一種使用辣根過氧化物酶標抗體檢測豬瘟弱毒病毒滴度的方法

2023-05-28 18:39:46 2

一種使用辣根過氧化物酶標抗體檢測豬瘟弱毒病毒滴度的方法
【專利摘要】一種採用辣根過氧化物酶免疫技術檢測豬瘟病毒弱毒滴度的方法，其特點是將傳代貼壁細胞MPK細胞接種到96孔培養板中，用適宜的生長培養基維持其生長，MPK細胞在96孔板中快速增殖，當細胞長為單層後接種豬瘟病毒，並繼續培養令病毒增殖，若干天后加入辣根過氧化物酶標抗體和底物，經過孵育使細胞培養物顯色。本發明採用辣根過氧化物酶免疫技術，可在MPK細胞中標記出病毒的存在，使用PEG增加病毒與細胞的聚合度從而促進其感染，其靈敏度高於藥典規定的動物實驗測定病毒滴度的方法，可以作為企業質量內控的方法。
【專利說明】一種使用辣根過氧化物酶標抗體檢測豬瘟弱毒病毒滴度的
方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種快速靈敏的檢測方法，特別是涉及一種使用辣根過氧化物酶標抗體快速高效地檢測豬瘟弱毒株病毒滴度作為豬瘟疫苗生產質量內控的方法，屬於獸用生物製品檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002]目前國內藥典規定的檢測豬瘟活疫苗滴度的方法中使用兔子作為實驗動物，通過靜注不同稀釋倍數的疫苗液使實驗動物產生體溫升高免疫反應，再根據實驗動物體溫升高的情況計算兔體感染量(RID)，從而確定疫苗所含的病毒滴度。在疫苗研製階段，對病毒滴度的檢測不僅限於疫苗成品的效力檢測，還要貫穿於生產的各關鍵環節，尤其是在配苗前，需要評估病毒的滴度，以確定疫苗中有效病毒的含量。動物實驗中，每個樣品通常需要三組實驗動物來檢測，每組實驗動物不少於四隻，因此每個試驗周期至少需要上百隻實驗動物來支持，僅花費於實驗動物的購買、運輸和飼養的成本就需要4-5萬元人民幣，在試驗過程中，還需要4-6名飼養人員和實驗人員，會花費大量的人力物力。另外，用動物作為試驗的受體，難以排除動物的個體差異和實驗人員的操作對試驗的影響，可能給試驗帶來較大的誤差。

【發明內容】

[0003]本發明的目的在於找出替代動物實驗的方法，在節省人力物力的基礎上，提高實驗效率，減小實驗誤差，提供一種創新的豬瘟病毒弱毒滴度的檢測方法，即採用辣根過氧化物酶免疫技術檢測豬瘟病毒弱毒滴度的方法。
[0004]不同於相關文獻中描述的使用PK-15細胞作為檢測豬瘟病毒滴度的細胞系，本發明選用了與疫苗生產相同的細胞系，這是一種完全不同的傳代細胞系，小型豬腎細胞(MPK)。經病毒適應馴化，豬瘟病毒可以很好地在該細胞系內快速增殖，遠高於使用PK-15細胞作為檢測用細胞的靈敏度；同時使用該細胞系作為檢測細胞可以保持與研發環節相統一的實驗條件。另一種檢測豬瘟病毒滴度的方法為免疫螢光法，但這種方法對於豬瘟弱毒株相對不敏感，很難獲得陽性結果[1]。
[0005]本發明由於採用辣根過氧化物酶免疫技術，靈敏度可達到與體內檢測(即動物實驗)相當的水平，且重複性高，實驗結果真實，而實驗成本是動物實驗的二十分之一，只需一名操作人員和一名覆核人員即可完成，因此顯著提高了豬瘟病毒弱毒滴度的檢測效率，同時也降低了實驗成本，增加了實驗的穩定性，減小了實驗誤差，得到了更為快速有效的檢測結果。
[0006]為了達到本發明的目的，本發明給出的技術解決方案是:這種採用辣根過氧化物酶免疫技術檢測豬瘟病毒弱毒滴度的方法，其特點是:挑選出對豬瘟弱毒株高度敏感的MPK傳代細胞，將此細胞在96孔培養板中培養至長滿單層，之後接種不同稀釋度的豬瘟病毒，持續培養後，加入辣根過氧化物酶標記的抗體共同孵育，最後加入底物使受到感染的細胞培養物顯色，通過顯色的孔數佔總孔數的百分比計算病毒滴度，具體步驟為:
[0007](I)使MPK細胞在96孔培養板中長成單層；
[0008](2)將待測病毒液進行梯度稀釋，接種於細胞單層，用維持培養基維持細胞生長；
[0009](3)持續培養72?120小時後，將細胞培養物熱固定，加入辣根過氧化物酶標抗體在37°C下孵育，再加入底物於常溫下孵育；
[0010](4)在顯微鏡下觀察細胞培養物的顯色情況，根據顯色孔數的百分比計算病毒的滴度。
[0011]本發明提及的MPK細胞為Minipig Kidney Cell，是一種傳代貼壁細胞系。經貼壁適應性馴化，得到適應在96孔培養板上貼壁生長的特異性MPK細胞。
[0012]為更好的實現本發明的目的，所述步驟(I)中使用的細胞生長培養基是經過優化的，適合MPK細胞生長的培養基。每升液體培養基含有5?8克gibco公司生產的高糖DMEM，
3.5?5.5克gibco公司生產的M199，1.5?3克上海滬試化工有限公司生產的NaHCO3, 50?120毫升太原潤生生物材料有限公司生產的牛血清；培養基的pH為7.2?7.4。所述步驟
(2)中細胞培養基為經優化的維持培養基。每升液體培養基含有5?8克gibco公司生產的高糖DMEM，3.5?5.5克gibco公司生產的M199，1.5?3克上海滬試化工有限公司生產的NaHCO3,10?40毫升太原潤生生物材料有限公司生產的牛血清；培養基的pH為7.2?
7.4。
[0013]為更好的實現本發明的目的，MPK細胞在96孔培養板內適宜生長的溫度為36.5?37.5°C，適宜培養的pH為7.0?7.5，適宜的CO2濃度為2%?4%。接種病毒前最佳培養時間為96?144小時，接種病毒後最佳培養時間為72?120小時。
[0014]為更好的實現本發明的目的，所述步驟(2)中接種病毒時使用Sigma公司生產的分子量為600?1500的聚乙二醇(PEG)來提高病毒對細胞的感染率，最適宜的PEG濃度為1%?4%。
[0015]為更好的實現本發明的目的，所述步驟(I)中細胞接種的最佳密度為I?5X104個/孔。
[0016]為更好的實現本發明的目的，使用的酶標抗體為PrioCON公司的HRP021.2，使用的底物為Sigma公司生產的3-氨基-9-乙基-咔唑(AEC)用N，N- 二甲基甲醯胺按照4mg/ml的濃度溶解配置而成的。
[0017]與現有技術相比，本發明的有益效果是:提供了一種採用辣根過氧化物酶免疫技術檢測豬瘟病毒弱毒的方法，通過此種方法可快速有效地檢測豬瘟病毒弱毒的滴度。其優勢特點集中為:
[0018](I)靈敏度較高；
[0019](2)檢測較為迅速，在準備好細胞單層的情況下，四天可出結果；
[0020](3)節省人力和成本，顯著提高實驗效率；
[0021](4)結果容易觀察，易排除抗原抗體非特異性結合所帶來的幹擾。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1:使用不同細胞進行滴度檢測的結果對照；[0023]圖2:使用不同病毒稀釋培養基進行滴度檢測的結果對照。
【具體實施方式】
[0024]為使本發明的優點和特點更加容易理解，下面通過對實驗條件的優化，對比動物實驗的結果，結合具體實施例，進一步闡述本發明。但這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或者替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍。
[0025]下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規實驗方法進行。
[0026]實施例1
[0027]1.選擇接毒方式:單層接毒。
[0028]2.選擇細胞:PK-15細胞和MPK細胞。
[0029]3.本實施例中分別將ΡΚ-15細胞和MPK細胞用生長培養基按I?5Χ IO4個/孔的密度接種在96孔細胞培養板中，每孔200 μ I。細胞培養板置於恆溫培養箱中，調整條件為:生長溫度36.5?37.5°C、CO2濃度為2%?4%。96?144小時內，細胞長為緊密貼壁的單層，此時可以接毒。
[0030]4.將待測病毒用含1%?4% PEG的培養基進行10倍稀釋，分別將不同稀釋倍數的病毒液接種到已有單層細胞的培養板中，每孔100μ 1，每個稀釋倍數8孔。病毒在2小時內完成對細胞的吸附，此時將培養板中的培養液換為維持培養基。72?120小時內病毒在細胞內的增殖達到預期水平，可以進行免疫過氧化物酶實驗。
[0031]5.將細胞培養板中的培養基棄去，用生理鹽水清洗一遍，放入80°C恆溫乾燥箱中熱固定I小時，固定後每孔加入50 μ I進行100倍稀釋的HRP021.2酶標抗體，37°C孵育I小時，用含0.1 % Tween20的PBS清洗5次，每孔再加入50 μ I AEC底物，室溫孵育30min，顯微鏡下觀察。
[0032]6.將陽性孔數記錄下來，按照中國獸藥典中規定的方法計算滴度。其滴度的對比見圖1。
[0033]實施例2
[0034]1.選擇接毒方式:單層接毒。
[0035]2.選擇細胞:MPK細胞。
[0036]3.選擇稀釋病毒用培養基:含1%?4% PEG和不含PEG的培養基。
[0037]4.本實施例中將MPK細胞用生長培養基按I?5X IO4個/孔的密度接種在96孔細胞培養板中，每孔200 μ I。細胞培養板置於恆溫培養箱中,調整條件為:生長溫度36.5?37.51:、0)2濃度為2(%?4(%。96?144小時後，細胞長為緊密貼壁的單層，此時可以接毒。
[0038]5.將待測病毒分別用含I %?4% PEG的培養基和不含PEG的培養基進行10倍稀釋，分別將不同稀釋倍數的病毒液接種到已有單層細胞的培養板中，每孔100μ 1，每個稀釋倍數8孔。病毒在2小時內完成對細胞的吸附，此時將培養板中的培養液換為維持培養基。72?120小時後病毒在細胞內的增殖達到預期水平，可以進行免疫過氧化物酶實驗。
[0039]6.將細胞培養板中的培養基棄去，用生理鹽水清洗一遍，放入80°C恆溫乾燥箱中熱固定I小時，固定後每孔加入50 μ I進行100倍稀釋的HRP021.2酶標抗體，37°C孵育I小時，用含0.1 % Tween20的PBS清洗5次，每孔再加入50 μ I AEC底物，室溫孵育30min，顯微鏡下觀察。
[0040]7.將陽性孔數記錄下來，按照中國獸藥典中規定的方法計算滴度。其滴度的對比見圖2。
[0041]實施例3
[0042]1.選擇接毒方式:單層接毒。
[0043]2.選擇細胞:MPK細胞。
[0044]3.本實施例中將MPK細胞用生長培養基按I?5X IO4個/孔的密度接種在96孔細胞培養板中，每孔200 μ I。細胞培養板置於恆溫培養箱中,調整條件為:生長溫度36.5?37.51:、0)2濃度為2(%?4(%。96?144小時後，細胞長為緊密貼壁的單層，此時可以接毒。
[0045]4.將待測病毒分別用含I %?4% PEG的培養基稀釋到750RID5(I，將稀釋的病毒液接種到已有單層細胞的培養板中，每孔ΙΟΟμ 1，接種8孔。病毒在2小時內完成對細胞的吸附，此時將培養板中的培養液換為維持培養基。72?120小時後病毒在細胞內的增殖達到預期水平，可以進行免疫過氧化物酶實驗。
[0046]5.將細胞培養板中的培養基棄去，用生理鹽水清洗一遍，放入80°C恆溫乾燥箱中熱固定I小時，固定後每孔加入50 μ I進行100倍稀釋的HRP021.2酶標抗體，37°C孵育I小時，用含0.1 % Tween20的PBS清洗5次，每孔再加入50 μ I AEC底物，室溫孵育30min，顯微鏡下觀察。
[0047]6.觀察顯示，所有孔均有顯色，說明此方法的靈敏度可以達到獸藥典對病毒效力檢測的規定。
[0048]上述實施例中使用的生長培養基是經過優化的，適合MPK細胞生長的培養基。每升液體培養基含有5?8克的高糖DMEM，3.5?5.5克的M199，1.5?3克的NaHCO3, 50?120毫升的牛血清，培養基的pH為7.2?7.4。上述實施例中使用的細胞培養基為經優化的維持培養基，每升液體培養基含有5?8克的高糖DMEM，3.5?5.5克的M199，l.5?3克的NaHCO3,10?40毫升的牛血清；培養基的pH為7.2?7.4。
【權利要求】
1.一種採用辣根過氧化物酶免疫技術檢測豬瘟病毒弱毒滴度的方法，其特徵在於在於挑選出對豬瘟弱毒株高度敏感的MPK傳代細胞，將此細胞在96孔培養板中培養至長滿單層，之後接種不同稀釋度的豬瘟病毒，持續培養後，加入辣根過氧化物酶標記的抗體共同孵育，最後加入底物使受到感染的細胞培養物顯色，通過顯色的孔數佔總孔數的百分比計算病毒滴度，具體步驟為: (1)使MPK細胞在96孔培養板中長成單層； (2)將待測病毒液進行梯度稀釋，接種於細胞單層，用維持培養基維持細胞生長； (3)持續培養72?120小時後，將細胞培養物熱固定，加入辣根過氧化物酶標抗體在37°C下孵育，再加入底物於常溫下孵育； (4)在顯微鏡下觀察細胞培養物的顯色情況，根據顯色孔數的百分比計算病毒的滴度。
2.根據權利要求1所述的一種採用辣根過氧化物酶免疫技術檢測豬瘟病毒弱毒滴度的方法，其特徵在於步驟(I)中使用的細胞生長培養基是經過優化的，適合MPK細胞生長的培養基，其中每升液體培養基含有5?8克gibco公司生產的高糖DMEM，3.5?5.5克gibco公司生產的M199，1.5?3克上海滬試化工有限公司生產的NaHCO3, 50?120毫升太原潤生生物材料有限公司生產的牛血清，培養基的pH為7.2?7.4。
3.根據權利要求1所述的一種採用辣根過氧化物酶免疫技術檢測豬瘟病毒弱毒滴度的方法，其特徵在於步驟(2)中細胞培養基為經優化的維持培養基。其中每升液體培養基含有5?8克gibco公司生產的高糖DMEM，3.5?5.5克gibco公司生產的M199，1.5?3克上海滬試化工有限公司生產的NaHCO3,10?40毫升太原潤生生物材料有限公司生產的牛血清，培養基的pH為7.2?7.4。
4.根據權利要求1所述的一種採用辣根過氧化物酶免疫技術檢測豬瘟病毒弱毒滴度的方法，其特徵在於MPK細胞在96孔培養板內適宜生長的溫度為36.5?37.5°C，適宜培養的pH為7.0?7.5，適宜的CO2濃度為2%?4%，接種病毒前最佳培養時間為96?144小時，接種病毒後最佳培養時間為72?120小時。
5.根據權利要求1所述的一種採用辣根過氧化物酶免疫技術檢測豬瘟病毒弱毒滴度的方法，其特徵在於步驟(2)中接種病毒時使用Sigma公司生產的分子量為600?1500的聚乙二醇(PEG)來提高病毒對細胞的感染率，優選的PEG濃度為
6.根據權利要求1所述的一種採用辣根過氧化物酶免疫技術檢測豬瘟病毒弱毒滴度的方法，其特徵在於步驟(I)中細胞接種優選的密度為I?5X IO4個/孔。
7.根據權利要求1所述的一種採用辣根過氧化物酶免疫技術檢測豬瘟病毒弱毒滴度的方法，其特徵在於使用的酶標抗體為PrioCON公司的HRP021.2。
8.根據權利要求1所述的一種採用辣根過氧化物酶免疫技術檢測豬瘟病毒弱毒滴度的方法，其特徵在於使用的底物為Sigma公司生產的3-氨基-9-乙基-咔唑(AEC)用N，N-二甲基甲醯胺按照4mg/ml的濃度溶解配置而成的。
【文檔編號】G01N33/569GK103777009SQ201210396578
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月18日 優先權日:2012年10月18日
【發明者】錢浩洲, 陳中秋 申請人:遼寧成大動物藥業有限公司