. 04mM 8U 50mM 0. 2mM ;或所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述Mn2+、所述鏈置換型DNA聚合酶、所述甜菜鹼和所述甜菜鹼在所述擴增試劑中的配比為O. 6 μ M : O. 6 μ M 1. 2 μ M 1. 2 μ M 2mM 7mM :0. 04mM 8U 50mM :0. 2mM。
7.根據權利要求4-6中任一所述的試劑，其特徵在於所述鏈置換型DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。
8.根據權利要求4-7中任一所述的試劑，其特徵在於所述試劑由BstDNA聚合酶、所述Bst DNA聚合酶緩衝溶液、所述甜菜鹼、所述dNTPs、MnCl2、MgS04、所述鈣黃綠素和權利要求1-3中任一所述的引物組組成。
9.檢測對蝦白斑綜合症病毒的環介導等溫擴增試劑盒，其特徵在於所述試劑盒含有下述a)和b)a)陽性對照質粒和/或陰性對照質粒；b)權利要求I或2所述引物組，或權利要求3-7中任一所述擴增試劑；所述陽性對照質粒為含有序列表中序列7所示核酸分子的質粒；所述陰性對照質粒為所述陽性對照質粒去除序列表中序列7所示核酸分子後形成的質粒。
10.如下c)或d)的應用c)權利要求1-3中任一所述的引物組在製備權利要求9所述試劑盒中的應用；d)權利要求1-3中任一所述引物組，或權利要求4-8中任一所述試劑，或權利要求9所述試劑盒在製備檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有對蝦白斑綜合症病毒的產品中的應
全文摘要
本發明公開了一種檢測對蝦白斑症候群病毒的環介導等溫擴增引物及其應用。本發明所提供的引物為引物組，由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；或由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。實驗證明，上述引物利用特異性強的鈣黃綠素氯化錳作為顯色劑，通過環介導等溫擴增檢測對蝦白斑症候群病毒速度快，靈敏度高，特異性強，對儀器要求不高，無需染色或顯色，肉眼可直接判斷結果，對蝦苗引種和無特定病原體種蝦培育以及對蝦無公害健康養殖均有重要意義。
文檔編號C12N15/11GK102912040SQ201210427810
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月31日 優先權日2012年10月31日
發明者謝芝勳, 龐耀珊, 謝麗基, 謝志勤, 鄧顯文, 劉加波, 範晴, 羅思思 申請人:廣西壯族自治區獸醫研究所