識別對蝦白斑綜合症病毒單鏈抗體a1的膠體金標記方法
2023-05-29 07:24:11 2
專利名稱：識別對蝦白斑綜合症病毒單鏈抗體a1的膠體金標記方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學技術應用於水產養殖業，更具體涉及用膠體金標記單鏈抗體。
背景技術：
1993年以來，我國蝦病爆發性流行，引起養殖對蝦大面積死亡，經濟損失慘重。研究表明，其主要是由一種新的DNA雙鏈病毒一對蝦白斑綜合症病毒(WSSV)所致。該病毒可以感染我國所有人工海水養殖的對蝦種類，且感染性強，發病快，死亡率高，給對蝦養殖業帶來極大的危害；據報導，其它國家和地區也有類似情況。目前，對蝦病毒病尚無有效的治療方法，避免與病毒病原接觸被認為是最有效的預防措施，而這主要依賴於早期的快速診斷。目前較可靠和快速的診斷方法主要是PCR，核酸探針技術和酶聯免疫吸附技術。但是PCR和核酸探針技術只能依賴於實驗室，技術條件要求較高，廣大蝦農掌握此技術存在很大的困難。酶聯免疫吸附技術雖有望發展成為可在養蝦場應用的診斷技術，但是由於此法所需的多克隆抗體和單克隆抗體的製備非常麻煩和費用昂貴，大大限制了該技術在診斷對蝦病毒病方面的應用和發展。再由於常規的免疫印記法還需要二抗，不可避免的增加了檢測時間和成本。
「一種識別對蝦白斑杆狀病毒的單鏈抗體A1及其用途」，專利申請號00131231.6，申請日2000年12月8日，申請人中國科學院水生生物研究所。該申請詳細介紹了識別對蝦白斑杆狀病毒的單鏈抗體A1的DNA序列、製備方法及其用途。由於該申請所述的「對蝦白斑杆狀病毒」以前有不同的命名，該命名國內現已統一命名為「對蝦白斑綜合症病毒」。
膠體金標記技術已被廣泛應用於醫學和細胞生物學研究領域，是目前免疫組織化學技術中常用的敏感方法之一。膠體金是氯金酸的水溶膠，具有高電子密度，並能與多種生物大分子結合，是免疫標記技術中常用的一種非放射性示蹤劑。近年來，抗體IgG的膠體金標記應用最為廣泛，其技術條件具有通用性。而單鏈抗體僅是抗體的可變部分，只有完整抗體1/6的分子量，因此單鏈抗體的標記完全不能參照IgG的條件，必須重新摸索條件。
發明內容
本發明的目的是提供一種識別對蝦白斑綜合症病毒單鏈抗體A1的膠體金標記方法，該方法將對蝦白斑綜合症病毒單鏈抗體經純化、透析、調配pH值、確定膠體金溶液與單鏈抗體混和的最佳穩定量、把膠體金溶液與單鏈抗體混和、離心、去上清液，即得到膠體金標記的單鏈抗體A1。該方法可簡化檢測對蝦白斑綜合症病毒的操作步驟，使得檢測時間和成本大大降低。
為了達到上述目的，本發明採用如下技術方案一種識別對蝦白斑綜合症病毒單鏈抗體A1的膠體金標記方法，按下列步驟順序進行1、取識別對蝦白斑綜合症病毒單鏈抗體A1(該單鏈抗體即為申請號00131231.6，申請日2000年12月8日，申請人中國科學院水生生物研究所，發明名稱為「一種識別對蝦白斑杆狀病毒的單鏈抗體A1及其用途」中所述的「識別對蝦白斑杆狀病毒的單鏈抗體A1」)，用親和層析法純化單鏈抗體A1，並在0.005mol/L NaCl pH7.0的溶液中透析；2、用檸檬酸鈉還原法製備20-30nm的膠體金溶液，用凝膠電泳法測定單鏈抗體A1的等電點是pH 5.8，將膠體金溶液的pH調至6.2，使膠體金溶液的pH高於單鏈抗體A1等電點0.5 pH單位；3、用1毫升膠體金溶液與0.1毫升含0.1-0.5毫克不同蛋白濃度的單鏈抗體A1混和，5分鐘後，加入0.1毫升10％的NaCl溶液，放置1-2小時，觀察溶液的顏色變化，將紅色中蛋白濃度最低的確定為抗體的最佳穩定量；4、按步驟3確定的最佳穩定量，將單鏈抗體A1用5分鐘時間均勻加入到膠體金溶液中，室溫攪拌30分鐘；5、用12000轉/分離心60分鐘，去上清液，沉澱物即為膠體金標記的單鏈抗體A1。
6、將沉澱物溶於步驟4所用膠體金溶液1/10體積的保存液中，在攝氏4度中保存；其中保存液的配方為每升含四硼酸鈉0.4克、牛血清白蛋白1.0克、疊氮鈉0.1克、餘者為超純水，用6當量的鹽酸調pH至7.4。
本發明與現有技術相比具有以下優點與效果1、用於對蝦白斑綜合症病毒的檢測將待測樣品5μl點到NC膜上，用1％BSA/PBS包被5分鐘，然後放入膠體金-A1溶液中5-10分鐘取出，用水洗，觀察斑點顏色，有棕紅色斑點的為樣品中含有對蝦白斑綜合症病毒。
2、用於膠體金免疫電鏡法可將對蝦白斑綜合症病毒感染的病蝦組織包埋、切片後，與膠體金-A1保溫，洗去未結合膠體金，然後用電鏡觀察，可研究單鏈抗體A1的抗原決定簇在病毒結構上的定位，以及示蹤病毒的感染過程。
3、噬菌體抗體展示技術不僅避免了在製備多克隆抗體過程中由個體引起的效價及專一性的差異，也避免了在製備單克隆抗體過程中繁雜的雜交瘤技術，並且操作簡單、經濟，篩選範圍廣，使大量製備抗體或工廠化生產抗體成為可能。單鏈抗體A1可通過細菌的培養而獲得大量的抗對蝦白斑綜合症病毒的抗體，使得抗體製備的成本大大降低。單鏈抗體A1膠體金標記的成功，使得對蝦白斑綜合症病毒檢測的成本進一步降低，也可免去二抗，使檢測程序得到很大的簡化。
具體實施例方式一種識別對蝦白斑綜合症病毒單鏈抗體A1的膠體金標記方法，按下列步驟順序進行1、取識別對蝦白斑綜合症病毒單鏈抗體A1(該單鏈抗體即為申請號00131231.6，申請日2000年12月8日，申請人中國科學院水生生物研究所，發明名稱為「一種識別對蝦白斑杆狀病毒的單鏈抗體A1及其用途」中所述的「識別對蝦白斑杆狀病毒的單鏈抗體A1」)，用親和層析法純化單鏈抗體A1，並在0.005mol/L NaCl pH7.0的溶液中透析；2、用檸檬酸鈉還原法製備20-30nm的膠體金溶液，用凝膠電泳法測定單鏈抗體A1的等電點是pH 5.8，將膠體金溶液的pH調至6.2，使膠體金溶液的pH高於單鏈抗體A1等電點0.5pH單位；3、用1毫升膠體金溶液與0.1毫升含0.1-0.5毫克不同蛋白濃度的單鏈抗體A1混和，5分鐘後，加入0.1毫升10％的NaCl溶液，放置1-2小時，觀察溶液的顏色變化，將紅色中蛋白濃度最低的確定為抗體的最佳穩定量；4、按步驟3確定的最佳穩定量，將單鏈抗體A1用5分鐘時間均勻加入到膠體金溶液中，室溫攪拌30分鐘；5、用12000轉/分離心60分鐘，去上清液，沉澱物即為膠體金標記的單鏈抗體A1；6、對識別對蝦白斑綜合症病毒其它的單鏈抗體的膠體金標記方法，同樣按照步驟1-5的方法進行。
7、將沉澱物溶於步驟4所用膠體金溶液1/10體積的保存液中，在攝氏4度中保存；其中保存液的配方為每升含四硼酸鈉0.4克、牛血清白蛋白1.0克、疊氮鈉0.1克、餘者為重蒸水，用6當量的鹽酸調pH至7.4。
權利要求
1.一種識別對蝦白斑綜合症病毒單鏈抗體A1的膠體金標記方法，其特徵在於，該方法按下列步驟順序進行a、取識別對蝦白斑綜合症病毒單鏈抗體A1，用親和層析法純化單鏈抗體A1，並在0.005mol/L NaCl pH7.0的溶液中透析；b、用檸檬酸鈉還原法製備20-30nm的膠體金溶液，用凝膠電泳法測定單鏈抗體A1的等電點是pH5.8，將膠體金溶液的pH調至6.2，使膠體金溶液的pH高於單鏈抗體A1等電點0.5pH單位；c、用1毫升膠體金溶液與0.1毫升含0.1-0.5毫克不同蛋白濃度的單鏈抗體A1混和，5分鐘後，加入0.1毫升10％的NaCl溶液，放置1-2小時，觀察溶液的顏色變化，將紅色中蛋白濃度最低的確定為抗體的最佳穩定量；d、按步驟c確定的最佳穩定量，將單鏈抗體A1用5分鐘時間均勻加入到膠體金溶液中，室溫攪拌30分鐘；e、用12000轉/分離心60分鐘，去上清液，沉澱物即為膠體金標記的單鏈抗體A1。
2.根據權利要求1所述的一種識別對蝦白斑綜合症病毒單鏈抗體的膠體金標記方法，其特徵在於，將膠體金標記的單鏈抗體A1溶於權利要求1步驟中所用膠體金溶液1/10體積的保存液中，在攝氏4度中保存；其中保存液的配方為每升含四硼酸鈉0.4克、牛血清白蛋白1.0克、疊氮鈉0.1克、餘者為重蒸水，用6當量的鹽酸調pH至7.4。
全文摘要
本發明公開了一種識別對蝦白斑綜合症病毒單鏈抗體的膠體金標記方法，涉及分子生物學技術應用於水產養殖業，該方法將對蝦白斑綜合症病毒單鏈抗體經純化、透析、調配pH值、確定膠體金溶液與單鏈抗體混和的最佳穩定量、把膠體金溶液與單鏈抗體混和、離心、去上清液，即得到膠體金標記的單鏈抗體Al。該方法可簡化檢測對蝦白斑綜合症病毒的操作步驟，使得檢測時間和成本大大降低。膠體金標記的單鏈抗體可用於對蝦白斑綜合症病毒的檢測，用於膠體金免疫電鏡法，可研究單鏈抗體Al的抗原決定簇在病毒結構上的定位，以及示蹤病毒的感染過程。
文檔編號G01N33/532GK1540351SQ20031011129
公開日2004年10月27日 申請日期2003年10月30日 優先權日2003年10月30日
發明者戴和平, 戴玲芬, 張小華, 趙若虹, 韓明信 申請人:中國科學院水生生物研究所