具有白介素－2中和能力的免疫治療製劑的製作方法

2023-05-29 08:51:46 1

專利名稱：具有白介素－2中和能力的免疫治療製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及能夠增強針對白介素-2(IL-2)的免疫反應並且產生自身抗體的藥物製劑，所述抗體能阻斷與受體的結合，並且所述製劑可用於治療腫瘤。
現有技術的說明免疫系統特別是T細胞能識別腫瘤抗原的能力的發現，是開發用於控制免疫系統以便治療癌症患者的策略的根本支柱之一。
因此，為了開發回收浸潤腫瘤基質的特異性T細胞(被稱作腫瘤-浸潤淋巴細胞(TIL))或來自未治療個體的外周血液或在使用治療性癌症疫苗之後的個體的外周血液的特異性T細胞的方法，主要努力方向是刺激所述細胞，以便加強它們在體內的抗腫瘤效應能力。
因此，主要策略指向增強它們針對多種腫瘤相關抗原(TAA)的特異性細胞毒活性。主要治療方法集中在白介素-2(IL-2)的體外應用，以便激活並且擴增來自攜帶腫瘤的個體的TIL，然後再將這些細胞重新輸回到所述個體體內(Rosenberg，S.A.等(1986)Science 233，1318-1321；Kawakami，Y.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，6458-6462；Kawakami，Y.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，3515-3519)。不過，儘管證實了在體外實現了對細胞免疫反應的刺激作用，所述幹預具有有限的治療結果。由此導致了對基於使用治療性癌症疫苗的主動特異性免疫方案的應用的治療模式的評估，設計了包含與IL-2結合的腫瘤抗原的疫苗載體，以便有利於體內有效細胞免疫反應的誘導，不過，上述方法的結果較差(Rosenberg，S.A.，等(1998)Nat.Med.4，321-327)。
目前，主要臨床策略業已轉向開發基於反應性T細胞從患者獲得性轉移到其自身的腫瘤抗原的方式。在體外使用抗CD3單克隆抗體(mAb)和IL-2刺激並且擴增所述細胞，在回輸到血流中之後，提供IL-2胃腸外用藥。該方法構成了為了治療癌症患者而設計的主要治療幹預之一，儘管治療結果仍然是謹慎的(Dudley，M.E.，等(2002)Science 298，850-854；Rosenberg，S.A.等(2004)Proc Natl AcadSci USA.101 Suppl 2，14639-45)。
所有這些治療策略的合理化設計都是基於將白介素-2用作抗腫瘤免疫反應的細胞激活的必要分子(US 6,060,068和US 5,830,452)。
IL-2在免疫中所起作用的背景基於在體外進行的實驗。從它的發現起，IL-2就被認識到它刺激T細胞增殖的能力(因此，IL-2的同義詞是T細胞生長因子)。進一步證實了T細胞增殖和功能可在體外使用抗IL-2或抗IL-2受體進行抑制，驗證了這一發現(Smith，KA.Immunol Rev 51337-357，1980)。
最近，業已通過實驗證實了人類腫瘤能夠通過產生具有抗腫瘤免疫性抑制能力的T細胞而減弱免疫系統的反應。所述細胞業已在動物模型和表現不同分化標記的患者中表徵，儘管它們的相關性與所述實驗模型不同(Bach，J.F.(2003)Nat Rev Immunol 3，189-198；Chakraborty，N.G.，等(2004)Hum Immunol 65，794-802；Markus，Y.M.y Sykes，M.(2004)J Clin Oncol 22，1136-1151)。
分化簇25(CD25)構成了IL-2受體的α鏈。此外，這種細胞因子的受體的結構包括β(CD122)和γ(CD132)鏈。它們在靜息T淋巴細胞中以組成型方式表達，並且所述細胞的激活，誘導了α鏈的合成，高親和力雜三聚體受體的形成和IL-2分泌。CD25在5-10％的CD4+T淋巴細胞中組成型表達，並且在低於1％的外周CD8+T淋巴細胞中表達。所述細胞是無變應性的，並且表現出體外抑制活性(Shevach，E.M.(2002)Nat Rev Immunol 2，389-400)。
最近業已證實，被動施用抗CD25mAb，在某些實驗腫瘤中能誘導抗腫瘤反應，儘管其他腫瘤對這種治療有耐受性(Onizuka，S.等(1999)Cancer Res 59，31 28-31 33)。
免疫系統誘導針對自身分子的反應的能力是有限的，特別是對諸如生長因子的可溶性分子。然而，用與載體蛋白綴合併且在佐劑中乳化的這些因子進行主動免疫，能促進針對所述分子的免疫反應的誘導(U.S.5.984.018)。針對自體或異源分子產生的特異性自身抗體，能抑制其與它們的受體的結合，阻止通過這種結合觸發的增殖的機制。
根據以上結果可以將抗腫瘤反應依賴於IL-2的存在視為現有技術。因此，我們決定表徵體內抗IL-2自身抗體對腫瘤演變的影響，所述抗體是通過用存在於佐劑中的與載體分子綴合的IL-2主動免疫誘導的。
令人吃驚的是，阻斷IL-2與它的受體結合的自身抗體的誘導能促進腫瘤生長的減弱，即使是對通過被動施用抗CD25mAb誘導的抗腫瘤作用具有耐受性的腫瘤。另外，所述自身抗體的存在不會影響治療對象中對癌症疫苗的免疫反應。
發明詳述本發明涉及對治療腫瘤有作用的治療製劑，對於所述腫瘤來說，對象免疫系統的作用是重要的。具體地講，本發明包括製備能夠產生自身抗體的免疫治療製劑，所述自身抗體能阻斷白介素-2與它的受體的結合，並且抑制腫瘤生長。
本發明的目的是能抑制IL-2與它的受體結合的治療製劑，可用於治療癌症患者，其中，該製劑包括與載體蛋白結合的IL-2或它的肽；另外，它含有合適的佐劑。具體地講，本發明的治療製劑包括來自腦膜炎奈瑟氏球菌的載體蛋白P64k，且佐劑選自氫氧化鋁和MontanideISA 51。
在本發明的一種實施方案中，所述治療製劑包括通過化學綴合與P64k綴合的IL-2。在本發明的另一種實施方案中，所述製劑包括融合蛋白形式的IL-2或它的肽與P64k。
本發明還包括能抑制IL-2與它的受體結合的治療製劑，可用於治療患有癌症的個體，並且，該製劑包括抗人IL-2(hIL-2)的特異性單克隆抗體。
本發明的另一個目的是治療癌症患者的方法，其需要阻斷IL-2與其受體結合，以便觸發針對腫瘤的合適的免疫反應，該方法包括施用含有IL-2或抗IL-2抗體的疫苗組合物。
在本發明的另一方面，披露了基於IL-2的疫苗和基於特異性腫瘤抗原或腫瘤生長因子的其他癌症疫苗以及實際常規應用的化療劑或放療的治療組合。
術語″治療組合″表示物理組合(即混合物形式)，關於兩者作為不同和單獨的構成組織(例如以試劑用具形式)並當它們聯合用於治療患者時的關聯。因此，藥物組合是在涉及施用兩種化合物的治療方案中的有用組合，或通過物理結合，如同在治療過程中給同一患者施用的獨立劑量。
術語″癌症疫苗″表示主動免疫治療中的有用製劑，以便在接受治療的對象體內引起免疫反應，該免疫反應識別用於所述疫苗中的抗原，並且可以進行測量。
1.-獲得免疫原性組合物。
本發明的疫苗組合物包括與載體蛋白綴合的人重組白介素-2(hIL-2r)作為活性成分，所述載體蛋白優選是來自腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜複合物的蛋白P64k(0474313EP A2和U.S.5.286.484)。另外，該疫苗組合物包括合適的佐劑。本發明的疫苗組合物優選使用Montanide ISA 51作為佐劑。
hIL-2r和載體蛋白之間的綴合可以是通過化學綴合，或者是構建通過遺傳工程技術獲得的融合蛋白。
-獲得包括通過化學綴合與P64k蛋白綴合的hIL-2r的疫苗組合物。
為了獲得hIL-2r和P64k蛋白之間的蛋白綴合，以20∶1-5∶1(hIL-2r的摩爾數與P64k蛋白的摩爾數之比)的可變比例混合這兩種成分，優選10∶1(hIL-2r的摩爾數與P64k蛋白的摩爾數之比)。將戊二醛添加到該混合物中，至最終濃度為0.02-0.1％，優選0.5％，並且在室溫(RT)下溫育1-5小時。最後，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)溶液進行充分透析。通過10％SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳驗證所述綴合反應(Laemmli UK(1970)Nature 277，680-685)。
-獲得包括hIL-2r和P64k蛋白之間的融合蛋白的疫苗組合物。
通過聚合酶鏈式反應(PCR)，使用特異性引物擴增編碼IL-2的基因(447pb)。消化所得到的DNA片段，並且連接在表達載體的特定結合位點中，在該載體中克隆編碼所述載體蛋白的基因，以便所得到的蛋白包括這兩種分子的一個或多個拷貝。可以使用來自哺乳動物細胞和來自細菌或酵母的任何表達載體。所述載體在載體蛋白的N-末端還可包括六個組氨酸。通過以下方法驗證所得到的質粒在瓊脂糖凝膠電泳中進行限制分析，使用酶Sequenace 2.0(Amersham-USB)分析DNA序列，最後，通過″Western印跡″技術，使用特異性抗hIL-2單克隆抗體，分析所述融合蛋白在大腸桿菌的任何表達菌株中的生產。為了獲得所述蛋白，使用強力破碎方法破碎細胞壁，然後通過使用硫酸銨的示差沉澱方法和層析方法的組合來純化所述蛋白。最後，在無菌條件下過濾所述蛋白並且在-20℃下保存或者凍幹並且在4℃下保存待用。
-獲得包括與P64k蛋白化學綴合或作為融合蛋白結合的來自hIL-2r的肽的疫苗組合物。
通過化學合成獲得的來自IL-2的胺基酸序列的肽可以通過化學綴合而結合到P64k蛋白上，如U.S.5,984,018中所述。另外，來自hIL-2r的肽與P64k蛋白的融合蛋白大體上是按照前面部分所述相同方法獲得的，例子可以包括來自以下區域的肽1)肽 N33-A50
胺基酸數目 18序列NPKLTRMLTFKFYMPKKA2)肽 T113-T133胺基酸數目 21序列TIVEFLNRWITFCQSIISTLT-化學綴合的hIL-2r-P64k的電泳。
可以用10％SDS聚丙烯醯胺凝膠進行電泳(Laemmli U.K.(1970)Nature 277，680-685)。每個孔添加15μg樣品，並且用考馬斯染料染色。
2.-由包括hIL-2r和蛋白P64k的疫苗組合物產生的效果的表徵。臨床前研究。
-疫苗組合物的免疫原性。
為了在動物中研究本發明疫苗製劑的免疫原性，使用了8-12周齡，體重18-20g的雌性BALB/c小鼠。在實驗期間，小鼠在按照GoodPractices of Care of and Use of the Experimental Animals的標準操作程序(SOP)下建立的飼養和操作的標準條件下圈養。
可以遵循不同的免疫接種方案-方案A，通過肌內途徑每2周施用0.1mL的4μg當量劑量的以hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗形式綴合的hIL-2r的四個劑量，交替肢體的接種部位。
-方案B，通過肌內途徑施用0.1mL的10μg當量劑量的以hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗形式綴合的hIL-2r的四個劑量。前兩個劑量是在兩個肢體的獨立的免疫接種部位同時施用的，並且在兩周之後，在另外兩個肢體上施用兩個劑量。
-評估由hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗誘導的針對hIL-2r的抗體反應。
可檢測血清中的自身抗體滴度，通過現有用於測定封閉性抗體或評估外周血液中特異性免疫反應的方法之一，測定特異性抗體或B細胞。
由疫苗hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51誘導的抗hIL-2r抗體可以通過間接ELISA(酶聯免疫吸附測定)評估，使用來自免疫動物的血清，參見下文用50μl/孔的hIL-2r覆蓋96孔平底微量滴定板(Costar，HighBinding，USA)，用碳酸鹽-碳酸氫鹽0.1M，pH9.6溶液製備成10μg/mL的濃度。在4℃下溫育所述平板過夜，並且用200μl/孔含有0.05％Tween 20的PBS(PBS-Tween 20)洗滌2次。在37℃下與100μl/孔含有1％的牛血清白蛋白的PBS(PBS-BSA 1％)溫育1小時之後，用200l/孔的PBS-Tween 20洗滌平板，然後添加在PBS-BSA 1％中不同稀釋度的血清樣品50μl/孔。在37℃下溫育1小時之後，用PBS-Tween 20洗滌平板，並且添加50μl/孔的與鹼性磷酸酶(JacksonImmunoresearch Laboratories)綴合的綿羊抗小鼠血清(它是以1/5000的比例用PBS-BSA稀釋的)，並且在37℃下溫育1小時。洗滌平板，並且添加50μl/孔的底物溶液，該溶液由1μg/mL的對硝基苯磷酸(Sigma)在pH9.8的二乙醇胺緩衝溶液中組成。在室溫(RT)下溫育平板30分鐘之後，通過ELISA讀數器(Organon Teknika，Austria)在405nm波長下測量反應產物的吸光度。
-評估由基於EGF的疫苗誘導的抗hEGF抗體反應可以檢測血清中的自身抗體滴度，通過現有用於測定封閉性抗體或評估外周血液中的特異性免疫反應的方法之一，測量特異性抗體或B細胞。
通過基於EGF的疫苗誘導的抗hEGF抗體可以通過間接ELISA(酶聯免疫吸附測定)評估，使用來自免疫動物的血清，參見Gonzalez，G.，等(2002)Vaccine Research 5，233-244。
-在與來自用hIL-2-P64k/Montanide ISA 51免疫接種的動物血清或針對hIL-2r的特異性單克隆抗體(mAb)溫育之後對CTLL-2細胞系增殖的影響。
將IL-2依賴型T-細胞系CTLL-2保持在含有1U/mL的hIL-2h的RPMI-1640培養基中，使它處在連續增殖狀態。CTLL-2培養是在裝有25mL含有8-20％的胎牛血清(FCS)的RPMI-1640和0.5×105-106細胞/mL細胞懸浮液的75cm2細胞培養瓶中進行的。所述細胞在體外擴增兩天之後使用。
為了進行所述分析，從體外培養物中提取細胞，並且用RPMI-1640或PBS洗滌不少於四次。在96孔平底培養平板(Costar，High Binding，USA)中，接種5×103細胞。用來自免疫動物的血清稀釋液處理這些細胞，所述動物是使用hIL-2-P64k/Montanide ISA 51疫苗免疫的，對IL-2的ELISA滴度為1∶10000，或使用抗IL-2特異性mAb處理細胞，並且添加1U/mL的hIL-2r。在37℃下在潮溼氣氛中在含有5％CO2的培養箱中培養24小時。通過在培養的最後18-24小時用[3H]胸苷(1μCi/孔)進行脈衝而測定增殖。通過液體閃爍計數器測定胸苷摻入。所有操作都是在無菌條件下進行的。
3-hIL-2-P64k/Montanide ISA 51疫苗的抗腫瘤效果。臨床前研究。
為了在動物中研究本發明疫苗製劑的抗腫瘤效果，使用了8-12周齡的體重18-20g的雌性BALB/c小鼠。可按照前面詳述的方案A和B用hIL-2-P64k/Montanide ISA 51疫苗對動物進行免疫接種，並且在一周之後通過皮下途徑同位接種腫瘤細胞系，如乳腺癌F3II，接種量為5×104細胞/動物。將具有可觸及的腫瘤的小鼠評分為陽性，並且使用測徑器測量腫瘤生長，確定最大表面長度(a)和它的垂直寬度(b)，並且將腫瘤大小報導為a×b。定期檢查腫瘤。
令人吃驚和出乎預料的是，本發明的作者業已發現了在攜帶惡性腫瘤對象體內IL-2與它的受體的結合中和，增強了針對該腫瘤的免疫反應，誘導了腫瘤尺寸的縮小。現有技術表明，這種作用會導致抑制個體免疫系統對腫瘤的反應。
作者業已發現，當對象接受本發明的疫苗組合物的主動治療時，在循環IL-2水平顯著降低時，獲得了對腫瘤生長的這種作用，正如這種減輕作用在用抗IL-2單克隆抗體被動治療下獲得時。
為此，本發明產生了在治療患有惡性腫瘤患者方面的不可否認的優點，並且提供了用IL-2進行免疫接種的方法，該方法有效，簡單，並且與這些情況下使用的常規治療相比對患者來說更容易接受和攻擊性更小。
以下實施例包括說明本發明主題的疫苗組合物的免疫學效果的實驗細節。
實施例用於本發明的疫苗組合物中的人重組IL-2(hIL-2r)可通過商業渠道獲得(U.S.5.614.185)。用在該疫苗中的來自腦膜炎奈瑟氏球菌的蛋白P64k是通過重組DNA技術獲得的，參見EP 0474313 A2和U.S.5,286,484。
實施例1由hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗誘導的抗體反應。
為了促進針對人白介素-2的免疫原性，通過化學方法將它綴合到來自腦膜炎奈瑟氏球菌的載體蛋白P64k蛋白上。所述化學綴合可以通過戊二醛方法實現(U.S.5.984.018)。通過10％SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳驗證綴合的效率，分別添加每一種成分的樣品(hIL-2r，P64k)，與化學綴合物hIL-2r-P64k和標準分子量圖譜進行比較。可以通過添加hIL-2r-P64k的泳道中的連續存在驗證獲得了綴合物(

圖1)。
為了評估由hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗誘導的針對hIL-2r的抗體反應，用方案A和B對BALB/c小鼠進行免疫。將來自對hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗有反應的動物的超免疫血清用作陽性對照，並且將免疫前血清用作陰性對照。它被定義為免疫動物的抗體滴度，血清的光密度大於免疫前血清的光密度的平均值加上五倍標準偏差的較大稀釋度。為了確定對照動物的滴度，使用與之前相同的標準，所不同的是用PBS-BSA 1％取代免疫前血清作為陰性對照。
誘導抗體反應達到1∶100-1∶50000的滴度。該免疫方案持續大約52天，這是必須對該方案進行改進以便在較短時間內獲得相似或更好抗體滴度的原因，因此我們使用方案B並且獲得了類似結果，參見圖2。
實施例2用來自使用hIL-2-P64k/Montanide ISA 51疫苗免疫的動物的血清處理的CTLL-2細胞系的增殖實驗通過與IL-2依賴型T-細胞系CTLL-2培養評估在用hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗免疫接種的動物體內產生的血清抗體的體外IL-2結合能力。在存在IL-2的條件下將CTLL-2細胞接種到培養平板中，讓它們生長，並且添加來自動物的抗體滴度為大約1∶10000的不同的血清稀釋液。觀察到了血清濃度和對CTLL-2細胞系增殖的抑制作用之間的正相關(圖3)。證實了來自免疫動物的血清的體外IL-2中和能力。
實施例3用hIL-2-P64k/Montanide ISA 51疫苗處理的動物的抗腫瘤實驗。
按照方案B用hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗對動物進行免疫。一周之後，用5×104F3II腫瘤細胞攻擊動物。與用PBS-P64k/Montanide ISA 51接種的對照組相比，用hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51免疫的動物的腫瘤生長動力學較緩慢(圖4a)。觀察到了這兩組之間腫瘤大小在統計學上的顯著差異。
實施例4用抗IL-2特異性mAb處理的CTLL-2細胞系的增殖試驗。
通過與IL-2依賴型T-細胞系CTLL-2一起培養評估由S4B6(ATCC#HB-8794)雜交瘤產生的針對hIL-2r的特異性抗體的體外IL-2結合能力。在存在IL-2的條件下將CTLL-2細胞接種到培養平板中，使它們生長，並且添加不同的抗體稀釋液。發現了抗體濃度和對CTLL-2細胞系增殖的抑制作用之間的正相關(圖5)。發現1∶100的抗體稀釋度能夠抑制80％以上的CTLL-2細胞系增殖，證實了所述單克隆抗體的體外IL-2中和能力。
實施例5抗IL-2mAb和抗CD25 mAb(ATCC-PC61)的抗腫瘤效果。F3II實驗模型(乳腺癌)。
連續五天每天用劑量為1mg的特異性單克隆抗體(抗IL-2 mAb或抗CD25 mAb)處理小鼠。兩天之後，用5×104細胞/小鼠的實驗乳腺癌F3II通過皮下垂直注射而攻擊小鼠。定期測量最大表面長度(a)的它的垂直寬度(b)。對照組(用PBS處理)的腫瘤尺寸比用抗IL-2mAb處理組的尺寸大(圖6)。兩個實驗組之間的腫瘤尺寸在統計學上是有差異的。不過，抗CD25 mAb(ATCC-PC61)處理的動物的腫瘤尺寸與對照組類似。這一結果表明，IL-2中和抗體具有有效的抗腫瘤效果，即使對於其中消除CD25調控細胞沒有作用的腫瘤也是如此。
實施例6抗IL-2mAb和抗CD25 mAb(ATCC-PC61)的抗腫瘤效果。EL4實驗模型(淋巴瘤)。
用5×104細胞/小鼠的EL4淋巴瘤皮下攻擊C57BL/6動物。在腫瘤攻擊之前兩天用一個劑量的1mg的抗CD25mAb(PC61)靜脈內處理動物，或連續五天每天用1mg劑量的抗IL-2mAb(S4B6)處理，在腫瘤接種之前六天開始。其他組基於前面所述的類似方案同時施用抗CD25和抗IL-2mAb。
記錄每一組小鼠的腫瘤生長。在腫瘤攻擊之後，每周兩次沿兩個垂直維度測量每一隻小鼠的腫瘤尺寸。EL4腫瘤的統計學差異為*p＝0.0232，**p＝0.0039，***p＜0.0001。圖7顯示兩種單克隆抗體的組合對腫瘤生長具有強烈作用。
實施例7誘導抗IL-2自身抗體不影響對EGF癌症疫苗的反應。
為了評估由疫苗hEGF-P64k/Montanide ISA 51誘導的抗hEGF的抗體反應是否受先前用hIL-2r免疫(誘導自身抗體)的影響，按照方案A用製備的hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗對BALB/c動物進行免疫，並且在19天之後用製備的hEGF-P64k/Montanide ISA 51或hEGF/Montanide ISA 51疫苗免疫。在所有實驗中，當用hEGF疫苗接種時，通過肌內途徑施用在0.1mL體積中製備的綴合在疫苗中的4μg當量的hEGF。將對疫苗hEGF-P64k/Montanide ISA 51有反應的動物的超免疫血清用作陽性對照，將免疫前血清用作陰性對照。將它定義為免疫動物的抗體滴度，血清的光密度大於免疫前血清的光密度的平均值加上5倍標準偏差的較大稀釋度。為了確定動物對照的滴度，採用了與之前相同的標準，所不同的是用PBS-BSA 1％取代免疫前血清作為陰性對照。發現通過用EGF/Montanide ISA 51或hEGF-P64k/Montanide ISA 51免疫誘導的抗EGF抗體的滴度不受抗hIL-2r自身抗體的誘導的影響，參見圖8。
實施例8在體內中和白介素-2恢復細胞裂解活性，在攜帶腫瘤的宿主的淋巴結細胞中進行評估。
在攜帶腫瘤的宿主體內評估了IL-2中和作用對於對標稱抗原的免疫反應的影響。在標準圈養條件下維持雌性C57BL/6J小鼠(H-2b)。對所有實驗來說，使用6-12周齡的小鼠。卵白蛋白(OVA)和肽VII級OVA(Sigma，St.Louis，MO)是在這些實驗中使用的模型蛋白Ag。所使用的優勢肽OVA275-264(SIINFEKL)的純度＞90％。增殖試驗用104細胞的MB16F10腫瘤或PBS通過皮下途徑在C57BL/6小鼠的左脅進行攻擊。定期測量腫瘤直徑。三周之後，對所述小鼠進行皮下免疫接種，在第0天使用1mg的OVA與100g/小鼠的聚肌胞苷酸[poly IC](PIC)(Sigma，St.Louis，MO)，而在隨後2天只施用PIC。同時，連續五天用對hIL-2r的特異性單克隆抗體(αIL-2)或PBS處理動物。用通過螢光染料CFSE(Molecular Probes，Paisley，UK)差示標記的來自幼稚小鼠的脾細胞測定體內細胞裂解活性。將標記CFSEhigh的細胞用作靶標，並且用SIINFEKL脈衝(1μM；90分鐘，37℃，5％CO2)，而標記CFSElow的細胞不進行脈衝，以便用作內部對照。對經肽脈衝的靶細胞進行充分洗滌，以便除去游離肽，然後以1∶1的比例對先前免疫的小鼠靜脈內共同注射。十六小時之後，取出淋巴結和脾臟，並且通過流式細胞計測量與兩種螢光強度(CFSElow和CFSEhigh)相應的總事件。計算未包被的與SIINFEKL包被的百分比之間的比例(CFSEint/CFSEhigh)，以便獲得細胞毒性的數值。在體內在用OVA加上PIC免疫的C57BL/6小鼠中評估的淋巴結細胞對OVA肽的細胞裂解活性產生了最大的反應。連續5天每天通過靜脈內注射施用1mg劑量的抗IL-2單克隆抗體在這些動物中不影響細胞裂解反應。用MB16F10腫瘤攻擊的C57BL/6小鼠受到免疫抑制，對OVA的細胞裂解活性降低。不過，體內施用具有IL-2中和能力的單克隆抗體恢復了淋巴結細胞的免疫反應(圖9)。
實施例9在體內中和白介素-2恢復細胞裂解活性，在攜帶腫瘤的宿主的脾細胞中評估。
在攜帶腫瘤的宿主體內評估了IL-2中和作用對於對標稱抗原的免疫反應的影響。用OVA和PIC對C57BL/6小鼠進行免疫，並且在體內評估脾細胞對OVA肽的細胞裂解活性，獲得了最大反應。連續5天每天通過靜脈內注射施用1mg劑量的抗IL-2單克隆抗體不會影響所述動物中的細胞裂解反應。
用MB16F10腫瘤攻擊的C57BL/6小鼠受到免疫抑制，對OVA的細胞裂解活性降低。不過，體內施用具有IL-2中和能力的單克隆抗體恢復腺細胞的免疫反應(圖10)。
實施例10用製備的疫苗hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51免疫的動物的血細胞計數。
為了評估用製備的疫苗hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51免疫是否會誘導血細胞數量的改變，對紅細胞，白細胞和血小板進行計數，用製備的疫苗免疫過的動物(按照方案A)或者沒有免疫過的動物，一直到首次免疫之後100天。參見圖11，在分析組之間沒有發現細胞計數的差異。
附圖的簡要說明圖1-化學綴合的hIL-2r-P64k的電泳。從左到右的條帶分別相應於P64k，hIL-2r，hIL-2r-P64k和分子量的標準模式。
圖2-通過用hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51免疫誘導的抗hIL-2r的抗體的滴度，使用前面所披露的兩種免疫方案。y軸表示抗IL-2的抗體滴度的幾何平均值。x軸表示相應於用以下物質免疫的動物的組對照P64k/Montanide ISA 51。
Sch A IL-2hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51，按照方案A。
Sch B IL-2hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51，按照方案B。
圖3-在存在hIL-2r和來自動物血清的不同稀釋液的條件下CTLL-2細胞系的增殖，所述動物是用疫苗hIL-2r-P64k/MontanideISA 51免疫接種的，並且血清滴度數量級為1∶1000-1∶50000。
圖4-用疫苗hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51或P64k/MontanideISA 51(對照組)免疫並且隨後用F3II腫瘤攻擊的動物的腫瘤生長。y軸表示腫瘤面積，定義為由較大的直徑乘以垂直選定的較小的直徑。
圖5-在存在hIL-2r和抗IL-2抗體的不同稀釋液的條件下CTLL-2細胞系的增殖。
圖6-用抗IL-2mAb，抗CD25 mAb或PBS(對照組)處理並且用F3II腫瘤細胞系攻擊的動物的腫瘤生長。y軸表示腫瘤面積，定義為較大直徑乘以垂直選定的較小直徑。
圖7-用αIL-2mAb，抗CD25mAb或PBS(對照組)處理並且隨後用淋巴瘤EL4攻擊的動物的腫瘤生長。y軸表示腫瘤面積，定義為較大直徑乘以垂直選定的較小直徑。
圖8-通過用hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51和hEGF-P64k/Montanide ISA 51接種誘導的對EGF的抗體滴度。y軸表示對EGF的抗體滴度的幾何平均值。x軸表示用以下物質免疫的組hIL-2rhIL-2r-P64k/Montanide ISA 51hEGFhEGF/Montanide ISA 51hIL-2r+hEGFhIL-2r-P64k/Montanide+hEGF/Montanide。
hEGF/P64khIL-2r-P64k/Montanide+hEGF/Montanide。
hIL-2r+hEGF/P64khIL-2r-P64k/Montanide+hEGF/P64k/Montanide。
圖9-誘導的對白介素-2的抗體恢復細胞裂解活性，在攜帶腫瘤的宿主的淋巴結細胞中進行評估。
所有小鼠在第0天用1mg的OVA和100μg/小鼠的PIC進行皮下免疫接種，並且在隨後2天僅施用PIC。使用來自幼稚小鼠的脾細胞測定體內細胞裂解活性，所述細胞是用螢光染料CFSE進行差示標記的。將標記CFSEhigh的細胞用作靶標，並且用SIINFEKL脈衝，而標記CFSElow的細胞不進行脈衝，用作內部對照。然後以1∶1的比例對先前免疫過的小鼠進行共同靜脈內注射。在淋巴結細胞中評估細胞裂解活性。
對照-用PBS處理的動物，αIL-2-用IL-2中和單克隆抗體處理的動物，MB16F10-與對照類似但用MB16F10攻擊的動物，αIL-2+MB16F10-用IL-2中和單克隆抗體處理的攜帶MB16F10腫瘤的小鼠。
圖10-誘導的對白介素-2的抗體恢復細胞裂解活性，在攜帶腫瘤的宿主脾細胞中進行評估。
所有小鼠在第0天用1mg的OVA和100μg/小鼠的PIC進行皮下免疫接種，並且在隨後2天僅施用PIC。使用來自幼稚小鼠的脾細胞測定體內細胞裂解活性，所述脾細胞是用螢光染料CFSE進行差示標記的。標記CFSEhigh的細胞被用作靶標，並且用SIINFEKL脈衝，而標記CFSElow的細胞不進行脈衝，用作內部對照，然後以1∶1的比例對先前免疫過的小鼠進行共同靜脈內注射。在脾細胞中評估細胞裂解活性。
對照-用PBS處理的動物，αIL-2-用IL-2中和單克隆抗體處理的動物，MB16F10-與對照類似但用MB16F10攻擊的動物，αIL-2+MB16F10-用IL-2中和單克隆抗體處理的攜帶MB16F10腫瘤的小鼠。
圖11-用hIL-2r-P64k/Montanide ISA 51疫苗免疫的動物的血細胞計數(白細胞(白血球)，紅細胞(紅血球)和血小板)與對照(P64k/Montanide ISA 51)的比較。
權利要求
1.用於治療癌症患者的引發針對IL-2的免疫反應的治療製劑，包括下列至少一種A.-通過遺傳學方法或化學綴合而與任何載體蛋白結合的IL-2或它的任意衍生物，包含合適的佐劑，B.-抗IL-2單克隆抗體，C.-基於特異性腫瘤抗原或生長因子的癌症疫苗，D.-抗CD25單克隆抗體。
2.如權利要求1的引發針對IL-2的免疫反應的治療製劑，包括同時或依次施用A+C或A+D或B+C或B+D。
3.如權利要求1的引發針對IL-2的免疫反應的治療製劑，包括與載體蛋白結合的IL-2或它的任意衍生物，以及合適的佐劑。
4.如權利要求3的引發針對IL-2的免疫反應的治療製劑，包括與載體蛋白結合的IL-2和合適的佐劑。
5.如權利要求4的引發針對IL-2的免疫反應的治療製劑，其中，所用載體蛋白是來自腦膜炎奈瑟氏球菌的P64k。
6.如權利要求5的引發針對IL-2的免疫反應的治療製劑，其中，所述佐劑選自氫氧化鋁和Montanide ISA 51。
7.如權利要求6的引發針對IL-2的免疫反應的治療製劑，其中，所述佐劑是Montanide ISA 51。
8.如權利要求1的引發針對IL-2的免疫反應的治療製劑，包括IL-2和P64k之間的化學綴合。
9.如權利要求1的引發針對IL-2的免疫反應的治療製劑，包括IL-2與P64k的融合蛋白。
10.如權利要求1的引發針對IL-2的免疫反應的治療製劑，包括衍生自IL-2的肽與P64k的融合蛋白。
11.如權利要求1的引發針對IL-2的免疫反應的治療製劑，包括抗人IL-2的特異性單克隆抗體。
12.如權利要求2的引發針對IL-2的免疫反應的治療製劑，包括給對象施用與載體蛋白結合的IL-2或它的任何衍生物和佐劑，聯合基於特異性腫瘤抗原或生長因子的癌症疫苗。
13.如權利要求12的引發針對IL-2的免疫反應的治療製劑，其中，所述癌症疫苗包括EGF。
14.如權利要求2的引發針對IL-2的免疫反應的治療製劑，包括給對象施用與載體蛋白結合的IL-2或它的任意衍生物和佐劑，聯合抗CD25特異性單克隆抗體。
15.如權利要求13的引發針對IL-2的免疫反應的治療製劑，包括抗CD25特異性單克隆抗體。
16.權利要求1-15的治療製劑用於生產引發針對IL-2的免疫反應的能夠抑制癌症患者的腫瘤生長的藥物的用途。
17.權利要求1-15的治療製劑用於抑制腫瘤生長的用途。
全文摘要
本發明涉及藥物製劑，它可用於癌症，並阻斷白介素2(IL－2)與其受體的結合。具體地講，本發明涉及通過在佐劑Montanide ISA 51中將IL－2與腦膜炎奈瑟氏球菌的轉運蛋白P64k結合而可增強IL－2的免疫原性的治療製劑，用於誘導阻斷IL－2與其受體結合的自身抗體。本發明還涉及治療腫瘤包括乳腺癌的有效方法。另外，本發明還涉及基於IL－2的疫苗與基於特異性腫瘤抗原或腫瘤生長因子的其他癌症疫苗以及常規用於腫瘤學實踐的放療或化療藥物的治療組合。
文檔編號C07K14/55GK101061136SQ200580039186
公開日2007年10月24日 申請日期2005年11月16日 優先權日2004年11月16日
發明者J·E·蒙特羅卡西米洛, L·B·艾倫索薩戴, R·佩雷斯羅德裡格斯, A·B·拉格戴維拉 申請人:分子免疫中心