壬基酚人工抗原的製備方法

2023-05-29 10:00:26 1

專利名稱：壬基酚人工抗原的製備方法
技術領域：
本發明屬於生物化工技術領域，更具體涉及一種壬基酚人工抗原的合成方法，本發明利用琥珀酸酐法，將壬基酚上面的羥基進行衍生化，以引進能夠與蛋白反應的功能團。利用改進的碳二亞胺法將衍生物NP-HS與蛋白載體反應，合成相應的人工抗原，為壬基酚抗體製備提供技術支持。
背景技術：
壬基酚(Nonylophenol，NP)，是一種重要的精細化工原料和中間體，主要用於生產表面活性劑、也用於抗氧化劑、紡織印染助劑、潤滑油添加劑、農藥乳化劑等領域，由於NP高度疏水性及化學性質穩定，因此容易在環境中富集而廣泛分布，同時通過食物鏈對水生生物、動物及人類造成危害。有專家表明，NP具有雌激素效應，可導致動物生殖系統的損害，同時對雄性動物的生殖功能也有影響，並對其血清中睪丸酮水平和某些生化指標產生影響。為了確保人類安全與健康，建立快速、準確監測壬基酚等有害物質的殘留是十分必要的。傳統的殘留分析方法包括氣相色譜法、液相色譜法、質譜、薄層層析等，這些方法往往需要很複雜昂貴的儀器，而且需要經過繁瑣的前處理，很難達到快速、簡便的現場檢測要求。而免疫檢測分析方法由於具有特異性強、靈敏度高、簡便、快速等優點，近年來備受人們的關注。因此，建立起NP的免疫快速檢測方法，對於實踐中批量化測定樣品中NP殘留意義重大。本試驗製備成功的人工抗原以及由此製備的高效價抗體，可為建立快速檢測NP殘留的免疫試劑盒提供可靠保證。壬基酚是小分子化合物，本身不具備免疫原性，不能直接刺激機體產生抗體，必須與連接到大分子載體上以形成較為理想的免疫原。在本實驗中，用改進的碳二亞胺法合成壬基酚人工抗原NP-BSA，並對其進行鑑定。然後以此人工抗原免疫balb/c小鼠，製備單克隆抗體，對NP的ELISA檢測方法進行研究。為下一步研製壬基酚殘留檢測試劑盒建立很好的技術平臺。

發明內容
本發明的目的是在於提供了一種壬基酚人工抗原的製備方法，該方法合成步驟簡單易操作，副反應少，目標物純度高。為了實現上述的目的，本發明採用以下技術措施—種壬基酚人工抗原的製備方法，其步驟是(I)按摩爾比1:1. 3稱取壬基酚和琥珀酸酐置於500ml反應瓶中，加入DMSO作為溶劑，90°C反應Ih後冷卻至室溫(20-25°C，以下相同)。將冷卻的反應液緩慢的加入到超純水中，邊滴加邊攪拌，溶液瞬間變成乳白色，上面浮著一層淡黃色的油狀物，將上述物質進行抽濾沉澱，用冰超純水洗滌後抽乾，50°C烘乾後重結晶3次，乾燥得到的淡黃色油狀物即為NP-HS。
(2)按摩爾比30 :30 :1稱取N-羥基琥珀醯亞胺水溶性碳二亞胺牛血清白蛋白共溶於O. Olmol/IPBS中，4°C下攪拌反應過夜。將上述溶液離心(5000r/min, IOmin),所得上清液為A液；按摩爾比30:6. 5的比例稱取NP-HS溶解於N，N- 二甲基甲醯胺中，待完全溶解後，用移液槍取1/2體積的上清液A，以邊滴加邊攪拌的方式加入到NP-HS溶液中，避光反應3-5h。將反應後的溶液離心(5000r/min，IOmin),上清液為B，取上清液B，以PBS(pH=7. 4)溶液做透析液，置4°C透析3天，每7-9h換一次透析液，除去未反應的DMF、⑶C、NHS、NP等小分子物質。將透析好的反應液用棕色玻璃小瓶分裝後置於_40°C冰箱中冷凍過夜，然後轉移到冷凍乾燥機中進行乾燥，獲得一種壬基酚人工抗原，於_20°C冰箱保存。人工抗原的鑑定先根據SDS-PAGE結果測定BSA及NP-BSA的分子量，再採用紫外掃描儀測定得到的壬基酚一牛血清白蛋白的偶聯比，分別在279 nm、278 n m波長處測定吸光度值，並計算偶聯比。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果壬基酚的物理化學性質決定了在人工抗原的合成過程中可利用的活性基團僅有羥基，對此我們設計了對-氨基苯甲酸法、混合酸酐法、碳二亞胺法、活潑酯法、琥珀酸酐法五種不同的人工抗原合成方法和技術方案，經紫外掃描圖分析對-氨基苯甲酸法、混合酸酐法、活潑酯法都沒有合成目標物，僅碳二亞胺法和琥珀酸酐法合成了目標物，但是碳二亞胺法合成的目標物太少、得率較低。最後經比較分析後確定琥珀酸酐法最優，該方法合成步驟簡單易操作，副反應少，目標物得率高、純度高，所獲得的抗血清效價高。


圖1為一種SDS-PAGE實驗結果示意圖。電泳結果顯示新合成的NP-BSA與BSA相比其相對遷移率發生了改變。圖2為一種BSA(lg/L)紫外掃描示意圖。BSA紫外掃描圖顯示BSA最大特徵吸收波長為279nm。圖3為一種NP-BSA (2g/L)紫外掃描示意圖。NP-BSA紫外掃描圖證實NP-BSA較之BSA其最大吸收波長發生了改變，由279變278，這是與NP-BSA物理化學性質較之BSA發生了改變相適應的。圖4為一種NP-BSA透析液紫外掃描示意圖。NP-BSA透析液紫外掃描圖證實新合成的人工抗原已透析乾淨。圖5為一種NP抗血清效價示意圖。從圖5可看出NP抗血清的效價較高，為1. 024X 106。
具體實施例方式一種壬基酚人工抗原的製備方法，其步驟是(I)按摩爾比1:1. 3稱取壬基酚和琥珀酸酐置於500ml反應瓶中，加入DMSO作為溶劑，90°C反應Ih後冷卻至室溫(20-25°C，以下相同)。將冷卻的反應液緩慢的加入到超純水中，邊滴加邊攪拌，溶液瞬間變成乳白色，上面浮著一層淡黃色的油狀物，將上述物質進行抽濾沉澱，用冰超純水洗滌後抽乾，50°C烘乾後重結晶3次，乾燥得到的淡黃色油狀物即為壬基酚-琥珀酸半酯(NP-HS)。
(2)按摩爾比30 :30 :1稱取N-羥基琥珀醯亞胺水溶性碳二亞胺牛血清白蛋白共溶於O. Olmol/IPBS中，4°C下攪拌反應過夜。將上述溶液離心(5000r/min, IOmin)上清液為A ;按摩爾比30:6. 5的比例稱取NP-HS溶解於N，N- 二甲基甲醯胺中，待完全溶解後，用移液槍取適量上清液A，以邊滴加邊攪拌的方式加入到NP-HS溶液中，避光反應4h。將反應後的溶液離心(5000r/min，lOmin)，上清液為B，取上清液B，以PBS (pH=7. 4)溶液做透析液，置4°C透析3天，每8h換一次透析液，除去未反應的DMF、⑶C、NHS、NP等小分子物質。將透析好的反應液用棕色玻璃小瓶分裝後置於-400C冰箱中冷凍過夜,然後轉移到冷凍乾燥機中進行乾燥，於_20°C冰箱保存。2、人工抗原的鑑定 (I)SDS-PAGE 實驗分離膠12%(W/V)聚丙烯醯胺濃縮膠5%(W/V)丙烯醯胺a) 30%(ff/V)丙烯醯胺配方丙烯醯胺29gN-N』 -亞甲叉雙丙烯醯胺Ig加水至100ml，密封保存，不宜過久，pH>7. O時不可用。b ) 10% (ff/V) SDS 溶液SDS IOg蒸懼水溶解後,定容至100mL。c)1. 5mol/L 分離膠 buffer (ρΗ8· 8):Tris 鹼18. 17g溶於80ml蒸餾水中用10mol/LHCl 調 pH 至 8. 8，定容至 100ml。d)1. 0mol/L 濃縮膠 buffer (ρΗ6· 8):Tris 鹼 12.1lg溶於80ml蒸餾水中用10mol/LHCl 調 pH 至 6. 8,定容至 100ml。e)電極 buffer I&存液(5X , pH8. 3)Tris 喊 15.1g甘氨酸 94g10%SDS 50ml溶於900ml蒸餾水中，調pH至8· 3，定容至1000ml。f) 10% (ff/V)過硫酸銨(AP,臨用前配製)稱取AP Ig,蒸懼水溶解後定容至IOml。g) 1%(W/V) TEMED :取 TEMED0. 1ml，加蒸餾水定容至 10ml。h) 2 X SDS 凝膠上樣 buffer lOOmmol/L TrisHCI(pH6.H)
200mmol/L :::硫蘇糖醇(DTT)
4%(W/V)SDS (電泳級)
0.2%(W/V)溴酚藍
20%(W/V)甘油i)脫色液取甲醇400ml,蒸懼水500ml,冰醋酸100ml。j)染色液稱取考馬斯亮藍R-250 O. 25g，用脫色液溶解後定容至100ml。k)標準蛋白質。
I) 12%(ff/V)分離膠配製(15ml)
蒸餾水4 3 ml
30%(W/V)丙烯醯胺溶液6.0 ml
1.5M Tris (pH8.8)3.8 ml
10%(W/V) SDS150 μ
10%(W/V)過硫酸銨150 μ
l%(W/V)TEMED600 μ 室溫混勻後，倒入垂直玻板之間，之後緩慢加入蒸餾水約Icm高即封閉，待凝。5%(ff/V)濃縮膠(成層膠)配方(5ml)待分離膠凝固後，將蒸餾水倒出，並用濾紙將餘下的蒸餾水吸乾淨，然後按一下操作配製濃縮膠
蒸餾水2.94 ml
30%(W/V)W烯醯胺溶液0.83 ml1.OM Tris (pH6.8)UCH ml
10% (WZV)SOS50 μ!
10%(W/V) AP50 μ
1%(W/V)TEMED500 μ 室溫混勻後，倒於分離膠之上，迅速插入點樣梳，待凝。操作步驟I)槽的準備使用前裝好垂直板型電泳槽。2 )封膠用O. 8% w 1. 0% (W/V)瓊脂糖凝膠將玻片與橡膠、橡膠與電泳槽的接縫封好，以防聚丙烯醯胺凝膠及緩衝液的滲漏。3)灌膠灌得不宜過快，以免產生氣泡影響聚合，室溫放置乾燥。4)預電泳凝膠完全凝固後，小心取出點樣梳，加入電極緩衝液，然後接通電源，上槽負極，下槽正極，80ν預電泳3 w 5min。5)上樣蛋白樣品1(^1^加上樣131^€61'1(^1^後沸水(100°0煮3^51^11。在低電壓下，用微量上樣器上樣，上樣量為2 μ g。(凝膠從左至右依次為Marker、BSA、BSA-NP)6)電泳樣品在濃縮膠中電泳約lh，待樣品進入分離膠後，160v電泳4h左右。
附各泳道依次加入=Marker(分子量依次為 97. 4KD、66. 2KD、43. 0KD、31. OKD、20. 1KD)、BSA、BSA-BSA。7)染色、脫色電泳結束後，小心剝出凝膠，置染色缸中，用染色液浸泡過夜；次日將凝膠置於脫色液中，每隔2h換一次脫色液，直到背景清晰為止。8)分子量的測定a)標準曲線的繪製以凝膠的前沿或遷移距離最大的標準蛋白質為參考點，計算每種標準蛋白質的相對遷移率(Mr)Me=蛋白質從原點遷移的距離/從原點到參考點的距離
以Mr值為橫坐標、標準蛋白質分子量為縱坐標做標準曲線圖。b)待測樣品分子量的測定計算出待測蛋白質的相對遷移率，查標準曲便可知其分子量。(2)紫外掃描圖譜分析採用紫外掃描儀測定得到的壬基酚-牛血清白蛋白的偶聯比，分別在279 nm、278 n m波長處測定吸光度值，並然後按照式(1廣(3)計算出NP-BSA的結合比。
V一式中，ε偶聯物、ε載體蛋白、ε半抗原分別為偶聯物、載體蛋白、半抗原在某一波長下的摩爾吸光係數，N為每摩爾載體蛋白上所偶聯的半抗原的摩爾數。蛋白質質量濃度(mg/mL)=l.45Α280-0· 74A260 ( 2)式中，A28tl、A26tl分別為該蛋白質溶液在280、260nm下的吸光度值。A= ε克分子消光係數Cl(3)式中，A是該物質在最大波長處的吸光度值，c是該物質的濃度(mol/L)，I是比色杯的直徑(cm)，ε克分子消光係數是該物質的克分子消光係數[I/(mol/cm)]。3、結果分析3.1SDS-PAGE 實驗結果(見圖1):從SDS-PAGE實驗結果同樣可以看出NP-BSA較之原來的BSA其分子量大小都發生了變化，NP和BSA發生化學反應生成了新的物質NP-BSA。計算得到NP-BSA的偶聯比為5:1。3. 2紫外掃描圖譜分析從以上紫外掃描圖可以看出NP-BSA合成成功，且最大吸收峰為278nm，這與BSA的最大吸收峰279nm不同,而且較之BSA的溶解度(本試驗中BSA已經達到了其最大溶解度lg/L)偶聯的NP-BSA的溶解度有了較大的變化，在本實驗中可以達到2g/L以上。而且較之原來的BSA新合成的人工抗原其最大紫外吸收峰都發生了變化，且紫外峰形也發生了明顯的改變。3. 3小鼠陽性血清抗體效價測定評判標準為P/N 彡 2. 1，Ρ/Ν>0. 2。結果效價測定結果顯示效價為1. 024X 106。
權利要求
1.一種壬基酚人工抗原的製備方法，其步驟是(I)按摩爾比1:1. 3稱取壬基酚和琥珀酸酐置於500ml反應瓶中，加入DMSO作為溶劑，90°C反應Ih後冷卻至室溫，將冷卻的反應液加入到超純水中，邊滴加邊攪拌，溶液變成乳白色，上面浮著一層淡黃色的油狀物，將上述物質進行抽濾沉澱，用冰超純水洗滌後抽乾，50°C烘乾後重結晶3次，乾燥得到的淡黃色油狀物為NP-HS;(2)按摩爾比30 30 1稱取N-羥基琥珀醯亞胺水溶性碳二亞胺牛血清白蛋白共溶於O. Olmol/IPBS中，4°C下攪拌反應過夜,將上述溶液離心5000r/min, IOmin,所得上清液為A液；按摩爾比30:6. 5的比例稱取NP-HS溶解於N，N- 二甲基甲醯胺中，待完全溶解後，用移液槍取1/2體積的上清液A，以邊滴加邊攪拌的方式加入到NP-HS溶液中，避光反應3-5h，將反應後的溶液離心5000r/min，IOmin,上清液為B，取上清液B，以PBS溶液做透析液，置4°C透析3天，每7-9h換一次透析液，除去未反應的DMF、CDC、NHS、NP小分子物質，將透析的反應液用棕色玻璃小瓶分裝後置於_40°C冰箱中冷凍過夜，然後轉移到冷凍乾燥機中進行乾燥，獲得一種壬基酚人工抗原，於_20°C冰箱保存。
全文摘要
本發明公開了一種壬基酚人工抗原的製備方法，其步驟(1)按摩爾比稱取壬基酚和琥珀酸酐置於反應瓶中，加入DMSO作為溶劑，反應後冷卻至室溫，將冷卻的反應液加入到超純水中，邊滴加邊攪拌，溶液變成乳白色，將物質進行抽濾沉澱，用冰超純水洗滌後抽乾，烘乾後重結晶，乾燥得到的淡黃色油狀物;(2)按摩爾比稱取N-羥基琥珀醯亞胺水溶性碳二亞胺牛血清白蛋白共溶於lPBS中，反應過夜，離心；按摩爾比比例稱取NP-HS溶解於N,N-二甲基甲醯胺中，溶解後，取上清液，邊滴加邊攪拌的方式加入到NP-HS溶液中，將反應後的溶液離心，取上清液，將透析的反應液置於冰箱中冷凍過夜，乾燥，得壬基酚人工抗原。該方法合成步驟簡單易操作，副反應少，目標物純度高。
文檔編號C07K14/765GK103012582SQ201210533788
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月12日 優先權日2012年12月12日
發明者甘金華 申請人:中國水產科學研究院長江水產研究所