嵌合型可溶性超il－11和其應用的製作方法

2023-05-29 03:50:21

專利名稱：嵌合型可溶性超il－11和其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新設計的被命名為H11的細胞因子，其通過用它們的天然序列融合兩種可溶性組分，可溶性白介素11受體(sIL-11R)和白介素11(IL-11)，來構建，和它在製造用於治療或預防疾病的藥物中的應用，所述疾病選自增殖性疾病、細胞病變、輻射損傷、IL-11依賴的炎性疾病、IL-11依賴的退行性疾病和IL-11依賴的或介導的軟組織疾病。
背景技術：
IL-11是一種功能性多效細胞因子(綜述於Du et al.，1997)。最初它在1990年時被鑑定為一種促進IL-6依賴的小鼠漿細胞瘤細胞系生長的分子(Paul et al.，1990)。後來證明IL-11不但對造血系統表現出多重作用，而且它還作用於很多不同的細胞類型肝、胃腸道、肺、心、中樞神經系統、骨、關節和免疫系統(綜述於Du et al.，1997和Schwertschlag et al.，1999)。IL-11和其它生長因子一起在體外和體內協同作用於造血作用的不同階段，包括作用於祖細胞、巨核細胞生成和血小板生成、紅細胞生成、骨髓細胞生成。它也影響造血的微環境(Du et al.，1997)。由於它的造血活性，IL-11已經在嚴重的化療誘導的和骨髓移植誘導的血小板減少症中被檢驗。動物模型中的試驗已經揭示IL-11刺激血小板生成(Hawley et al.，1996)和加速骨髓移植後外周血嗜中性粒細胞和血小板的恢復(Du et al.，1993)。在癌症患者中的I期和II期臨床試驗已經證明了IL-11在加速多細胞譜系造血細胞的恢復和減輕血小板減少症中的潛力(Gordon et al.，1996，Tepler et al.，1996，Isaacs et al.，1997)。美國FDA已經批准IL-11用於治療化療引起的血小板減少症。已經證明IL-11由於它抑制核因子-KB(NF-KB)核轉位的能力而顯示出抗炎活性(Trepicchio et.Al，1997)，這降低了巨噬細胞分泌的促炎性細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)、IL-1β、IL-6、IL-12的生成(Trepicchio et al.，1996，Leng et al.，1997，Redlich et al.，1996)。動物模型和臨床試驗中的大量研究已經證明IL-11在治療包括炎性腸病的炎性疾病(Peterson et al.，1998)、輻射引起的肺損傷(Redlich et al.，1996)、敗血症(Chang et al.，1996)、類風溼性關節炎(Anguita et al.，1999，Walmsley et al.，1998)、炎性肝病(Bozza et al.，1999)、黏膜炎(Sonis et al.，1997)和銀屑病(Trepicchio et al.，1999)中的功效。因此IL-11被認為是在多種炎性疾病中的潛在治療劑。如上所述，IL-11在淋巴造血系統之外也被證明具有多樣的生物活性。這些包括在肝細胞中誘導急性期蛋白的合成(Baumman et al.，1991)、在脂肪細胞中抑制脂蛋白脂酶活性(Ohsumi et al.，1994)、在永生化海馬神經元中誘導分化(Mehler et al.，1993)、參與破骨細胞發育(Girasoleet al.，1994)、刺激金屬蛋白酶的組織抑制因子產生(Maier et al.，1993)。此外，已經證明IL-11在雌性生育中發揮重要作用，因為缺乏IL-11R的小鼠是不育的，這是由於其對胚胎植入的缺陷性子宮反應(Robb et al.，1998)。月經周期期間IL-11和IL-11R在人子宮內膜中的表達指出IL-11活性在人類女性生育中可能是一個關鍵因子(Dimitriadis et al.，2000，Karpovich et al.，2003)。
IL-11與IL-6、白血病抑制因子(LIF)、制瘤素M(OSM)、睫狀神經營養因子(CNTF)、心臟營養素1(CT-1)都屬於造血細胞因子家族(被命名為IL-6型或gp130細胞因子)，它們具有結構相似性和共同的受體亞基(gp130)(Bazan etal.，1990)。雖然每種IL-6型細胞因子要求特異性(獨特的)受體複合體，但是至少一分子的gp130總是被利用的。最初時，配體(IL-6、IL-11、CNTF)特異性結合它的非信號傳遞受體亞基和隨後募集信號傳遞受體鏈。IL-6和IL-11使用gp130同二聚體用於轉導信號，而LIF、CNTF、CT-1利用異二聚體gp130/LIFR。OSM或者募集gp130/OSMR或者gp130/LIFR異二聚體(綜述於Heinrich et al.，2003，Bravo et al.，2000)。
IL-6型細胞因子的三級結構在最近幾年已經被詳細研究。LIF(Robinson et al.，1994)、CNTF(McDonald et al.，1995)、IL-6(Somers et al.，1997)和OSM(Deller etal.，2000)的晶體結構已經被確定。這些研究揭示每種配體都展示長鏈四螺旋束拓撲結構，其包含四個緊密包裝的α螺旋(稱作A、B、C、D)，其長度為15-22個胺基酸。螺旋通過多肽環以上-上-下-下排列相連接，而B-C環較短，因為它連接一對反向平行的螺旋。IL-6型細胞因子的詳細結構分析和突變研究已經鑑定了三種受體結合位點(命名為I、II、III)，其在gp130家族中似乎是保守的(綜述於Bravo et al.，2000)。位點I，其使得配體能夠結合它的非信號傳遞受體，其由A-B環的C-末端部分和D螺旋的C末端殘基形成。位點II似乎是IL-6型細胞因子的所有成員的通用gp130結合位點，它是由螺旋A和C上暴露的殘基組成的。位點III是由螺旋D的N末端部分、A-B環的N-末端部分和C-D環末端的胺基酸殘基組成的。這個位點總是被第二個信號傳遞受體所佔據，比如根據配體不同可以是gp130、LIFR或OSMR。
參與IL-6型細胞因子信號傳遞的受體屬於I型膜蛋白。它們具有細胞外N-末端和一個跨膜結構域(CNTFR除外，其通過脂質錨連接到膜(Davis et al.，1991))。由於它們細胞外區域的共同結構基序，它們被分類為I類細胞因子受體家族(Bazan etal.，1990)。該家族的特徵在於存在至少一個細胞因子結合同源性結構域(CHD)，其由被稱為D2和D3的兩個III型纖連蛋白樣結構域(FNIII)組成。CHD由約200個胺基酸組成，其在N-末端結構域中有四個位置保守的半胱氨酸殘基和在C-末端結構域具有特徵性保守Trp-Ser-X-Trp-Ser(WSXWS)基序。此外，每個受體亞基含有Ig樣結構域，其定位於近膜CHD的N-末端。IL-6型受體被分為兩組α和β亞基。受體α(對於IL-6、IL-11和CNTF)不參與信號轉導。亞基β，是信號轉導受體鏈，其含有比α亞基大得多的細胞質部分並且具有三個近膜FNIII結構域，這些結構域可能在比如跨膜受體二聚體的穩定和/或定向中發揮一些作用(綜述於Bravo et al.，2000，Heinrich et al.，2003)。除了膜結合的IL-6型受體亞基以外，它們的可溶性形式在生物液中被發現(綜述於Marz et al.，1999)。它們或者通過膜結合受體的限制性蛋白裂解作用(脫落)或者通過從差異剪接mRNA翻譯而形成。
按照Czupryn et al.所建議的結構模型，IL-11具有四螺旋束拓撲結構(Czuprynet al.，1995)。廣泛的結構分析和突變研究已經確定了三個受體結合位點，類似於IL-6或CNTF的位點I、II和III的位置。這些位點在小鼠以及人IL-11中已經被表徵(分別在Barton et al.，1999，Tacken et al.，1999)。位點I使IL-11能夠結合αIL-11R，而位點II和III介導與兩個不同gp130分子的結合。羧基末端缺失突變研究已經證明去除最後4個胺基酸使重組人IL-11(rhIL-11)的活性降低25倍，而去除C-末端8個或更多殘基完全消除了它的活性(Czupryn et al.，1995)。對配體-受體相互作用位點的詳細研究能創造新的強效IL-11拮抗劑和激動劑(分別為Underhill-Day et al.，2003，Harmegnies et al.，2003)。通過將一或兩個胺基酸替換為其它胺基酸而創建以上分子，其分別導致配體/受體形成的抑制和增加。
IL-11Rα亞基已經在小鼠和人中被描述(分別為Hilton et al.，1994，Cherel et al.，1995 and Nandrukar et al.，1996)。人IL-11Rα鏈的兩種同種型已經被鑑定(Cherelet al.，1996)。它們的細胞質結構域是不同的，而細胞外和跨膜部分是相同的。第一種同種型(IL-11Rα1)具有短的細胞質結構域，另一種(IL-11α2)缺少這個區域。當在用gp130轉染的Ba/F3細胞上進行測試時，兩種同種型都表現相似的功能和特性(Lebeau et al.，1997)。從結構上看，αIL-11R的細胞外部分可以分成三個結構域Ig樣結構域(D1)，和一個由兩個FNIII結構域(D2和D3)組成的CHD(Cherelet al.，1995)。對於IL-11Rα鏈中參與配體結合的胺基酸殘基了解很少，因為迄今為止對IL-11R的CHD沒有可用的結構信息。Schleinkofer et al.最近的研究證明D3結構域主要參與配體相互作用，因為這個結構域的結合能力與全長受體的結合能力同樣高(Schleinkofer et al.，2001)。然而，以人生長激素及其受體複合物的X射線結構(de Vos et al.，1992)以及作為模板的人CNTF結構(McDonald et al.，1995)為基礎，他們已經建立IL-11/IL-11R複合體的分子模型，該模型證明與IL-11位點I結合的IL-11R的區域位於結構域D2和D3之內。基於這個模型，以及對IL-6/IL-6R相互作用的模擬，因為D3結構域對配體結合是充分的但是對gp130結合不充分(Ozbek et al.，1998)，Schleinkefer研究組推測D2結構域似乎參與(i)結構域間的穩定作用，(ii)提供特異性或(iii)形成與gp130亞基的界面或(iv)需要它來誘導與gp130相互作用所必需的配體位點III中的構象變化(Schleinkofer et al.，2001)。IL-11R的Ig樣結構域的作用沒有被確定，對於IL-6R儘管它對於組裝功能性受體不是必需的(Yawata et al.，1993)，在細胞內運輸期間它使受體穩定(Vollmeret al.，1999)。
高親合力IL-11受體複合物的計量關係已經被體外確定為六聚體複合物，其由兩個IL-11分子、兩個IL-11Rα鏈和gp130分子的同二聚體組成(Barton et al.，2000)。據預測IL-11通過位點I結合αIL-11R，通過位點II結合gp130的CHD和通過位點III結合第二個gp130的Ig樣結構域。然而，IL-11配體/受體複合物的化學計量仍然在爭論之中。Grotzinger et al.已經提出形成了四聚體複合物，其中IL-11首先結合特異性α受體的CHD緊接著通過該細胞因子的位點II和III與兩分子的gp130組裝成四聚體(Grotzinger et al.，1997)。對於IL-6，該四聚體能夠結合另外的IL-6/IL-6R複合物，形成六聚體的但是非信號傳遞的複合物(Grotzinger et al.，1999)。Neddermann et al.提出在體外形成五聚體複合物，其由兩個IL-11、兩個IL-11R和一個gp130分子組成。然而，他們建議有另一個未鑑定的β鏈，其有助於六聚體受體複合物的形成(Neddermann et al.，1996)。Harmegnies et al.最近的研究支持以上數據(Harmegnies et al.，2003)。他們創建了一個IL-11的突變蛋白，其在位點I具有增加的疏水性，其被證明是一種強IL-11激動劑並表現出不同的生物活性。根據在活性評估中使用的細胞模型，當與野生型IL-11比較時，突變的IL-11表現出增加或降低的激動特性。另一方面，對IL-11拮抗劑的研究支持由Barton et al.提出的六聚體複合物(Underhill-Day et al.，2003)。
IL-11Rα鏈的可溶性形式(sIL-11R)已經被推測是存在的，儘管迄今為止在體液中還沒有被發現。它的存在是基於鑑定了潛在編碼IL-11R可溶性形式的轉錄本(Robb et al.，1996)。重組sIL-11R在體外可作為IL-11的激動劑(Baumann et al.，1996，Neddermann et al.，1996，Karow et al.，1996，Curtis et al.，1997)。另外，sIL-11R不但加強IL-11對正常情況下應答IL-11的細胞的作用，而且僅在IL-11存在下介導表達gp130分子的細胞中的信號轉導(Baumann et al.，1996，Karow et al.，1996)。然而，用sIL-11R介導生物學反應所需的IL-11濃度必須比使用膜受體高10-20倍(Curtis et al.，1997)。因為IL-11R的表達限制於某些細胞類型，而gp130在身體的所有細胞上都存在，使用sIL-11R顯著擴大了IL-11生物活性的範圍。進一步說，當在表達膜結合形式IL-11R和gp130的細胞上進行測試時，觀察到sIL-11R能夠作為IL-11拮抗劑(Curtis et al.，1997)。觀察到的拮抗作用是由於在重組sIL-11R和跨膜IL-11R之間對IL-11的競爭和/或是依賴於gp130分子的數量。然而，這些發現顯示sIL-11R的生理作用比sIL-6R更加複雜，並且對於sIL-6R所獲得的結果不能直接應用於sIL-11R。
為了增加和修飾一些分子劑的潛在生物活性，將兩個可溶性的天然存在的組分連接的想法已經被提出。融合蛋白被預期是更穩定的並且只需要更低的有效劑量以支持生物活性。這類重組融合蛋白已經被描述過。IL-12中被分開編碼的亞基(p35和p40)已經通過多肽連接子被連接(Lieschke et al.，1997)。超-IL-6是新設計劑的另一個實例，其由經多肽連接子與IL-6連接的IL-6Rα鏈的D2和D3結構域組成(Fischer et al.，1997，WO 97/32891)。對於IL-6，觀察到刺激缺少膜IL-6R細胞所需要的IL-6和sIL-6R的有效濃度是非常高的(Rose-John et al.，1990)。此外，IL-6/sIL-6R複合物的平均半衰期也許比組裝IL-6/sIL-6R/gp130複合物所需要的時間更短(Wells et al.，1996)。通過連接兩種組分以創建融合蛋白(超-IL-6)，使IL-6/sIL-6R複合物的穩定性增加(WO 97/32891)。超-IL-6能夠直接結合到它的信號轉導受體亞基並增強IL-6的活性。超-IL-6是全活性的融合蛋白，與可溶性IL-6和sIL-6R分子的組合相比較其以低10-1000倍的劑量介導反應(Fischer et al.，1997)。與之相似，已經設計了另一個IL-6型家族的稱為IL-11/R-FP的超級激動劑(Pflanz etal.，1999)。通過用21個胺基酸的連接子使IL-11R的D2和D3結構域(位置L/109-G/318)與IL-11(位置P/29-L/199)共價連接創建IL-11/R-FP，並且其在體外表現出比IL-11和sIL-11R的組合具有高50倍的活性。然而，這個構建體是由截短的人IL-11R和IL-11的片段組成的，因此分別缺少受體和細胞因子天然存在的部分。此外，所用的人工連接子不是天然存在的序列，當用其治療人類患者時將增加IL-11/R-FP的免疫原性。
因此，本發明的一個目的是構建一種新設計的細胞因子超IL-11(H11)，其由天然存在的組分組成，其在人宿主中只引起輕微的或不引起免疫原性並且其能夠在體內提供超過現有技術IL-11/R-FP的抗腫瘤反應。
本發明的第二個目的是H11用於治療和/或預防增殖性疾病、細胞病變、輻射損傷、IL-11依賴的炎性疾病、IL-11依賴的退行性疾病、IL-11依賴或介導的軟組織疾病的用途。
本發明的第三個目的是構建載體系統，尤其是攜帶H11的逆轉錄病毒、慢病毒和腺病毒載體，用於修飾癌細胞以及其它哺乳動物細胞，以及這些修飾細胞的用途，例如，用來治療和/或預防癌症、尤其是黑素瘤、腎癌或胰腺癌的基因修飾腫瘤疫苗(GMTV)。
本發明的進一步的目的包括在不同表達系統包括杆狀病毒表達系統中生產融合蛋白H11，和這種蛋白用於治療或預防以下疾病的用途增殖性疾病、細胞病變、輻射損傷、IL-11依賴的炎性疾病、IL-11依賴的退行性疾病和IL-11依賴或介導的軟組織疾病。

發明內容
白介素11(IL-11)是一種多效細胞因子，最初被鑑定為一種刺激IL-6依賴的小鼠漿細胞瘤細胞系T1165增殖的因子(Paul et al.，1990)。現在已知IL-11與大量造血和非造血細胞類型發生相互作用(Du et al.，1997)。
IL-11受體複合物包括特異的α亞基和gp130。已經證明與sIL-6R對IL-6相似，sIL-11R對IL-11是激動性的(Baumann et al.，1996)。此外，已經顯示轉導IL-11進入小鼠黑素瘤細胞系B78H1細胞抑制腫瘤的生長(Dams-Kozlowska et al.，2000)。然而，如果與單獨IL-11比較，sIL-11R修飾的B78H1細胞和IL-11分泌性B78H1細胞的混合物對腫瘤的生長沒有更加優異的作用。為了增強體內IL-11活性，我們設計了一種新的細胞因子，稱為超IL-11(Hyper IL-11，H11)，其顯示出提高的體內抗腫瘤活性。H11的構建是基於αIL-11R的可溶形式(αIL-11R的細胞外部分，為了使其分泌包括它的信號序列)與IL-11序列(沒有信號序列或沒有信號序列的大部分)相連接。
因此本發明的一個方面提供多聚核苷酸，其選自(a)多聚核苷酸，其編碼融合白介素-11受體(IL-11R)和IL-11多肽(H11)，其至少包含具有如SEQ ID NO1所示推演胺基酸序列的sIL-11R和具有如SEQ IDNO2所示推演胺基酸序列的成熟IL-11；(b)編碼H11的多聚核苷酸，其包含如SEQ ID NO4所示sIL-11R的編碼序列和如SEQ ID NO5所示IL-11的編碼序列；
(c)多聚核苷酸，其編碼由(a)-(b)中任意一個多聚核苷酸編碼的H11的片段和/或衍生物，其中與所述H11比較，在所述衍生物中一個或多個胺基酸殘基被保守性替換，並且所述片段和/或衍生物具有體內抗腫瘤活性；(d)多聚核苷酸，其與(a)-(c)中定義的任一多聚核苷酸具有至少70％一致性，且其編碼具有體內抗腫瘤活性的H11；和(e)多聚核苷酸，其互補鏈，優選在嚴謹條件下，與(a)-(d)中定義的任一多聚核苷酸雜交，且其編碼具有體內抗腫瘤活性的H11；或這樣的多聚核苷酸的互補鏈。
在一個優選實施方案中，編碼sIL-11R的多聚核苷酸定位在編碼成熟IL-11的多聚核苷酸的5』末端。
在一個優選實施方案中，介於編碼sIL-11R和成熟IL-11的多聚核苷酸之間的核苷酸序列編碼一種非免疫原性的肽。
在一個優選實施方案中，編碼sIL-11R和成熟IL-11的多聚核苷酸被直接連接。
在一個優選實施方案中，多聚核苷酸選自(a)多聚核苷酸，其編碼具有如SEQ ID NO3所示推演胺基酸序列的H11；(b)多聚核苷酸，其包括如SEQ ID NO6所示的H11的編碼序列；(c)多聚核苷酸，其編碼由(a)-(b)中任意一個多聚核苷酸編碼的H11的片段和/或衍生物，其中與所述H11比較，在所述衍生物中一個或多個胺基酸殘基被保守性替換，並且所述片段和/或衍生物具有體內抗腫瘤活性；(d)多聚核苷酸，其與(a)-(c)中定義的任一多聚核苷酸具有至少70％一致性，且其編碼具有體內抗腫瘤活性的H11；和(e)多聚核苷酸，其互補鏈，優選在嚴謹條件下，與(a)-(d)中定義的任一多聚核苷酸雜交，且其編碼具有體內抗腫瘤活性的H11；或這樣的多聚核苷酸的互補鏈。
在本發明的多聚核苷酸的一個優選實施方案中，多聚核苷酸是DNA、基因組DNA或RNA。
本發明進一步的方面是載體，其含有至少一種本發明的多聚核苷酸。
在本發明的載體的一個優選實施方案中，多聚核苷酸可操作性連接到表達調控序列，其允許在原核和/或真核宿主細胞中表達。
在本發明載體的一個優選實施方案中，表達調控序列選自CMV、SV40、多角體蛋白啟動子、逆轉錄病毒LTRs、磷酸甘油酸激酶(PKG)、延伸因子1-α(EF1α)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)。
在本發明載體的一個優選實施方案中，所述載體選自質粒；噬菌粒；噬菌體；粘粒；人工哺乳動物染色體；人工酵母染色體；敲除或敲入構建體；病毒，尤其是腺病毒、痘苗病毒、減毒痘苗病毒、金絲雀痘病毒、慢病毒、皰疹病毒尤其是單純皰疹病毒、杆狀病毒、逆轉錄病毒、腺相關病毒(AAV)、鼻病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、絲狀病毒及其工程化形式；病毒體；病毒樣顆粒；和脂質體。
本發明進一步的方面是用本發明多聚核苷酸或本發明載體遺傳工程改造的宿主細胞。
在一個優選實施方案中，宿主細胞選自昆蟲細胞，尤其是粉紋夜蛾(Trichoplusiani)和草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)；哺乳動物細胞，特別是幹細胞、肝細胞、脂肪細胞、神經元、破骨細胞、子宮內膜細胞、皮膚細胞、心肌細胞、黏膜細胞、造血細胞或腫瘤細胞，例如小鼠骨髓瘤細胞系-NSO；細菌細胞，特別是埃希氏菌屬或芽孢桿菌屬和酵母細胞，特別是畢赤酵母屬(Pischia)或酵母屬(Saccharomyces)。
在一個更優選的實施方案中，宿主細胞選自腎癌細胞、黑素瘤細胞、胰腺癌細胞、白細胞、包裝細胞，特別是雙嗜性或親嗜性包裝細胞。
在本發明宿主細胞的一個優選實施方案中，宿主細胞被遺傳工程改造以進一步表達至少一種多聚核苷酸。
在本發明宿主細胞的一個優選實施方案中，進一步的多聚核苷酸編碼一種細胞因子，特別是GM-CSF、IL-6、IL-11、IL-15、EPO、幹擾素、LIF、OSM、CNTF、CT-I和sIL-6R/IL-6融合蛋白(例如超IL-6)。
本發明進一步的方面是製備能表達H11的細胞的方法，包括體外用本發明的載體基因工程化細胞，其中所述H11是由本發明的多聚核苷酸編碼的。
本發明進一步的方面是製備由本發明多聚核苷酸編碼的H11多肽的方法，其包括培養本發明的宿主細胞和回收由所述多聚核苷酸編碼的H11多肽。
本發明進一步的方面是具有由本發明多聚核苷酸編碼的胺基酸序列的或由本發明方法可獲得的H11多肽。
本發明進一步的方面是對由本發明多聚核苷酸編碼的胺基酸序列的或由本發明方法可獲得的多肽有特異性的抗體，其對sIL-11R和IL-11基本是無特異性的。
本發明進一步的方面是藥物組合物，其包含本發明的或根據本發明方法可獲得的宿主細胞、或者本發明的或根據本發明方法可獲得的H11融合多肽，進一步包含賦形劑、穩定劑、保護劑、緩衝劑和/或添加劑。
本發明進一步的方面是本發明的或根據本發明方法可獲得的宿主細胞、或者本發明的或根據本發明方法可獲得的H11融合多肽的應用，用於製備用於預防或治療選自以下疾病的藥物增殖性疾病、細胞病變、輻射損傷、IL-11依賴的炎性疾病、IL-11依賴的退行性疾病和IL-11依賴或介導的軟組織疾病。
在一個優選實施方案中，增殖性疾病選自胃腸或結直腸道癌、肝癌、胰腺癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌、睪丸癌、皮膚癌、眼癌、黑素瘤、發育不良性口腔黏膜癌、侵入性口腔癌、小細胞和非小細胞肺癌、激素依賴性乳腺癌、非激素依賴性乳腺癌、移行和鱗狀細胞癌、神經惡性瘤，包括神經母細胞瘤、神經膠質瘤、星形細胞瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤、血管瘤、內分泌腫瘤、血液新生物包括白血病、淋巴瘤和其它骨髓增殖性和淋巴增殖性疾病、原位癌、增生性損傷、腺瘤、纖維瘤、組織細胞增多症、慢性炎症增生性疾病、血管增生性疾病和病毒誘導增生性疾病；尤其是黑素瘤、胰腺和腎癌。
在一個優選實施方案中，細胞病變選自血小板減少症、血細胞減少症和全血細胞減少症。
在一個優選實施方案中，輻射損傷是放療期間引起的損傷，特別是治療增殖性疾病期間。
在一個優選實施方案中，IL-11依賴的炎性疾病選自肝功能衰竭；肝炎；肝病；敗血症；化療或輻射誘導的組織損傷，尤其是肺損傷；炎性疾病，尤其是炎性腸病，類風溼性關節炎，炎性肝病；黏膜炎；變態反應；子宮內膜異位症；血管炎；內皮炎症相關的血管疾病，尤其是缺血性心臟病或外周血管病；和銀屑病。
在一個優選實施方案中，IL-11依賴的退行性疾病選自退行性CNS疾病、PNS疾病和骨關節炎。
在一個優選實施方案中，IL-11依賴或介導的軟組織疾病選自肥胖症和特發性女性不育。
在一個進一步優選的實施方案中，在施用H11或表達H11的宿主細之前、同時或隨後施用進一步的細胞因子。
本發明一個進一步的方面是本發明的或根據本發明方法可獲得的H11融合多肽的應用，用於製備幹細胞治療期間用於輔助療法的藥物。
本發明一個進一步的方面是本發明的或根據本發明方法可獲得的H11融合多肽的應用，用於細胞的體外分化，尤其是幹細胞或祖細胞。
具體實施例方式
新設計的細胞因子超IL-11(H11)被構建，其是由天然存在的組分所組成。它含有用其天然序列與成熟人IL-11連接的全長人sIL-11R。這種構建有兩個主要的優點(i)它的組分儘可能接近兩種蛋白的天然野生型形式和(ii)因此避免本領域已知的由於重組劑而導致的可能的免疫原性和其它副作用，所述重組劑與天然存在的分子不同，即其是「低野生型」的。
因此本發明在一個方面提供多聚核苷酸，其選自(a)多聚核苷酸，其編碼融合白介素-11受體(IL-11R)和IL-11多肽(H11)，其至少包含具有如SEQ ID NO1所示推演胺基酸序列的sIL-11R和具有如SEQ IDNO2所示推演胺基酸序列的成熟IL-11；(b)編碼H11的多聚核苷酸，其包含如SEQ ID NO4所示sIL-11R的編碼序列和如SEQ ID NO5所示IL-11的編碼序列；(c)多聚核苷酸，其編碼由(a)-(b)中任意一個多聚核苷酸編碼的H11的片段和/或衍生物，其中與所述H11比較，在所述衍生物中一個或多個胺基酸殘基被保守性替換，並且所述片段和/或衍生物具有體內抗腫瘤活性；
(d)多聚核苷酸，其與(a)-(c)中定義的任一多聚核苷酸具有至少70％一致性，且其編碼具有體內抗腫瘤活性的H11；和(e)多聚核苷酸，其互補鏈，優選在嚴謹條件下，與(a)-(d)中定義的任一多聚核苷酸雜交，且其編碼具有體內抗腫瘤活性的H11；或這樣的多聚核苷酸的互補鏈。
H11片段是在IL11或sIL-11R部分的一個或兩個中攜帶N末端和/或C末端缺失的融合蛋白。IL-11被表達為具有199個胺基酸長度的蛋白質，其N末端的21個胺基酸在IL-11成熟過程中被切掉。包含在根據SEQ ID No2的本發明H11中的IL-11片段包含第19-199位胺基酸，即它包含三個胺基酸，「AVA」，其在成熟蛋白質中並不存在。這三個胺基酸能夠被視為在可溶性IL-11受體的功能部分和成熟IL-11之間的天然「間隔區」。
作為H11的部分，按照SEQ ID No2的IL-11的C末端部分的缺失不應該超過6個胺基酸，優選僅為5、4、3、2或1個胺基酸。IL-11的N末端部分的缺失在H11中對IL-11的體內功能沒有顯著影響，因此H11中IL-11的N末端部分能夠缺少10-1個之間的胺基酸，優選為N末端缺失少於10個、少於9個、少於8個、少於7個、少於6個、少於5個、少於4個、少於3個、少於2個、少於1個胺基酸。
不希望受任何理論的限制，發明人相信本發明H11融合多肽超過現有技術IL11融合多肽如Pflanz et al.的IL11融合多肽的令人吃驚的優勢，部分依賴於避免通過缺失sIL-11R的更大部分，即Pflanz et al.所用從AA109開始的sIL-11R片段，而產生新的免疫原性表位，以及依賴於在融合蛋白中包括D1結構域，其在Pflanz et al.的融合產物中缺少。因此，應該避免缺失可溶性IL-11受體的更大部分，因為這既能夠降低體內抗腫瘤活性又能增加體內免疫原性。最低程度的是，使用的sIL-11R分子應該包含IL-11R的D1、D2和D3結構域。根據SEQ ID No1的sIL-11R蛋白能夠在它的C-和/或N-末端有缺失，優選它能夠在其C末端攜帶1-5個C末端胺基酸缺失，更優選4、3、2或1個C末端胺基酸缺失。在單獨表達和在IL-11中即作為sIL-11R-IL-11融合蛋白表達的sIL-11R成熟期間，約22個胺基酸從sIL-11R的N末端被剪除。從而，有可能表達一種H11蛋白，其經蛋白質加工切割而缺少N末端部分，因此在一些優選實施方案中sIL-11R在N末端有22個胺基酸的缺失。D1結構域開始於sIL-11R的AA37，因此，如果H11的sIL-11R部分經工程化處理而具有缺失，它優選缺少N末端1-37個胺基酸。更進一步優選N末端缺失少於37個、少於36個、少於35個、少於34個、少於33個、少於32個、少於31個、少於30個、少於29個、少於28個、少於27個、少於26個、少於25個、少於24個和少於23個胺基酸。
H11的「衍生物」是具有不超過20個(例如，不超過20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1)保守性替換的多肽。保守性替換在本領域是已知的並且典型的包括，例如，一個極性胺基酸替換為另一個極性胺基酸和一個酸性胺基酸替換為另一個酸性胺基酸。因此，保守性替換優選包括以下胺基酸組之內的替換甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸、異亮氨酸和亮氨酸(非極性，脂肪族側鏈)；天冬氨酸、穀氨酸(帶負電側鏈)；天冬醯胺、穀氨醯胺、甲硫氨酸、半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸(極性不帶電側鏈)；賴氨酸、組氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸(芳香族側鏈)；和賴氨酸、精氨酸和組氨酸(帶正電側鏈)。如何確定指定取代的影響在本領域是眾所周知的，例如對pKI等等。具有一個或多個保守性替換的多肽所必需的是它具有設計細胞因子H11至少10％(例如，至少10％；20％；30％；40％；50％；60％；70％；80％；90％；95％；98％；99％；99.5％；或100％或甚至更多)引起體內抗腫瘤反應的能力。
兩個序列間一致性百分率的確定通過使用Karlin和Altschul，1993的數學算法完成。這種算法整合到Altschul et al.，1990的BLASTN和BLASTP程序中。對於比較目的為獲得有間隙比對，使用Altschul et al.，1997描述的Gapped BLAST。當使用BLAST和Gapped BLAST程序時，分別使用程序的預設參數。
雜交也可以被用作確定兩個核酸序列間同源性的手段。編碼本文所公開H11多肽或其一部分的核酸序列，能夠被用作根據標準雜交技術的雜交探針。雜交條件對本領域技術人員是已知的並且其可以從Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley Sons，N.Y.，6.3.1-6.3.6，1991獲得。中度雜交條件被定義為相當於在30℃在2×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然後在50℃在1×SSC、0.1％SDS中洗滌。高嚴謹度條件被定義為相當於在45℃在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然後在65℃在0.2×SSC、0.1％SDS洗滌。
本發明的H11融合蛋白的體內抗腫瘤活性能夠通過多種現有技術方法進行評估，包括在移植有腫瘤細胞的小鼠模型中的腫瘤生長。一個能夠用來評估體內抗腫瘤反應的檢測系統的實例公開於下面的實施例8。被認為具有體內抗腫瘤活性的H11融合多肽應該具有根據SEQ ID NO.3的H11多肽活性的至少10％，優選至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
編碼本文所公開H11多肽的多聚核苷酸可以基於它們與SEQ ID No.4-6中所列序列的相似性進行鑑定。例如，可以基於序列一致性進行鑑定。在某些優選實施方案中，本發明的特徵在於分離的核酸分子，其與以下分子具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性(a)核酸分子，其編碼SEQ ID NOs1-3的多肽或(b)SEQ ID NOs4-6的核酸序列；並且編碼具有體內抗腫瘤活性的H11多肽。
在一個優選實施方案中，編碼sIL-11R的多聚核苷酸位於編碼成熟IL-11的多聚核苷酸的5』端。這種排列是優選的，因為它使得IL-11的C末端區域不被與sIL-11R融合所障礙。
正如上面所指，本發明的一個目的是提供具有強激動作用、體內抗腫瘤作用和具有低抗原性的設計細胞因子。因此，在本發明多聚核苷酸的一個優選實施方案中，在編碼sIL-11R和成熟IL-11的多聚核苷酸序列之間的核苷酸序列編碼基本無免疫原性的肽。更優選地，由基本上無免疫原性肽連接的多聚核苷酸排列方式使得sIL-11R位於編碼成熟IL-11的多聚核苷酸的5』端。術語基本「非免疫原性肽」表示一段短的長1-10個胺基酸的多聚胺基酸序列，優選少於9個、少於8個、少於7個、少於6個、少於5個、少於4個、少於3個、少於2個胺基酸通過肽鍵偶聯，如果與無插入肽的相似融合肽相比較，其基本上不增加對sIL-11-R IL-11融合多肽的免疫反應。
免疫反應的程度能夠通過多種已知的現有技術方法進行評估，例如，確定B細胞刺激作用的檢測等等。評估多肽連接子的免疫原性的另一個方法是用在融合多肽的sIL-11R和IL-11部分之間包含肽連接子的本發明H11多肽免疫測試動物，隨後確定測試動物是否產生特異性識別該肽連接子的抗體。識別的特異性通過比較觀察到的與該肽連接子的結合量和觀察到的與不相關蛋白的結合量進行確定。這類不相關蛋白的實例是非測試動物內源性的蛋白質，包括，例如牛血清白蛋白、乳蛋白等。與不相關蛋白質相比較，如果測試動物的多克隆血清對該肽連接子顯示出5倍或更小、優選4倍或更小、更優選3倍或更小和最優選2倍或更小的特異性，則該肽連接子被認為基本無免疫原性。
基本無免疫原性的連接子的實例是具有小側鏈的胺基酸的片段，所述小側鏈胺基酸，例如，甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蘇氨酸或絲氨酸，並能夠按下式描述NX，其中在長為X的肽鏈的每個位置上N獨立地表示A、G、S、T或V，並且X表示1、2、3、4、5、6、7、8、9-10。連接子序列能夠用於在H11的IL-11R和IL-11部分之間保持與在根據SEQ ID No3的sIL-11R-IL-11融合物中實現的，即IL-11R的AA 314處D3亞結構域的末端和IL-11的AA 35處IL-11第一個預測α螺旋區域之間，相同的距離。在本發明的優選多肽SEQ ID No.3中所述距離是67AA，並且通過連接子的缺失和/或插入使其保持在62AA到72AA。因此，如果SEQ ID No2的IL-11的「天然連接子」被刪除，這個序列可以替換為上述連接子使距離維持在上述範圍內，例如如果根據SEQ ID No1的sIL-11R的C末端有1-5AA缺失和根據SEQ ID No2的IL-11的N末端有1-6AA缺失，可以插入連接子以維持兩個參考點間的總體距離。優選的是，插入連接子以保持距離為62-72AA，優選在63、64、65、66、67、68、69、70或71AA範圍。連接子的總長應該保持儘可能的短，以避免產生潛在有害的免疫原性表位。在本發明的一種優選排列中，其中sIL 11R位於N末端和IL-11蛋白定位於C末端和其中sIL-11R部分優選攜帶不超過因此，在一個優選實施方案中，連接子選自A、G、S、T、V；AA、AG、AS、AT、AV、GA、GG、GS、GT、GV、SA、SG、SS、ST、SV、TA、TG、TS、TT、TV、VA、VG、VS、VT、VV；AAA、AAG、AGA、GAA、AAS、ASA、SAA、AAT、ATA、TAA、AAV、AVA、VAA、GGG、GGA、GAG、AGG、GGS、GSG、SGG、GGT、GTG、TGG、GGV、GVG、VGG、SSS、SSA、SAS、ASS、SSG、SGS、GSS、SST、STS、TSS，SSV、SVS、VSS、VVV、VVA、VAV、AVV、VVG、VGV、GVV、VVS、VSV、SVV、VVT、VTV、TVV、AGS、ASG、GAS、GSA、SAG、SGA、AGT、ATG、GAT、GTA、TAG、TGA，AGV、AVG、GAV、GVA、VAG、VGA、AST、ATS、SAT、STA、TAS、TSA、ASV、AVS、SAV、SVA、VAS、VSA、GST、GTS、SGT、STG、TGS、TSG、GSV、GVS、SGV、SVG、VGS、VSG、STV、SVT、TSV、TVS、VST和VTS。
在本發明多聚核苷酸的一個特別優選的實施方案中，編碼sIL-11R和成熟IL-11的多聚核苷酸被直接連接。在本文中「直接連接」表示沒有編碼非天然存在連接子的非天然存在的核苷酸位於編碼多聚核苷酸的sIL-11R和IL-11之間。
在一個進一步優選的實施方案中，多聚核苷酸選自(a)多聚核苷酸，其編碼具有如SEQ ID NO3所示推演胺基酸序列的H11；(b)多聚核苷酸，其包括如SEQ ID NO6所示的H11的編碼序列；(c)多聚核苷酸，其編碼由(a)-(b)中任意一個多聚核苷酸編碼的H11的片段和/或衍生物，其中與所述H11比較，在所述衍生物中一個或多個胺基酸殘基被保守性替換，並且所述片段和/或衍生物具有體內抗腫瘤活性；(d)多聚核苷酸，其與(a)-(c)中定義的任一多聚核苷酸具有至少70％一致性，且其編碼具有體內抗腫瘤活性的H11；和(e)多聚核苷酸，其互補鏈，優選在嚴謹條件下，與(a)-(d)中定義的任一多聚核苷酸雜交，且其編碼具有體內抗腫瘤活性的H11；或這樣的多聚核苷酸的互補鏈。
在優選實施方案中所用術語「片段」、「衍生物」和「體內腫瘤活性」具有與上述相同的意思。
本發明的編碼H11的核酸分子可以是DNA、cDNA、基因組DNA、合成DNA或RNA，且可以是雙鏈或單鏈，正義鏈和/或反義鏈。這些分子的區段也被認為在本發明的範圍內，並且可以通過，例如，多聚酶鏈反應(PCR)製備或用一種或多種限制性內切酶處理產生。核糖核酸(RNA)分子能夠通過，例如，體外轉錄產生。
本發明的多聚核苷酸分子可以含有天然存在的序列，或這樣的序列，其不同於那些天然存在的序列，但是由於遺傳密碼的簡併性而編碼同樣多肽，即具有SEQ IDNOs1-3的多肽。多聚核苷酸分子能夠在3』和/或5』端末尾包括另外的多聚核苷酸，其編碼進一步的多肽。
本發明的融合多聚核苷酸分子的多聚核苷酸能夠在體外合成(例如，基於亞磷醯胺合成)或者能夠從細胞，比如細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞獲得。
本發明進一步的方面是含有本發明多聚核苷酸的載體或者由本發明多聚核苷酸編碼的H11融合蛋白。術語「載體」表示一種裝置，其包括，例如，蛋白質或多聚核苷酸或其混合物，其能夠被引入細胞或將本發明的蛋白質和/或多聚核苷酸引入細胞。某些載體特別適合用於將多聚核苷酸或多肽引入僅僅一些特異性細胞類型，而另一些載體能夠被引入到多種不同的細胞類型。本領域技術人員知道如何根據細胞類型選擇特定的載體，以使多聚核苷酸或多肽被引入所述細胞中。
在一個優選實施方案中，本發明的載體包括質粒；噬菌粒；噬菌體；粘粒；人工染色體，尤其是人工哺乳動物染色體或人工酵母染色體；敲除或敲入構建體；病毒，尤其是腺病毒、痘苗病毒、減毒痘苗病毒、金絲雀痘病毒、慢病毒(Chang and Gay，2001)、皰疹病毒尤其是單純皰疹病毒(HSV-1，Carlezon，et al.，2000)、杆狀病毒、逆轉錄病毒、腺相關病毒(AAV，Carter and Samulski.2000)、鼻病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、絲狀病毒和上述病毒的工程化形式(見例如Kobinger et al.，2001)；病毒體；「裸」DNA，脂質體；病毒樣顆粒；和核酸包被顆粒，尤其是金球(gold spheres)。尤其優選的是病毒載體，象腺病毒載體、慢病毒載體、杆狀病毒載體或逆轉錄病毒載體(Lindemann et al.，1997，和Springer et al.，1998)。允許產生這些重組病毒載體的質粒實例包括pFastBacl(Invitrogen Corp.，Carlsbad CA)，pDCCMV(Wiznerowiczet al.，1997)和pShuttle-CMV(Q-biogene，Carlsbad，California)。
脂質體也是優選的載體並且通常是由陽離子、中性和/或陰離子脂質構成的小單層或多層小泡(vesicle)，例如，通過對脂質懸浮液進行超聲處理。例如，多聚核苷酸可以以離子形式結合在脂質體的表面或以內在形式包裹在脂質體中。合適脂質混合物是本領域已知的，且包括，例如，DOTMA(1，2-二油醯氧丙基-3-三甲基溴化銨)和DPOE(二油醯磷脂醯-乙醇胺)，這兩者都已經被用於多種細胞系。
包被核酸的顆粒是用於將本發明的多聚核苷酸引入細胞中的另一種手段，其使用所謂的「基因槍」，其允許以機械方式使顆粒引入細胞中。優選的是，顆粒自身是惰性的，因此在一個優選實施方案中優選由金球製成。
在一個進一步的方面，本發明的多聚核苷酸可操作性連接於一個或多個表達調控序列，其允許在原核和/或真核宿主細胞中表達。以上涉及的轉錄/翻譯調控元件包括，但並不限於，可誘導的和非可誘導的、組成型、細胞周期調節的、代謝調節的啟動子、增強子、操作子(operator)、沉默子、阻遏子和為本領域技術人員已知並驅動或以別的方式調節基因表達的其它元件。這些調控元件包括但不限於指導組成型表達的調控元件，例如，由RNA聚合酶III轉錄的啟動子，例如，snRNA U6或scRNA7SK基因的啟動子、巨細胞病毒hCMV立即早期基因的啟動子、SV40腺病毒的早期或晚期啟動子、來源於例如以下病毒的病毒啟動子和激活序列NBV、肝炎(HCV)、單純皰疹病毒(HSV)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)、Ebstein-Barr病毒(EBV)、人T細胞白血病病毒(HTLV)、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)或HIV；其允許可誘導表達，例如，CUP-1啟動子、tet阻遏子，例如，用於tet開或tet關系統、lac系統、trp系統；指導細胞周期特異性表達的調控元件，例如，cdc2、cdc25C或細胞周期蛋白A啟動子；或TAC系統、TRC系統、噬菌體A的主要操作子和啟動子區、fd衣殼蛋白的控制區、磷酸甘油酸激酶(PGK)的啟動子、酸性磷酸酶的啟動子和酵母α-或a接合因子的啟動子。尤其優選的啟動子是組成型CMV立即早期基因啟動子、早期或晚期SV 40啟動子、多角體蛋白啟動子、逆轉錄病毒LTRs、PGK啟動子、延伸因子1-α(EF1-α)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)。
正如在本文中使用的，「操作性連接」表示整合到遺傳構建體中以致於表達調控序列有效的控制感興趣編碼序列的表達。
本發明的另一方面是經上述用本發明的多聚核苷酸或載體基因工程化的宿主細胞。可以用於本發明目的的宿主細胞包括但不限於原核細胞如細菌(例如，大腸桿菌和枯草桿菌)，其能用例如含有本發明多聚核苷酸分子的重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA表達載體進行轉化；簡單真核細胞如酵母(例如，酵母屬(Saccharomyces)和畢赤酵母屬(Pichia))，其可以用例如含有本發明多聚核苷酸分子的重組酵母表達載體轉化；昆蟲細胞系統，例如，草地夜蛾和粉紋夜蛾細胞系，例如Sf9或Hi5細胞，其能用例如含有本發明多聚核苷酸分子的重組病毒表達載體(例如，杆狀病毒)感染；爪蟾卵母細胞(xenopus oocyte)，其能用例如質粒注射；植物細胞系統，其能用例如重組病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒(CaMV)或菸草花葉病毒(TMV))感染或用含有編碼H11多肽的核苷酸序列的重組質粒表達載體(例如，Ti質粒)轉化；或哺乳動物細胞系統(例如，COS，CHO，BHK，HEK293，VERO，HeLa，MDCK，Wi38，NSO和NIH 3T3細胞)，其能用含有例如來源於例如哺乳動物細胞基因組(例如，金屬硫蛋白啟動子)、哺乳動物病毒(例如，腺病毒晚期啟動子和痘苗病毒7.5K啟動子)或細菌細胞(例如，用於tet-on和tet-off系統的tet阻遏物結合)的啟動子的重組表達構建體進行轉化。同樣有用的宿主細胞是直接從哺乳動物獲得的原代細胞或繼代細胞，並且用質粒載體轉染或用病毒載體感染。根據宿主細胞和用來引入本發明多聚核苷酸的各自載體，多聚核苷酸能夠整合入，例如，染色體或線粒體DNA中或能夠以染色體外形式被維持，例如，附加體型或能夠僅能夠短暫的包含在細胞中。優選的宿主細胞是草地夜蛾和粉紋夜蛾；哺乳動物細胞，尤其是幹細胞、造血細胞、肝細胞、脂肪細胞、神經元、破骨細胞、子宮內膜細胞、皮膚細胞、心肌細胞、黏膜細胞、白細胞或腫瘤細胞；細菌細胞，尤其是埃希氏菌屬或芽孢桿菌屬菌種和酵母細胞，尤其是畢赤酵母或酵母屬菌種。
本發明人已經發現，用本發明的多聚核苷酸或載體工程化的腫瘤細胞或細胞系能用於預防或治療多種增殖性疾病。所述腫瘤細胞或細胞系可以來源於廣泛的腫瘤和物種。能夠從其獲得腫瘤細胞的物種優選是哺乳動物，其選自人、非人靈長類動物、馬、牛、綿羊、山羊、豬、狗、貓、山羊、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠或沙鼠，尤其是人。工程化的腫瘤細胞能夠直接來源於腫瘤或能夠在工程化處理前進一步傳代培養。腫瘤細胞延長的傳代培養通常導致細胞系的建立，其主要由克隆細胞組成。腫瘤細胞或細胞系能來源於任何腫瘤，然而優選源自胃腸或結直腸道癌、肝癌、胰腺癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌、睪丸癌、皮膚癌、眼癌、黑素瘤、發育不良性口腔黏膜癌、侵入性口腔癌、小細胞和非小細胞肺癌、激素依賴性乳腺癌、非激素依賴性乳腺癌、移行和鱗狀細胞癌、神經惡性瘤，包括神經母細胞瘤、神經膠質瘤、星形細胞瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤、血管瘤、內分泌腫瘤、血液新生物包括白血病、淋巴瘤和其它骨髓增殖性和淋巴增殖性疾病、原位癌、增生性損傷、腺瘤、纖維瘤、組織細胞增多症、慢性炎症增生性疾病、血管增生性疾病和病毒誘導增生性疾病；尤其是黑素瘤、胰腺和腎癌。尤其優選的是來源於黑素瘤、胰腺癌和腎癌的腫瘤細胞或細胞系。用本發明的多聚核苷酸或載體工程化並且後來被用於預防或治療一個物種中增殖性疾病的腫瘤細胞系優選來源於相同物種(異基因源)或甚至來源於被治療的真正對象(自體同源)。因此，在一個優選實施方案中，來源於待治療患者或來源於患有相同或相似腫瘤類型的另一個患者的人腫瘤細胞或人腫瘤細胞系用本發明的多聚核苷酸或載體進行工程化處理並用於預防或治療人患者的增殖性疾病。能被工程化的優選腫瘤細胞系包括但不限於NSO、B78H1、Renca、Hep G2、B9、人黑素瘤、腎癌，尤其是腎細胞癌、胰腺癌、自體同源和異基因源T細胞。
因為本發明的一個優選的方面涉及轉移本發明的多聚核苷酸進入某些病毒載體，其是產生用本發明多聚核苷酸工程化的細胞的方便工具，即通過簡單的注射，同樣預想到的是，用本發明的多聚核苷酸工程化的宿主細胞是能夠包裝本發明多聚核苷酸進入病毒的細胞。因此，另一個宿主細胞優選類型是包裝細胞，尤其是雙嗜性包裝細胞，例如，PA 317、親嗜性包裝細胞如GP+E86、人胚胎腎細胞-239。PA 317適合與包含本發明多聚核苷酸的載體DCCMV配對，以產生含有H11序列的重組反轉錄病毒顆粒。
本發明的發明人已經進一步的觀察到，如果細胞經工程化處理包括至少一種進一步的多聚核苷酸，用本發明的多聚核苷酸或載體工程化的宿主細胞，尤其是腫瘤細胞或細胞系，行使的體內抗腫瘤作用能被進一步增強。因此在一個優選實施方案中，用編碼至少一種進一步多肽的至少一種進一步的多聚核苷酸對本發明的宿主細胞進行工程化處理。其通過使用載體優先實現，尤其是以上有關H11指徵的一種載體，並且隨後或同時引入這個(這些)載體進入宿主細胞。所述一個或多個額外的多聚核苷酸可以包含於分離的載體中或可以包含於編碼H11的多聚核苷酸的同一個載體中。優選宿主細胞同時表達H11蛋白和由至少一種進一步的多聚核苷酸編碼的至少一種進一步的蛋白質。在一個優選實施方案中，所述至少一種進一步的多聚核苷酸被引入編碼細胞因子宿主細胞，所述細胞因子尤其是GM-CSF、IL-6、IL-11、IL-15、抗TGF、EPO、幹擾素、LIF、OSM、CNTF、CT-1和sIL-6R/IL-6融合蛋白，尤其是超-IL-6。在上下文中，同樣優選的是，宿主細胞選自上面指出的有關H11的優選宿主細胞中的一個，即腫瘤細胞或細胞系。
因此，特別優選的是，表達本發明的至少一種H11多肽和至少一種進一步多肽，尤其是細胞因子(例如GM-CSF、IL-6或IL-11)，的宿主細胞來源於從參與增殖性疾病的組織中起源的細胞或細胞系，所述增殖性疾病優選胃腸或結直腸道癌、肝癌、胰腺癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌、睪丸癌、皮膚癌、眼癌、黑素瘤、發育不良性口腔黏膜癌、侵入性口腔癌、小細胞和非小細胞肺癌、激素依賴性乳腺癌、非激素依賴性乳腺癌、移行和鱗狀細胞癌、神經惡性瘤，包括神經母細胞瘤、神經膠質瘤、星形細胞瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤、血管瘤、內分泌腫瘤、血液新生物包括白血病、淋巴瘤和其它骨髓增殖性和淋巴增殖性疾病、原位癌、增生性損傷、腺瘤、纖維瘤、組織細胞增多症、慢性炎症增生性疾病、血管增生性疾病和病毒誘導增生性疾病；尤其是黑素瘤、胰腺和腎癌。尤其優選的是來源於黑素瘤、胰腺癌和腎癌的腫瘤細胞或細胞系。同樣，該腫瘤細胞或細胞系可以是自體源的、同種異體源的或異種源的。
本發明進一步的方面是製備能表達H11細胞的方法。這種方法包括在體外用至少一種本發明載體對細胞進行基因工程處理，其中所述H11是由本發明的多聚核苷酸編碼。能夠被轉化的細胞類型沒有限制，並且依賴用於基因工程處理細胞的各自的載體或載體系統。優選用於轉化某些細胞類型的載體和載體系統已經在上面給出。此外，優選將上面給出的特定細胞和細胞系用於本發明的這個方法。
本發明進一步的方面是製備由本發明的多聚核苷酸編碼的H11多肽的方法，其包括培養本發明的宿主細胞和收集由所述多聚核苷酸編碼的H11多肽。本領域技術人員知道多種表達系統，其以高水平表達異源蛋白質，因此其能用於製備本發明的H11多肽。表達系統的選擇依賴於需要的蛋白質量和需要的修飾。雖然使用單細胞生物表達異源蛋白質是標準的，但是也可以應用來自多細胞生物的細胞。原則上，任何這類細胞都可使用，無論其源自脊椎動物還是非脊椎動物培養物。除了哺乳動物細胞以外，所述這些細胞還包括由重組病毒表達載體(例如，杆狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；由重組病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV；菸草花葉病毒，TMV)感染的植物細胞系統；或由重組質粒表達載體(例如，Ti質粒)轉化的，由質粒或人工染色體轉化的酵母和由質粒、粘粒、噬菌粒或噬菌體轉化的原核細胞，所述載體含有一個或多個H11多肽的編碼序列。
在有用的昆蟲系統中，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)被用作載體表達外源基因。病毒在草地夜蛾和粉紋夜蛾細胞中生長。草地夜蛾細胞用於病毒的擴增，而分離自粉紋夜蛾的H5細胞用於生產H11。H11多肽編碼序列被克隆進入病毒的非必需區(例如，多角體蛋白基因)並且置於AcNPV啟動子的控制下(例如，多角體蛋白啟動子)。
成功的插入編碼序列導致多角體蛋白基因的失活和產生非封閉(non-occluded)的重組病毒(即，病毒缺少由多角體蛋白基因編碼的蛋白質衣殼)。隨後這些重組病毒被用來感染草地夜蛾細胞，插入的基因在所述細胞中表達(例如，美國專利No.4,215,051，Smith，作為參考文獻併入本文中)。能夠用來產生重組病毒的載體的實例已經在上面指出。
有用的哺乳動物宿主細胞系的實例是VERO和HeLa細胞、CHO細胞系、WI 38、BHK、COS-7、293、HepG2、NIH3T3、RIN、NSO和MDCK細胞系。此外，可以選擇宿主細胞株來調節插入序列的表達，或以期望的特異性方式修飾和加工基因產物。蛋白質產物的這些修飾(例如，糖基化)和加工(例如，切割)對於蛋白質的功能有可能是非常重要的。不同的宿主細胞具有具有特有的和特異的蛋白質翻譯後加工和修飾的機制。可以選擇合適的細胞系或宿主系統以確保表達的外源蛋白質被正確的修飾和加工。適合表達本發明的H11蛋白質的各種哺乳動物表達系統是已知的，其包括，例如，GS基因表達系統(Lonza Biologicals，Slough，great Britain)，其使用穀氨醯胺合成酶(GS)缺陷細胞或者，例如，經甲硫氨酸亞氨基代碸(methioninesulfoximine，MSX)敏化成穀氨醯胺缺陷的CHO細胞和包括穀氨醯胺合成酶基因的載體以補充GS的缺少或缺少足夠量的GS。
用於哺乳動物細胞的表達載體通常包括複製起始點(如果必需)，位於待表達基因前面的啟動子，連同任何必需的核糖體結合位點，RNA剪接位點，多聚腺苷酸位點和轉錄終止序列。可以通過構建載體以包括外源起始點，比如源自SV40或其它病毒(例如，多瘤病毒(Polyoma)、腺病毒、CMV、VSV、BPV)，或者可以通過宿主細胞染色體的複製機制提供複製起始點。如果載體整合於宿主細胞的染色體，後者通常是充分的。
啟動子可以源自哺乳動物細胞的基因組(例如，金屬硫蛋白啟動子)或源自哺乳動物病毒(例如，腺病毒晚期啟動子；痘苗病毒7.5K啟動子)。進一步說，也有可能並可以期望利用與H11多聚核苷酸正常相連的啟動子或控制序列，如果這些控制序列與所用的宿主細胞系統是相容的。
可以利用多種基於病毒的表達系統，例如，經常使用的啟動子是源自多瘤病毒、腺病毒2和最常用的猿病毒40(SV40)。SV40的早期和晚期啟動子特別有用，因為很容易從病毒獲得含有SV40病毒複製起始點以及二者的片段。更小或更大的SV40片段也可以被使用，如果包括有位於病毒複製起始點中從HindIII位點向BglII位點延伸的大約250bp的序列。
在使用腺病毒作為表達載體的情況下，編碼序列可以連接至腺病毒轉錄/翻譯調控複合物，例如，晚期啟動子和三組分先導序列。然後這種嵌合基因可以通過體外或體內重組插入腺病毒基因組中。在病毒基因組非必需區(例如，E1、E3或E4區)的插入將導致重組病毒，其在感染宿主中有活力並能表達H11融合多肽。
H11融合多肽編碼序列的有效翻譯也可能需要特異性起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子和鄰近序列。包括ATG起始密碼子的外源翻譯調控信號可能需要另外提供。本領域普通技術人員可以很容易的確定這些和提供必要的信號。眾所周知，起始密碼子與期望的編碼序列的閱讀框必須在框內(或相內)以確保完整插入序列的翻譯。這些外源翻譯調控信號和起始密碼子可以是各種來源，既可以是天然的也可以是合成的。表達的有效性可以通過包含合適的轉錄增強子元件和轉錄終止子而被加強。在真核表達中，如果其沒有包含於起始的克隆區段內，通常還期望將合適的多聚腺苷酸位點摻入轉錄單元(例如，5』-AATAAA-3』)。通常，多聚A添加位點被置於轉錄終止位置前的蛋白質終止位點「下遊」約30-2000核苷酸處。
為了重組融合多肽長期、高產量的生產，穩定表達是優選的。例如，可以工程化穩定表達編碼H11融合多肽的構建體的細胞系。優於使用含有病毒複製起始點的表達載體，宿主細胞能夠用由合適表達調控元件(例如，啟動子、增強子、序列、轉錄終止子、多聚腺苷酸位點等)控制的載體和可選擇標記物進行轉化。引入外源DNA後，工程化的細胞可以在富集培養基中生長1-2天，然後轉移到選擇培養基。重組質粒中的可選擇標記對選擇具有抗性並且允許細胞穩定的整合質粒進入它們的染色體和生長形成轉化灶，其接下來能夠被克隆和擴展為細胞系。
可以使用大量的選擇系統，其包括但不限於分別在tk-、hgprt-或aprt-細胞中的單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(hgprt)和腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(aprt)基因。同樣，抗代謝物抗性能夠被作為對二氫葉酸還原酶(DHFR)選擇的基礎，其賦予對甲氨蝶呤的抗性；gpt，其賦予對黴酚酸的抗性；新黴素(neo)，其賦予對氨基糖苷G-418的抗性；和潮黴素(hygro)，其賦予對潮黴素的抗性。
動物細胞能以兩種方式在體外繁殖遍布培養基容積的在懸浮液中生長的非附著依賴性細胞或為繁殖需要附著到固體基質上的附著依賴性細胞(即，單層型細胞生長)。
來自連續建立細胞系的非附著依賴性或懸浮培養是大規模生產細胞和細胞產物的最廣泛應用的手段。然而，懸浮培養的細胞有局限性，比如致瘤性和比附著細胞更低的蛋白質產量。
哺乳動物在攪拌罐中大規模懸浮培養是生產重組蛋白質的通常方法。兩種懸浮培養反應器設計有廣泛的應用—攪拌反應器和氣升式反應器。攪拌設計已經成功應用8000升的容量生產幹擾素。細胞在高度直徑比為1∶1-3∶1的不鏽鋼罐中生長。培養物通常用一個或多個攪拌器混合，其基於葉片式的盤或海洋螺旋槳式攪拌器的模式。比葉片式具有更少剪切力的攪拌器系統已經被描述。攪拌可以通過磁性偶聯的驅動器直接或間接被驅動。間接驅動降低了通過攪拌杆的密封汙染微生物的風險。
氣升式反應器，最初也被描述用於微生物的發酵，後來修改用於哺乳動物細胞培養，所述反應器依靠氣流進行混合和向培養物通氧。氣流進入反應器的升液管部分並驅動循環。氣體在培養基表面分離，引起無氣泡的更密液體以使其沿反應器的下降段向下運動。這種設計的主要優勢是其簡單性和不需要機械混合。典型的是，高度對直徑的比為10∶1。氣升式反應器放大相對容易，具有良好的氣體傳質並產生相對低的剪切力。
本發明的H11融合多肽可以從細胞分泌到上清液或它可以保持在細胞內。雖然細胞上清液能夠按以下描述直接進行進一步純化步驟，但是使細胞內的蛋白質可進行進一步的純化是必要的。可用多種方法破碎細胞，包括化學方法，例如離液劑(例如尿素、硫氰酸鈉、GuHCl)、高鹽和/或去汙劑和機械手段，例如弗氏壓碎(Frenchpressure)、凍融和/或超聲處理。為獲得在本發明中優選的基本正確摺疊的非變性蛋白質，優選使用非變性方法，例如，在溫和去汙劑條件下組合凍融和弗氏壓碎方法。
由此被溶解的蛋白質或包含在上清液中的蛋白質能夠進行進一步的純化步驟，其在本領域是眾所周知的並且包括但不限於使用沉澱、層析和親和純化步驟。可使用的層析方法包括離子交換層析、體積排阻層析、染料吸附等方法。親和純化方法可使用樹脂，其包被IL-11、IL-11R、sIL-11R或其部分，對IL-11、sIL-11R或包含在H11融合多肽中的標籤具有特異性的抗體，或包含在H11融合多肽中並與另一種化合物或樹脂特異性相互作用的標籤。這些標籤的實例是6xHis、FLAG、myc-標籤、幾丁質-標籤、穀胱苷肽-S-轉移酶-標籤等。優選地標籤被包括在本發明H11融合多肽的C-和/或N-末端，其允許用例如內肽酶去除標籤。因此最終被純化的H11蛋白質優選不含任何標籤，所述標籤向患者施用時可能引起免疫反應。
本發明的另一個方面是具有由本發明的多聚核苷酸編碼的胺基酸序列的或可以通過上述方法獲得的H11多肽。術語「多肽」和「蛋白質」可以交換使用並表示胺基酸的任何肽連接鏈，而不管長度或翻譯後修飾。
本發明進一步的方面是含有如上所述的多聚核苷酸、載體和/或宿主細胞的非人轉基因動物。所述動物可以是嵌合動物，其表示組成動物體的細胞中只有部分包含本發明的多聚核苷酸、載體和/或細胞，或者所述動物可以是轉基因動物，其表示動物的所有細胞都含有本發明的或源自本發明細胞的多聚核苷酸和/或載體。嵌合或轉基因動物相對於包含於細胞中的本發明多聚核苷酸可以是純合或雜合的。在一個優選實施方案中，轉基因動物相對於編碼本發明蛋白質的基因是純合或雜合的敲除或敲入動物。原則上，所述動物可以是任何動物，然而，優選哺乳動物，其選自非人靈長類動物、馬、牛、綿羊、山羊、豬、狗、貓、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠或沙鼠。
本發明的另一個方面是生產由本發明多聚核苷酸編碼的H11的方法，其包括培養上述宿主細胞和回收由所述多聚核苷酸編碼的多肽。宿主細胞和載體的優選組合已在上面描述，進一步的組合對本領域技術人員是顯而易見的。根據所回收肽的以後用途，可以選擇合適的細胞類型。如果期望由細胞產生的蛋白質表現出基本天然的糖基化模式，則優選真核細胞；如果，例如，不期望或不需要通常僅在真核細胞中被引入蛋白質的糖基化或其它修飾時，則選擇原核細胞，為檢測本發明融合蛋白的表達，可以使用抗sIL-11或IL-11的多數抗體。然而，為區分sIL-11R、IL-11和由其形成的融合蛋白之間的表達，在本發明的一些方面，希望有一種抗體，其特異性檢測融合蛋白，但是其對單獨的sIL-11R和IL-11僅顯示弱的或基本無特異性。因此，在本發明進一步的方面涉及一種對由本發明多聚核苷酸編碼的或者可通過本發明生產H11多肽的方法獲得的多肽具有特異性的抗體，所述抗體對sIL-11R和IL-11基本無特異性。本領域已知如何產生僅特異性識別蛋白質內特定表位的抗體。例如，可以用包括sIL-11R和IL-11間連接部分的肽免疫動物，特別是小鼠或兔。這將導致產生抗體，其特異性識別融合蛋白質。從由此產生的抗體中進一步進行選擇，選出對sIL-11R和IL-11僅有弱的或基本無特異性的抗體。
正如上面所述，本發明的H11多肽能夠自身使用或能夠在宿主細胞環境中使用，即能夠轉染宿主細胞。在兩種實施方案中，H11多肽自身或宿主細胞可以單獨使用或與另外的物質組合使用，因此本發明進一步的方面涉及一種藥物組合物，其包含本發明的至少一種多肽和/或至少一種宿主細胞和至少一種進一步的組分，所述組分選自脂質體、病毒體、微球、非離子表面活性劑微囊(niosomes)、樹狀聚體(dendrimeres)、穩定劑、緩衝劑、賦形劑和添加劑。
輔助生產和施用本發明組合物的賦形劑是本領域已知的賦形劑並包括，例如，藻酸鹽、碳酸鈣、葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、麥芽糖糊精等。穩定劑也是本領域已知的，其包括，例如，α-生育酚和多種碳水化合物。
本發明的發明人已經觀察到表達本發明H11多肽的宿主細胞如果給小鼠施用會產生很強的抗腫瘤反應。此外，H11自身是一種很強的IL 11R激動劑並且因此能夠用在需要IL-11治療和改善作用的疾病治療中。因此，本發明的進一步的方面是本發明的宿主細胞或可根據本發明一種方法獲得的宿主細胞或者本發明的H11多肽在製備治療或預防疾病的藥物中的應用，所述疾病選自增殖性疾病、細胞病變、輻射損傷、IL-11依賴的炎性疾病、IL-11依賴的退行性疾病和IL-11依賴或介導的軟組織疾病。
H11多肽和表達H11多肽的宿主細胞，特別是表達H11多肽的宿主細胞，能夠用在治療和/或預防廣泛的多種不同增殖性疾病中，然而，根據本發明可治療或預防的優選的增殖性疾病選自胃腸或結直腸道癌、肝癌、胰腺癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌、睪丸癌、皮膚癌、眼癌、黑素瘤、發育不良性口腔黏膜癌、侵入性口腔癌、小細胞和非小細胞肺癌、激素依賴性乳腺癌、非激素依賴性乳腺癌、移行和鱗狀細胞癌、神經惡性瘤，包括神經母細胞瘤、神經膠質瘤、星形細胞瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤、血管瘤、內分泌腫瘤、血液新生物包括白血病、淋巴瘤和其它骨髓增殖性和淋巴增殖性疾病、原位癌、增生性損傷、腺瘤、纖維瘤、組織細胞增多症、慢性炎症增生性疾病、血管增生性疾病和病毒誘導增生性疾病；尤其是黑素瘤、胰腺和腎癌。尤其是在增殖性疾病治療的情況下，可以考慮的是患者在發生疾病的任何症狀之前，或者在他們已經顯現疾病症狀之後後用「癌疫苗」對其進行免疫，前者即接受保護性免疫，後者即接受治療性接種。
表達H11的宿主細胞和至少一種進一步的細胞因子，尤其是GM-CSF能夠比只表達H11的細胞向某些腫瘤提供甚至更強的體內抗腫瘤反應。因此，優選表達H11的細胞和至少一種進一步的細胞因子用於製備預防或治療增殖性疾病的藥物。
H11多肽和表達H11的宿主細胞，尤其是H11多肽能夠用在廣泛的血細胞減少症治療中，然而，根據本發明的應用可治療或預防的優選的血細胞減少症選自血小板減少症、血細胞減少症和全血細胞減少症。
自願或非自願暴露於輻射，包括x射線、α、β和γ射線，的人或動物，根據輻射的時間和強度，可能遭受嚴重的局部或全身性毒性作用。特別是在各種疾病包括增殖性疾病的放射治療中，放射治療相關的毒性經常限制治療所應用的劑量和/或放射治療的頻次。然而，已知的是，例如，如果每天接受放射治療，乳腺腫瘤有50％機會的局部復發(Barker et al.，1980)和如果接受每天兩次治療，局部復發機會只有20-27％(Fastenberg et al.，1985)。因此，期望發現能夠改善非自願暴露於放射的影響的物質，以及允許以同樣毒性水平施用更高放射劑量或以更低毒性水平施用目前用於放療相同放射劑量的物質。本發明人現已經驚奇的發現H11多肽和/或表達H11的宿主細胞，尤其是H11多肽能夠用來預防和/或治療和/或改善輻射的影響，即能夠用作輻射保護劑。為此目的，H11多肽和/或表達H11多肽的宿主細胞能夠在輻射暴露之前、期間和/或之後施用。特別是在有關放療中，優選在治療前和治療後施用。
此外，H11多肽和/或表達H11多肽的宿主細胞，尤其是H11多肽能夠用在各種IL 11依賴的炎性疾病的治療中，然而，根據本發明應用能治療或預防的優選的IL 11依賴的炎性疾病選自肝功能衰竭；肝炎；肝病；敗血症；化療或放療引起的組織損傷，尤其是肺損傷；炎性疾病，尤其是炎性腸病，類風溼性關節炎，炎性肝病；黏膜炎；過敏；子宮內膜異位症；血管炎；內皮炎症相關的血管疾病，尤其是缺血性心臟病或外周血管病；和銀屑病。
相似的，根據本發明應用能治療或預防的優選的IL-11依賴的退行性疾病選自退行性CNS疾病、PNS疾病和骨關節炎。根據本發明應用能治療或預防的IL-11依賴的或介導的軟組織疾病選自肥胖症和特發性女性不育症。
因為本發明IL 11R激動劑的作用能夠通過共同施用一種或多種細胞因子被加強，優選在施用H11或表達H11(和，如果期望一種細胞因子)的宿主細胞之前、同時或之後施用至少一種進一步的細胞因子。
已知IL-11能夠刺激細胞的分化。例如，其已經顯示出對海馬神經元分化的作用。本發明可以考慮將已經部分分化的自體、同種異體或異種幹細胞注射給患者，在此其定位於靶組織並進行終末分化。為促進和幫助這種分化過程，本發明考慮使用本發明的H11融合多肽或根據本發明方法可獲得的H11融合多肽用於製造幹細胞療法期間的輔助治療的藥物。幹細胞療法的很多不同應用已經在現有技術中被討論，這種幹細胞療法的實例包括但不限於帕金森疾病和ADA的治療。相似的，本發明的或根據本發明方法可獲得的H11融合多肽可以在體外用來刺激細胞分化，尤其是幹細胞或前體細胞。然後，這些已分化的細胞能夠用於自身治療，例如，帕金森病和ADA。
H11表達細胞，例如，H11修飾的黑素瘤細胞能夠應用於細胞接種領域已知的多種給藥和施用方案中。給藥和施用可以改變以引起持續的抗靶標免疫反應或疫苗，例如腫瘤和/或腫瘤疫苗。患者對接種的免疫反應可以通過本領域技術人員已知的技術確定，其包括但不限於ELISA。在治療或預防增殖性疾病中，H11表達細胞，尤其是H11修飾的黑素瘤細胞的施用劑量為每劑量1×105-1×1010細胞，優選為每劑量1×106-5×108細胞。藥劑可以使用任何本領域已知的途徑注射入患者，例如包括肌內(i.m.)、皮內(i.d.)、皮下(s.c.)注射，優選通過s.c.注射。接種的典型方案包括兩個階段誘導和加強階段。在誘導階段，疫苗通常在一段短時間中被施用幾次，例如，在兩天到兩周間隔內2-12次，優選1-2周間隔內4-10次，更優選在兩周間隔內6-8次和隨後在加強階段每月一次。
包括以下實施例是為了舉例說明本發明的優選實施方案。本領域的技術人員應該理解實施例中公開的技術手段，其代表本發明人所公開的在實施本發明時良好工作的技術手段，因此可以考慮作為優選實施方式。然而，本領域技術人員根據本發明公開的內容應該理解對所公開特定實施方案的很多變化沒有偏離所附權利要求列出的本發明的精神和範圍。所有引用的參考文獻經引用併入本文中。


圖1表示使用常規單字母符號的融合蛋白H11的胺基酸序列(SEQ ID NO 3)。sIL-11R和IL-11的序列分別用黑色和灰色指出。分子的不同結構域指示如下N末端信號肽(細下劃線)，Ig樣結構域(雙下劃線)，由兩個100AA的亞結構域組成(D2和D3)的200AA的紅細胞生成素結構域(加框的區域和亞結構域用虛線表示)，受體膜前區域(序列頂部的線)和IL-11分子，其中根據CNTF的已知三維結構，預測的α螺旋區域被定位並且用粗下劃線表示。
圖2顯示H11的核酸序列(SEQ ID NO 6)。sIL-11R和IL-11的序列分別用黑色和灰色表示。黑色箭頭指示用於擴增sIL-11R片段的引物序列，灰色箭頭用於指示對應IL-11的引物序列。在序列上面和下面的箭頭分別表示正向和反向的引物。此外，還顯示了用於連接兩個組分的限制性位點Xhol。
圖3是以圖例的方式表示新設計細胞因子的構建步驟的圖，正如在實施例1中的詳細說明。一些限制性位點被表示S、X、E、No、N、B、Xb分別表示SalI、XhoI、EcoRI、NcoI、NotI、BamHI、XbaI。
圖4、5和6以圖例方式顯示用於在杆狀病毒表達系統中表達重組蛋白(圖4和實施例2)，用於產生GMTV(圖5，實施例3)的載體和用於腺病毒構建的重組轉移載體pShuttle-CMV/H11(圖6，實施例4)。
圖7顯示蛋白質印跡的放射自顯影圖。源自轉導293FT細胞和CD34+細胞的條件培養基被電泳(PAGE/SDS)、轉移到PDV膜上，並使用抗IL-11和抗IL-11R抗體(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)和作為二級抗體的山羊抗兔IgG/HRP(DAKO，Glostrap，Denmark)進行分析。從用攜帶有H11的重組杆狀病毒感染的High Fvie細胞中收集的重組H11作為陽性對照。
圖8和9顯示蛋白質印跡的放射自顯影圖。源自轉導B78H1細胞的條件培養基被電泳(PAGE/SDS)、轉移到PDV膜上，並使用抗IL-11R抗體(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)和作為二級抗體的山羊抗兔IgG/HRP(DAKO，Glostrap，Denmark)進行分析。分析表明通過經重組逆轉錄-和腺病毒修飾的腫瘤細胞，融合蛋白被正確的表達和分泌(分別為圖8和9，實施例6)。
圖10是火箭免疫電泳的照片(實施例7)。簡單說，HepG2細胞用不同濃度(收集培養基的百分比)的重組IL-6和來自對照和H11修飾B78H1細胞的條件培養基進行刺激。48h後從刺激HepG2細胞收集的培養基用火箭免疫電泳分析α1-抗胰凝乳蛋白酶的存在。
圖11是蛋白質印跡的放射自顯影圖，其中分析STAT3分子的活化。簡單說，3×109的B9細胞在存在不同細胞因子的條件下培養超IL-6、H11(50％的條件培養基從分別用超IL-6和H11修飾的B78H1細胞收集)、重組IL-11(0.6ng/ml)、重組sIL-11R(100ng/ml)和重組IL-11/sIL-11R的複合物(0.6/100ng/ml)。30分鐘後細胞被裂解並且蛋白質被電泳(PAGE/SDS)、轉移到PDV膜上並使用抗STAT3-P抗體(New England BioLabs，Beverly，MA)和作為二級抗體的山羊抗兔IgG/HRP(DAKO，Glostrap，Denmark)進行分析。作為陰性對照，使用來自非修飾的B78H1細胞的50％條件培養基。
圖12和13是顯示來自B9細胞增殖測試的結果圖片。簡單說，B9細胞(每孔2×104細胞)在不同濃度(範圍為1-25％)的收集自B78H1、B78H1/超IL-6、B78H1/H11細胞的培養基下進行增殖測試。當使用收集自用攜帶H11的重組逆轉錄病毒轉導B78H1細胞之後的培養基時，培育4天後進行MMT檢測(Sigma-AldrichCorporation，St.Louis，MI)。在540nm測量吸光度(圖12)。腺病毒轉導後獲得的H11活性通過增殖B9細胞整合的放射性胸苷([甲基-3H]胸苷，Sigma-AldrichCorporation，St.Louis，MI)進行測定(圖13)。
圖14是顯示描述Ba/Fgp130細胞增殖結果的圖，所述細胞用不同濃度的從用超IL-6cDNA修飾的人黑素瘤A375細胞收集的培養基(範圍為0.78-25％)和用從用攜帶H11 High-Five BTI-TN-5B1-4的重組杆狀病毒感染的細胞(用攜帶H11的重組杆狀病毒感染的昆蟲細胞)收集的重組H11誘導。每孔接種10×104Ba/Fgp130細胞後3天，定量細胞生長。通過MMT檢測(Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MI)測定活細胞的量，其對應於490nm吸光度。
圖15是顯示在腫瘤排斥模型中獲得的H11體內活性分析結果的圖。簡單說，C57BLxC3H小鼠(6-8周)經皮下注射偽轉導的和用IL-11和H11的cDNA修飾的小鼠黑素瘤細胞B78H1(每個小鼠使用懸浮在0.1ml PBS的5×105細胞)。接下來，監測小鼠的腫瘤生長動力學(組A)和小鼠存活率(組B)。
圖16是顯示用對照和修飾的B78H1細胞免疫C57BLxC3H小鼠後所獲得結果的圖。C57BLxC3H小鼠按圖15中描述的方法處理。兩周後，免疫小鼠在遠離前次注射的位置經皮下用親代B78H1細胞(每隻小鼠5×105細胞)再次攻擊。接下來，監測小鼠的腫瘤生長動力學(組A)和小鼠存活率(組B)。
圖17是顯示在腎癌的腫瘤排斥模型中對修飾的腫瘤疫苗功效分析的圖。雌性Balb/c小鼠(8-12周)在右腿經皮下注射對照和用GM-CSF和H11的cDNA基因修飾的和H11/GM-CSF Renca細胞(每隻小鼠5×105細胞)被免疫。兩周後，小鼠在左腿經皮下注射親本Renca細胞被再次攻擊。接下來，監測分析腫瘤出現(組A)、腫瘤生長動力學(組B)和小鼠存活率(組C)。
圖18描述用H11和IL-11/R-FP修飾的B78-H1黑素瘤細胞的致瘤性。C57BL6xC3H小鼠注射偽轉導的和H-11和IL-11/R-FP轉導的B78-H1細胞。腫瘤生長動力學(組A)和小鼠存活率(組B)每周監測一次。
圖19是顯示對負責GMTV/H11的抗黑素瘤活性的細胞機制研究結果的圖。SCID小鼠(6-8周)經皮下注射對照和用IL-11和H11的cDNA基因修飾的B78H1細胞(每隻小鼠5×105細胞)。評價免疫細胞在由H11介導的原代腫瘤排斥中的作用通過對腫瘤生長動力學(組A)和SCID小鼠存活率(組B)的分析進行研究。
圖20和21總結在由IL-11和H11-GMTV引起免疫反應的誘導和效應階段，濾過細胞的CD4+、CD8+和NK1.1免疫染色後所獲得的結果。簡單的說，使用C57BLxC3H小鼠進行兩組試驗。第一組，其中小鼠經皮下注射對照和IL-11或H11修飾的B78H1細胞(每隻小鼠5×105細胞)(圖20)，和第二組，其中小鼠按上述進行注射，然後兩周後，後者用親本B78H1細胞(每隻小鼠5×105細胞)進行再次攻擊(圖21)。在初次注射後的2、5、9、11天和再次攻擊後處死小鼠。切除注射位置的組織並在液氮中冷凍。製作5μm薄的冷凍切片。為了免疫染色，切片被乾燥，固定在冷丙酮中，隨後與一級抗體-生物素-偶聯的大鼠抗小鼠CD4+(PharMingen，San Diego，CA)、生物素-偶聯的大鼠抗CD8+(PharMingen，San Diego，CA)或小鼠抗-小鼠NK1.1細胞(PharMingen，San Diego，CA)一起培育過夜。需要時，載玻片接下來與生物素-偶聯的兔抗小鼠IgG(Dako，Glostrup，Denmark)一起培育。阻斷背景過氧化物酶活性後，切片被培育於親合素-生物素過氧化物酶複合物ABC/HRP(Dako，Glostrup，Denmark)和過氧化物酶底物二氨基聯苯胺DAB(Dako，Glostrup，Denmark)。洗過的載玻片用蘇木精反染，脫水，固定於Permount(Sigma-AIdrichCorporation，St.Louis，MI)中並用蓋玻片覆蓋。為了評估免疫染色細胞的數量，使用以下標誌「-」無染色細胞，「-/+」染色細胞少於5％，「+」5-20％，「++」20-50％和「+++」超過50％的染色細胞。
實施例為創建H11，使用來自M/I-Q/365的全長sIL-11R胺基酸序列。根據累積的數據，已經可能分辨預測的區域(i)信號肽-位置M/I-S/23，(ii)Ig樣區域-D1結構域，位置G/38-Y/111，(iii)由兩個FNIII區域D2和D3結構域組成的CHD結構域，位置分別為P/112-R/217和P/218-T/314，和(iv)受體膜前區-部分介於D3結構域和跨膜區之間，位置P/315-Q/365(Nandurkar et al.，1996)。與一般觀念相一致，受體的跨膜和細胞質區分別喪失26和31個胺基酸。
使用的IL-11序列編碼全長成熟IL-11蛋白質(序列A/19-L/199)，其中所有預測的區域結構域A、B、C、D和環A-B、B-C、C-D都能夠被區分。正如上面提到的，IL-11需要三個特異性結合位點(I，II，III)與它的受體相互作用。這些位點通過組合來自不同結構域和環的胺基酸而形成。因此，全長細胞因子對發揮它的活性是必要的。兩種蛋白(sIL-11R和IL-11)已經在cDNA水平上通過PCR/連接反應被連接並且沒有應用連接子。為了保持融合蛋白的正確摺疊，使用IL-11R的C-末端和IL-11的N-末端的天然序列。IL-11R的膜前區(約50個胺基酸)與IL-11的16個N末端殘基一起不是螺旋並假設是柔性的，其能夠保證複合物的正確組裝。圖1顯示胺基酸(AA)序列，其中指出了分子的不同結構域。
通過標準PCR/連接反應(實施例1)在cDNA水平上構建新設計的細胞因子。sIL-11R的cDNA片段(位置1-1095)使用實施例1中所示引物進行擴增。正向引物有附加的限制性位點SalI序列。此外，為了分別提供Kozak共有序列和限制性位點NcoI，引入ATG前面的ACC核苷酸和緊接ATG之後的替換A/G。這種突變也導致了在位置2S→2G引入胺基酸替換。反向引物具有在IL-11的5』序列與限制位點XhoI出現重疊的附加序列。IL-11的cDNA使用如實施例1中所示的引物(位置55-600)進行擴增。擴增片段省略了IL-11的前導序列，但編碼前導序列最後三個胺基酸(AVA)的天然序列除外，其現在在IL-11組分的N末端。反向引物含有另外的限制位點-SalI。擴增片段按照實施例1連接。H11序列顯示在圖2中和它的構建步驟顯示在圖3中。
作為下一個步驟，在杆狀病毒表達系統中生產重組蛋白H11(實施例2)。重組供體質粒pFastBacl/Hll被構建並且重組杆狀病毒穿梭載體通過位點特異性轉位而產生。接下來，重組杆狀病毒在Sf21昆蟲細胞中擴增並用於在High-Five BTI-TN-5B1-4昆蟲細胞中生產融合蛋白H11的優化系統中。按下述IEX和HIC層析方法實施融合蛋白的純化。獲得的蛋白通過膜過濾進行濃縮，然後用於體外研究。
此外，構建逆轉錄病毒載體pDCCMV/H11、MIHV/GM-CSF和腺病毒轉移載體pShuttle-CMV/H11(分別為實施例3和4)，其用於修飾鼠黑素瘤(B78H1)和腎癌(Renca)細胞(實施例6)。修飾癌細胞能夠表達、加工和分泌融合蛋白H11(附圖8和9)。
在三個不同的體外生物分析中檢測從H11修飾癌細胞收集的培養基以及純化的重組H11的生物活性(實施例7)。在人肝細胞瘤細胞系HepG2分析中，其中sIL-11R能夠誘導產生急性期蛋白，在B9(雜交瘤細胞系)生物分析中，其中IL-11誘導細胞增殖，和在Ba/Fgp130生物分析中，其中IL-11/sIL-11R複合物誘導細胞增殖。
此外，H11的體內活性使用鼠腫瘤排斥模型進行評估(實施例8)。鼠黑素瘤以及腎癌細胞的H11修飾在小鼠中降低了致瘤性並刺激長期持續的抗腫瘤免疫。Renca細胞的H11和GM-CSF修飾在這種模型中是最有效的(更詳細的說明見實施例8)。
為了評估負責H11修飾疫苗(GMTV/H11)抗腫瘤活性的細胞機制，進行兩組試驗(在實施例9中詳細描述)。我們使用SCID小鼠證明了H11抗原發腫瘤的活性也許與非特異性免疫反應有關。分析免疫細胞的浸潤(免疫組織化學)，我們發現在免疫反應的誘導期，既不涉及CD4+細胞，也不涉及CD8+細胞。然而，我們觀察到NK細胞密集的浸潤，其確認了這些細胞在H11修飾的原發腫瘤生長抑制中的重要作用。由H11/GMTV刺激的主要效應細胞是NK細胞和在晚期是CD4+T淋巴細胞。
實施例1構建新設計的細胞因子超IL-11(H11)人IL-11的cDNA(序列位置55-600，其與胺基酸殘基19-199相對應)已經通過標準PCR進行了擴增，其中使用以下引物
IL-11正向5』GCT GCT GCC CCT GGG CCA(SEQ ID NO.7)，IL-11反向5』TCC GCG GCC GCT ATG GCC GAC GTC GAC TCA CAG CCG AGT CTT CAG(SEQ ID NO.8).
擴增的IL-11片段克隆入pGEM-Teasy載體(Promega，Madison，WI)中。人IL-11R的cDNA(位置1-1095，其與胺基酸殘基1-365相對應)也通過PCR進行了擴增，其使用含有限制位點SalI的正向引物和帶有額外序列的特別的反向引物，該額外序列在IL-11的5』序列上與出現限制位點Xhol的位置重疊。
sIL-11R正向5』ACG CGT CGA CGC CAC CAT GGG CAG CAG CTG CTC AGG GCT G(SEQID NO.9)sIL-11R反向5』AAC TCG AGG GGG GCC AGG TGG TGG CCC AGG GGC GAC AGC CTGCTC CAC AGA GTC CCT(SEQ ID NO.10).
PCR產物已經克隆入pGEM-Teasy載體中，然後用SalI和XhoI限制酶消化。將純化的SalI/XhoI片段克隆入質粒pGEM-Teasy/IL-11的XhoI位點，其導致產生sIL-11R和IL-11的融合cDNA(沒有任何人工連接序列)稱為超IL-11(H11)。
新設計的細胞因子H11的核苷酸序列顯示於圖2中並且它的構建步驟在圖3中進行了說明。
實施例2生產重組H11構建重組供體質粒(FastBac1/H11)。
用質粒pFastBac1生產表達重組蛋白H11的病毒。用SalI/SphI限制酶消化pGEM-Teasy/H11質粒，然後將純化的片段克隆入pFastBac1質粒的SalI/SphI限制位點(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)(圖4)。
通過位點特異性轉位生成重組杆粒(bacmid)。
重組杆狀病毒的生產是基於表達盒以位點特異性方式轉座到在大腸桿菌中擴增的杆狀病毒穿梭載體(杆粒)上。
pFastBac1/H11質粒被轉化入DH10Bac感受態細胞，其含有帶mini-attTn7靶位點的杆粒和輔助質粒。在由輔助質粒提供的轉位蛋白存在下，位於pFastBac1供體質粒上的mini-Tn7元件被轉位到杆粒上的mini-attTn7靶位點上。通過抗生素選擇和藍/白篩選鑑定含有重組杆粒的菌落。接下來，製備高分子量的mini-prep DNA。為確定插入基因的存在，通過PCR反應對分離的DNA進行分析。使用的引物如下正向#95』ACC CAC CCG CTA CCT CAC CT(SEQ ID NO 11)反問#25』GTC AGG AGC ACG GTG CT(SEQ ID NO 12)用重組杆粒DNA轉染Sf21細胞以及重組杆狀病毒的擴增。
使用Effectene轉染試劑(Qiagen，Valencia，CA)用重組杆粒DNA轉染Sf21(草地夜蛾)細胞。3天後，收集上清液並確定病毒的滴度。為了擴增病毒原種，以感染複數(MOI)0.1對懸浮於無血清培養基(SFM)中的1.4×106Sf21細胞進行感染72小時。重組H11桿狀病毒的擴增操作進行兩次，最後獲得高質量、高滴度(2.87×108pfu/ml)的病毒原種。將重組病毒原種在-80℃貯存。
優化異源蛋白的生產。
為了實現重組H11蛋白的最佳生產，需要考慮不同因素，比如細胞系(Sf21和粉紋夜蛾-High-Five BTI-TN-5B1-4)、培養基(Sf900II和Express5)、病毒感染參數(MOI)和表達動力學。為了表達重組基因產物，以MOI0.5、1、5和10pfu/ml對細胞密度為1、1.5和2×106細胞/ml的High Five細胞懸浮培養物進行感染並在不同收穫時點通過蛋白印跡分析監測H11的表達。重組H11蛋白的最優化生產是在細胞密度1×106細胞/ml、MOI 5、使用High Five BTI-TN-5B1-4細胞在Express 5(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)培養基中感染48小時的條件下獲得。此外，在以1∶1000稀釋比例用於培養基中的蛋白酶抑制劑混合物(Sigma-AldrichCorporation，St.Louis，MI)存在下，實施H11的生產。
純化重組H11蛋白將收穫的上清液用pH11.8的20mM 1，3二氨基丙烷緩衝液按1∶8比例稀釋。接下來，通過在8000g/4℃離心，將沉澱的蛋白移除並用Q XL陰離子交換介質(Amersham Pharmacia Biotech，Buckinghamshire，UK)在4℃過夜進行分批IEX層析。在0.5M NaCl、20mM 1，3二氨基丙烷pH 10.5緩衝液中重新獲得吸附的蛋白，將NaCl的濃度增加到4M並進行柱HIC。將苯基FF(low sub)介質(AmershamPharmacia Biotech，Buckinghamshire，UK)用4M NaCl、20mM 1，3二氨基丙烷pH 10.5緩衝液平衡，加載蛋白質，用高摩爾起始緩衝液洗滌，接下來對其以呈線性遞減梯度的鹽濃度(4-0M NaCl)在20mM 1，3二氨基丙烷pH 10.5緩衝液中進行洗脫。合併含有重組H11蛋白的組分並通過使用30kDa截留的膜(MilliporeCorporation，Bedford，MA)對其進行膜過濾濃縮。
實施例3構建逆轉錄病毒載體DCCMV/H11和MIHV/GM-CSF以及生產重組逆轉錄病毒顆粒用NotI限制酶消化H11的cDNA，並將純化後的片段克隆入雙順反子雙拷貝逆轉錄病毒載體(DCCMV)(Wiznerowicz et al.，1997)的NotI位點。位於3』LTR的U3區域的DCCMV的表達盒含有CMV-IE啟動子，其驅動表達下遊H11和Neo抗性基因。DCCMV/H11的構建步驟顯示於圖5A中。
構建MIHV/GM-CSF載體是通過將鼠GM-CSF cDNA，其由NotI消化從pGEM-Teasy/mGM-CSF質粒切出，克隆入MIHV逆轉錄病毒載體的NotI位點而進行的(圖5B)。
圖5C顯示逆轉錄病毒載體MSCV/hIL-11(鼠幹細胞病毒)，其在研究中被作為對照(Dr.R Hawley，Toronto，Canada惠贈)。
通過電穿孔(250V/104ms)將DCCMV/H11載體轉染進入雙嗜性包裝細胞系(PA317)。在14天的抗生素G418(500μg/ml)篩選後，收集含有重組逆轉錄病毒的上清液並在-80℃冷凍。當使用MIHV/GM-CSF時，為了生產攜帶hIL-11和GM-CSF的重組逆轉錄病毒，除了使用潮黴素(150μg/ml)進行篩選外其他步驟按照上述實施。
實施例4構建腺病毒轉移載體pShuttle-CMV/H11以及生產重組腺病毒將NotI/SalI限制酶消化的H11 cDNA克隆入轉移質粒pShuttle-CMV(Q-biogene，Carlsbad，CA)的NotI/XhoI位點，以產生pShuttle-CMV/H11(圖6)。接下來，用PmeI線性化的pShuttle-CMV/H11質粒與攜帶腺病毒基因pAdEasy1(Q-biogene，Carlsbad，CA)的質粒共轉化進入細菌，在此發生同源重組。用卡那黴素(50μg/ml)進行篩選後，將重組質粒分離，用PmeI線性化並轉染QBI-293A細胞(Q-biogene，Carlsbad，CA)，其提供了生成腺病毒顆粒必需的反式腺病毒蛋白。接下來，將攜帶H11的腺病毒在QBI-293A細胞中擴增，通過不連續氯化銫梯度純化，在PBS中透析並在-80℃貯存。高質量病毒原種的滴度為1.25×108pfu/ml。
實施例5構建表達重組H11蛋白的慢病毒為了構建表達重組H11蛋白的慢病毒，使用基於Dddier Trono研發的使用3個質粒的人免疫缺陷病毒的逆轉錄病毒體系(見，例如，Dull et al.，1998或Zufferey etal.，1998)。慢病毒載體顆粒是通過用以下質粒瞬時轉染載體產生細胞系而產生的，所述質粒包括轉導載體、包裝載體和包膜載體。轉導載體pWPXL含有HIV必需的用於包裝、逆轉錄和整合、內部啟動子和增強子的順式作用序列，以及用於克隆cDNAs的獨特限制性位點。包裝構建體pCMV-deltaR8.91編碼Gag、Pol、Tat和rev病毒蛋白。包膜載體pMD2G-VSVG表達VSV的表面糖蛋白(G)。pWPXL是自我失活載體，其在3』長末端重複序列(LTR)中有缺失，其破壞了LTR啟動子活性。
用pWPXL-EF1alpa-GFP質粒生產在EF1alpa啟動子控制下表達重組蛋白H11的慢病毒。GFP的cDNA用PmeI和EcoRI切除而且PmeI限制位點用DNAI聚合酶Klenow片段填充以產生平端。為了獲得H11的cDNA，用SpeI消化pGEM-Teasy/H11質粒，用DNAI聚合酶Klenow片段產生平端，然後用EcoRI消化質粒。將純化的H11片段克隆入質粒pWPXL的平端/EcoRI限制性位點。
表達H11 LV-H11的慢病毒載體的生產是基於用三種質粒pWPXL-H11、pCMV-deltaR8.91、pMD2G-VSVG共轉染293FT細胞系(Invitrogen)。293FT細胞系源自293F細胞系並穩定表達SV40大T抗原。293F是293細胞系的快速生長變體-由原代人胚腎用剪切的人腺病毒5型DNA轉化形成。
LV-H11被用於轉導293FT細胞系和CD34+原代人細胞。通過PCR方法確認穩定的基因轉移。與超-IL-11的IL-11和sIL-11R部分相對應的兩套引物被用於從轉導細胞中分離的基因組DNA擴增IL-11和sIL-11R。H11蛋白在293FT細胞和CD34+中的表達通過蛋白質印跡進行分析(圖7)。
實施例6鼠癌細胞(B78H1和Renca)的基因修飾使用收集的含有攜帶H11的重組逆轉錄病毒的上清液轉導鼠癌細胞黑素瘤細胞系(B78H1)和腎癌細胞系(Renca)。如上所述轉導的細胞在G418中進行篩選，然後分離幾個克隆。按照標準Chomczynski和Sacchi(Chomczynski和Sacchi，1987)操作對來自所獲得克隆的RNA進行分離並使用RNA印跡以hIL-11和hIL-11R作為特異性探針對其進行分析。hIL-11和hIL-11R的mRNA恰好在同一位置被發現，這表明兩個靶序列位於一個mRNA上。RNA印跡分析可以篩選到H11表達最高水平的克隆。此外，使用抗IL-11R抗體對來自這些克隆的上清液進行蛋白印跡分析並證明所述細胞分泌H11(圖8)。
作為對照研究，使用MSCV/hIL-11載體對B78H1細胞進行轉導並用MIHV/GM-CSF載體對Renca細胞進行修飾。此外，用MIHV/GM-CSF對Renca/H11細胞進行共轉導並在潮黴素(150μg/ml)中進行篩選。通過ELISA(RαD，Minneapolis，MN)對體外分泌到培養基中的蛋白質(IL-11和GM-CSF)進行測定。
此外，用攜帶H11的腺病毒轉導B78H1細胞。過夜培養後更換培養基，兩天後通過蛋白印跡分析對培養基中存在的H11進行測定(圖9)。
實施例7評估H11的體外活性對來自B78H1/H11轉導細胞的重組H11和上清液進行分析，在三種不同生物檢測中分析其生物活性HepG2，B9和Ba/Fgp130。
HepG2細胞(人肝細胞瘤細胞系)分泌內源IL-11，這使得它們對外源IL-11無反應。然而，HepG2對IL-11的不敏感性可通過加入sIL-11R而恢復。用H11而不是IL-11刺激HepG2細胞會引起α1-抗胰凝乳蛋白酶的分泌增加(通過火箭免疫電泳測定)，這表明融合蛋白H11在體外是有生物活性的(圖10)。
B9細胞(雜交瘤細胞系)具有IL-11R和gp130受體，這使得它們對IL-11有反應。用IL-11和H11(從用攜帶H11的逆轉錄-和腺病毒轉導的B78H1細胞收集的培養基)刺激B9細胞導致引起STAT3分子磷酸化的信號轉導(圖11)，這最終導致了B9細胞的增殖(圖12和13)。這些結果進一步表明H11融合蛋白在體外是有活性的。
Ba/F細胞(原B淋巴細胞系)的獨特特徵是缺少膜gp130分子，這使得它們對IL-11/sIL-11R複合物無反應。然而，用gp130 cDNA對Ba/F細胞進行轉染使得它們對IL-11和sIL-11R的組合有反應。使用MTT檢測，測定出用重組H11刺激Ba/Fgp130細胞導致它們擴增(圖14)。
獲得的結果證明在三種不同系統(杆狀病毒表達系統，以及由逆轉錄-和腺病毒轉導的真核細胞所分泌的蛋白)中產生的H11蛋白在體外是有活性的。此外，在用逆轉錄病毒和腺病毒載體轉導後融合蛋白從真核細胞分泌。Ba/Fgp130檢測證明了新設計的細胞因子H11作為複合體發揮作用。
實施例8H11在動物模型中的體內抗腫瘤活性為了評估H11的抗黑素瘤活性，將轉導的B78H1細胞(5×105)皮下注射入C57BLxC3H小鼠(s.c.)並監測腫瘤生長及存活情況。使用偽和IL-11轉導細胞作為對照。
與IL-11和對照組相比，轉導H11進入B78H1細胞在抑制腫瘤生長上明顯具有更高水平。注射B78H1/H11細胞的小鼠體內後來出現腫瘤，腫瘤的平均體積比對照組中出現的小好幾倍(圖15A)。注射B78H1/H11細胞的小鼠的總存活時間比注射偽和IL-11轉導的B78H1細胞的小鼠長7周。注射B78H1和B78H1/IL-11細胞的動物最長存活7周，而50％注射了B78H1/H-11細胞的小鼠存活12周(圖15B)。
在第二系列實驗中，首先用偽和B78H1轉導細胞對未實驗過的小鼠進行皮下注射免疫，兩周後用親代B78H1細胞對其進行再次攻擊。90％用B78H1細胞免疫過的小鼠在第7周發現腫瘤，而同時接種B78H1/H11和B78H1/IL-11的動物分別只有30％和50％發現了腫瘤。在與對照組比較時，用H11修飾疫苗免疫的小鼠中腫瘤的平均體積要小好幾倍(圖16A)。接種對照和IL-11轉導疫苗的小鼠存活9周，而70％用H11修飾疫苗免疫的動物存活了12周(圖16B)。
此外，已經在腎細胞癌(腎癌細胞)的腫瘤排斥模型中對H11和GM-CSF基因修飾的癌症疫苗進行了分析。使用8-12周大的雌性Balb/c小鼠。創建4個實驗組，每組含有10隻動物。對照鼠接受模擬物轉導的腎癌細胞，其它實驗組分別接受表達GM-CSF、H-11或共表達H11和GM-CSF的細胞。用懸浮於0.125ml PBS中的5×105對照或基因修飾細胞對小鼠進行皮下注射免疫。兩周後，用親代腎癌細胞在較遠位置對小鼠進行皮下注射攻擊。基於腫瘤出現、生長動力學和動物的存活情況的分析對疫苗功效進行評估。
用未修飾細胞免疫的小鼠在攻擊後四周開始出現腫瘤，比其他組更快。所有對照組中的動物在施用親代腎癌細胞後7周內出現腫瘤。用Renca-GM-CSF免疫的小鼠在攻擊後5周開始出現腫瘤。在整個實驗期內，該組中有20％小鼠未患腫瘤。用Renca-H11疫苗進行免疫，保護了70％的動物免患腫瘤並且在30％的小鼠中腫瘤的出現晚於接受對照或GM-CSF-分泌Renca細胞的組。用共表達H11和GM-CSF基因的疫苗免疫的小鼠完全排斥植入的親代腫瘤細胞(圖17A)。
在用偽轉導的Renca細胞免疫的小鼠中觀察到了最驚人的腫瘤生長動力學。用Renca-GM-CSF和-H11疫苗免疫降低了腫瘤生長動力學；然而Renca-H11比RencaGM-SCF疫苗顯示出更強的保護作用。在用Renca H11/GM-CSF多基因疫苗免疫的小鼠中未觀察到腫瘤(圖17B)。
在第二組實驗中對用對照或基因修飾Renca細胞免疫的小鼠的存活情況進行了分析。在用對照Renca細胞免疫的小鼠中，觀察到最高和最快的死亡率。使用RencaGM-CSF、H11和H11/GM-CSF疫苗免疫增加了用親代Renca細胞攻擊的小鼠的存活率。在實驗最後，分別有20、70和100％的小鼠仍然存活(圖17C)。
實施例9與IL-11/R-FP相比較H11的體內抗腫瘤活性為了比較H11和IL-11/R-FP的抗腫瘤活性，用H11或IL-11/R-FP cDNA以及偽轉導的B78H1細胞，將轉導的修飾細胞對小鼠進行皮下注射並進行致瘤性分析。與IL-11/R-FP相比，H11對腫瘤生長顯示出更好的作用(圖18A和B)。
實施例10負責H11修飾疫苗(GMTV-H11)抗黑素瘤活性的細胞機制評估在第一組實驗中，使用SCID小鼠。它們缺少T和B淋巴細胞，但是擁有NK細胞，這允許評估這些細胞在H11介導的原發腫瘤排斥中所起的作用。在接受B78H1/IL-11和B78H1/H11細胞皮下注射的小鼠中，腫瘤的出現晚於對照小鼠。在注射B78H1/H11細胞的小鼠中的平均腫瘤體積小於注射偽和IL-11轉導B78H1細胞的小鼠中的(圖19A)。與對照組相比，接種B78H1/H11細胞的SCID小鼠的存活期延長了。接受B78H1和B78H1/IL-11細胞的動物分別存活了8和9周，而B78H1/H11免疫的SCID小鼠有50％存活了12周(圖19B)。這些實驗表明H11的抗-原發腫瘤活性可能與非特異性免疫反應有關。
在第二組實驗中，分析由IL-11和H11基因修飾的腫瘤疫苗引起的抗黑素瘤免疫應答的誘導和效應期。通過向未接觸抗原的小鼠注射對照和GMTV以及免疫細胞浸潤分析(免疫組織化學)對誘導期進行研究。對照B78H1細胞被單一CD4+和CD8+T淋巴細胞浸潤。GMTV-IL-11細胞被CD4+和CD8+細胞密集浸潤，然而在B78H1/H11接種小鼠中沒檢測到。這些結果表明由IL-11和H11 GMTV引起的抗黑素瘤免疫應答的誘導期是由不同機制介導的。此外，B78H1/H11細胞被NK細胞密集浸潤，這證實了這些細胞在原發腫瘤生長抑制中的重要作用。在效應期中，其中對之前用對照GMTV免疫的小鼠再次用親代B78H1細胞攻擊，發現單一CD4+細胞的浸潤。然而，IL-11-GMTV免疫小鼠中的B78H1腫瘤被CD4+和CD8+密集浸潤，而B78H1/H11免疫引起NK細胞的嚴重浸潤。這些數據表明CD4+和晚期的CD8+淋巴細胞是由IL-11-GMTV刺激的重要效應細胞，而H11-GMTV激活NK和在晚期激活CD4+細胞。
圖20和21總結了由IL-11和H11 GMTV引起的抗黑素瘤免疫應答的誘導和效應期分析。
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275 280 285His Ala Val Arg Val Ser Ala Arg Asp Phe Leu Asp Ala Gly Thr Trp290 295 300Ser Thr Trp Ser Pro Glu Ala Trp Gly Thr Pro Ser Thr Gly Thr Ile305 310 315 320Pro Lys Glu Ile Pro Ala Trp Gly Gln Leu His Thr Gln Pro Glu Val325 330 335Glu Pro Gln Val Asp Ser Pro Ala Pro Pro Arg Pro Ser Leu Gln Pro340 345 350His Pro Arg Leu Leu Asp His Arg Asp Ser Val Glu Gln Ala Val Ala355 360 365Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala370 375 380Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr385 390 395 400Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp405 410 415His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu420 425 430Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Lsa Arg Ala Asp Leu435 440 445Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser450 455 460Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu465 470 475 480Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu485 490 495Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser500 505 510Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu515 520 525
His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr530 535 540Arg Leu54521042111095212DNA213人工的220
223編碼人突變可溶性IL-11R片段4004atgggcagca gctgctcagg gctgagcagg gtcctggtgg ccgtggctac agccctggtg 60tctgcctcct ccccctgccc ccaggcctgg ggccccccag gggtccagta tgggcagcca120gggaggtccg tgaagctgtg ttgtcctgga gtgactgccg gggacccagt gtcctggttt180cgggatgggg agccaaagct gctccaggga cctgactctg ggctagggca tgaactggtc240ctggcccagg cagacagcac tgatgagggc acctacatct gccagaccct ggatggtgca300cttgggggca cagtgaccct gcagctgggc taccctccag cccgccctgt tgtctcctgc360caagcagccg actatgagaa cttctcttgc acttggagtc ccagccagat cagcggttta420cccacccgct acctcacctc ctacaggaag aagacagtcc taggagctga tagccagagg480aggagtccat ccacagggcc ctggccatgc ccacaggatc ccctaggggc tgcccgctgt540gttgtccacg gggctgagtt ctggagccag taccggatta atgtgactga ggtgaaccca600ctgggtgcca gcacacgcct gctggatgtg agcttgcaga gcatcttgcg ccctgaccca660ccccagggcc tgcgggtaga gtcagtacca ggttaccccc gacgcctgcg agccagctgg720acataccctg cctcctggcc gtgccagccc cacttcctgc tcaagttccg tttgcagtac780cgtccggcgc agcatccagc ctggtccacg gtggagccag ctggactgga ggaggtgatc840acagatgctg tggctgggct gccccatgct gtacgagtca gtgcccggga ctttctagat900gctggcacct ggagcacctg gagcccggag gcctggggaa ctccgagcac tgggaccata960ccaaaggaga taccagcatg gggccagcta cacacgcagc cagaggtgga gcctcaggtg 1020gacagccctg ctcctccaag gccctccctc caaccacacc ctcggctact tgatcacagg 1080gactctgtgg agcag10952105211546212DNA213人工的220
223編碼人IL-11片段
4005gctgtcgccc ctgggccacc acctggcccc cctcgagttt ccccagaccc tcgggccgag 60ctggacagca ccgtgctcct gacccgctct ctcctggcgg acacgcggca gctggctgca120cagctgaggg acaaattccc agctgacggg gaccacaacc tggattccct gcccaccctg180gccatgagtg cgggggcact gggagctcta cagctcccag gtgtgctgac aaggctgcga240gcggacctac tgtcctacct gcggcacgtg cagtggctgc gccgggcagg tggctcttcc300ctgaagaccc tggagcccga gctgggcacc ctgcaggccc gactggaccg gctgctgcgc360cggctgcagc tcctgatgtc ccgcctggcc ctgccccagc cacccccgga cccgccggcg420cccccgctgg cgcccccctc ctcagcctgg gggggcatca gggccgccca cgccatcctg480ggggggctgc acctgacact tgactgggcc gtgaggggac tgctgctgct gaagactcgg540ctgtga 54621062111641212DNA213人工的220
223編碼人可溶性突變IL-11R片段和IL-11片段的融合蛋白4006atgggcagca gctgctcagg gctgagcagg gtcctggtgg ccgtggctac agccctggtg 60tctgcctcct ccccctgccc ccaggcctgg ggccccccag gggtccagta tgggcagcca120gggaggtccg tgaagctgtg ttgtcctgga gtgactgccg gggacccagt gtcctggttt180cgggatgggg agccaaagct gctccaggga cctgactctg ggctagggca tgaactggtc240ctggcccagg cagacagcac tgatgagggc acctacatct gccagaccct ggatggtgca300cttgggggca cagtgaccct gcagctgggc taccctccag cccgccctgt tgtctcctgc360caagcagccg actatgagaa cttctcttgc acttggagtc ccagccagat cagcggttta420cccacccgct acctcacctc ctacaggaag aagacagtcc taggagctga tagccagagg480aggagtccat ccacagggcc ctggccatgc ccacaggatc ccctaggggc tgcccgctgt540gttgtccacg gggctgagtt ctggagccag taccggatta atgtgactga ggtgaaccca600ctgggtgcca gcacacgcct gctggatgtg agcttgcaga gcatcttgcg ccctgaccca660ccccagggcc tgcgggtaga gtcagtacca ggttaccccc gacgcctgcg agccagctgg720acataccctg cctcctggcc gtgccagccc cacttcctgc tcaagttccg tttgcagtac780cgtccggcgc agcatccagc ctggtccacg gtggagccag ctggactgga ggaggtgatc840acagatgctg tggctgggct gccccatgct gtacgagtca gtgcccggga ctttctagat900
gctggcacct ggagcacctg gagcccggag gcctggggaa ctccgagcac tgggaccata960ccaaaggaga taccagcatg gggccagcta cacacgcagc cagaggtgga gcctcaggtg 1020gacagccctg ctcctccaag gccctccctc caaccacacc ctcggctact tgatcacagg 1080gactctgtgg agcaggctgt cgcccctggg ccaccacctg gcccccctcg agtttcccca 1140gaccctcggg ccgagctgga cagcaccgtg ctcctgaccc gctctctcct ggcggacacg 1200cggcagctgg ctgcacagct gagggacaaa ttcccagctg acggggacca caacctggat 1260tccctgccca ccctggccat gagtgcgggg gcactgggag ctctacagct cccaggtgtg 1320ctgacaaggc tgcgagcgga cctactgtcc tacctgcggc acgtgcagtg gctgcgccgg 1380gcaggtggct cttccctgaa gaccctggag cccgagctgg gcaccctgca ggcccgactg 1440gaccggctgc tgcgccggct gcagctcctg atgtcccgcc tggccctgcc ccagccaccc 1500ccggacccgc cggcgccccc gctggcgccc ccctcctcag cctggggggg catcagggcc 1560gcccacgcca tcctgggggg gctgcacctg acacttgact gggccgtgag gggactgctg 1620ctgctgaaga ctcggctgtg a 1641210721118212DNA213人工的220
223擴增IL-11片段的PCR引物4007gctgctgccc ctgggcca 18210821145212DNA213人工的220
223擴增IL-11片段的PCR引物4008tccgcggccg ctatggccga cgtcgactca cagccgagtc ttcag 45210921140212DNA213人工的220
223擴增IL-11R片段的PCR引物4009acgcgtcgac gccaccatgg gcagcagctg ctcagggctg 40
2101021157212DNA213人工的220
223擴增IL-11R片段的PCR引物40010aactcgaggg gggccaggtg gtggcccagg ggcgacagcc tgctccacag agtccct572101121120212DNA213人40011acccacccgc tacctcacct 202101221117212DNA213人40012gtcaggagca cggtgct1權利要求
1.多聚核苷酸，其選自(a)多聚核苷酸，其編碼融合白介素-11受體(IL-11R)和IL-11多肽(H11)，其至少包含具有如SEQ ID NO1所示推演胺基酸序列的sIL-11R和具有如SEQ IDNO2所示推演胺基酸序列的成熟IL-11；(b)編碼H11的多聚核苷酸，其包含如SEQ ID NO4所示sIL-11R的編碼序列和如SEQ ID NO5所示IL-11的編碼序列；(c)多聚核苷酸，其編碼由(a)-(b)中任意一個多聚核苷酸編碼的H11的片段和/或衍生物，其中與所述H11比較，在所述衍生物中一個或多個胺基酸殘基被保守性替換，並且所述片段和/或衍生物具有體內抗腫瘤活性；(d)多聚核苷酸，其與(a)-(c)中定義的任一多聚核苷酸具有至少70％一致性，且其編碼具有體內抗腫瘤活性的H11；和(e)多聚核苷酸，其互補鏈，優選在嚴謹條件下，與(a)-(d)中定義的任一多聚核苷酸雜交，且其編碼具有體內抗腫瘤活性的H11；或這樣的多聚核苷酸的互補鏈。
2.權利要求1的多聚核苷酸，其中編碼可溶性IL-11R的多聚核苷酸位於編碼成熟IL-11的多聚核苷酸的5』端。
3.權利要求1或2的多聚核苷酸，其中插入編碼可溶性IL-11R和成熟IL-11的多聚核苷酸序列的核苷酸序列編碼非免疫原性肽。
4.權利要求1或2的多聚核苷酸，其中編碼可溶性IL-11R和成熟IL-11的多聚核苷酸被直接連接。
5.權利要求4的多聚核苷酸，其中多聚核苷酸選自(a)多聚核苷酸，其編碼具有如SEQ ID NO3所示推演胺基酸序列的H11；(b)多聚核苷酸，其包括如SEQ ID NO6所示的H11的編碼序列；(c)多聚核苷酸，其編碼由(a)-(b)中任意一個多聚核苷酸編碼的H11的片段和/或衍生物，其中與所述H11比較，在所述衍生物中一個或多個胺基酸殘基被保守性替換，並且所述片段和/或衍生物具有體內抗腫瘤活性；(d)多聚核苷酸，其與(a)-(c)中定義的任一多聚核苷酸具有至少70％一致性，且其編碼具有體內抗腫瘤活性的H11；和(e)多聚核苷酸，其互補鏈，優選在嚴謹條件下，與(a)-(d)中定義的任一多聚核苷酸雜交，且其編碼具有體內抗腫瘤活性的H11；或這樣的多聚核苷酸的互補鏈。
6.權利要求1-5中任一項的多聚核苷酸，其是DNA，cDNA、基因組DNA、合成DNA或RNA。
7.含有權利要求1-6中任一項的多聚核苷酸的載體。
8.權利要求7的載體，其中多聚核苷酸可操作性連接到表達調控序列，其允許在原核和/或真核宿主細胞中進行表達。
9.權利要求7或8的載體，其中表達調控序列選自CMV、SV40、多角體蛋白啟動子、逆轉錄病毒LTRs、磷酸甘油酸激酶(PKG)、延伸因子1-α(EF1-α)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)。
10.權利要求7-9中任一項的載體，其中載體選自質粒；噬菌粒；噬菌體；粘粒；人工哺乳動物染色體；人工酵母染色體；敲除或敲入構建體；病毒，尤其是腺病毒、痘苗病毒、減毒痘苗病毒、金絲雀痘病毒、慢病毒、皰疹病毒尤其是單純皰疹病毒、杆狀病毒、逆轉錄病毒、腺相關病毒(AAV)、鼻病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、絲狀病毒、及其工程化形式；病毒體；病毒樣顆粒；和脂質體。
11.用權利要求1-6中任一項的多聚核苷酸或權利要求7-10中任一項的載體基因工程化的宿主細胞。
12.權利要求11的宿主細胞，其中宿主細胞選自昆蟲細胞，尤其是粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)和草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)，哺乳動物細胞，尤其是幹細胞、造血細胞、肝細胞、脂肪細胞、神經元、破骨細胞、子宮內膜細胞、皮膚細胞、心肌細胞、黏膜細胞或腫瘤細胞；細菌細胞，尤其是埃希氏菌屬或芽孢桿菌屬，和酵母細胞，尤其是畢赤酵母屬或酵母屬。
13.權利要求11或12的宿主細胞，其中宿主細胞選自腎癌細胞、胰腺癌細胞、白細胞、黑素瘤細胞、包裝細胞，尤其是雙嗜性或親嗜性包裝細胞。
14.權利要求11-13任一項的宿主細胞，其經基因工程化以表達至少一種進一步的多聚核苷酸。
15.權利要求14的宿主細胞，其中進一步的多聚核苷酸編碼細胞因子，特別是GM-CSF、IL-6、IL-11、IL-15、抗-TGF、EPO、幹擾素、LIF、OSM、CNTF、CT-1和sIL-6R/IL-6融合蛋白，特別是超IL-6。
16.一種製備能表達H11的細胞的方法，其包括用權利要求7-10之一的載體在體外基因工程改造細胞，其中所述H11由權利要求1-6之一的多聚核苷酸編碼。
17.一種生產由權利要求1-6之一的多聚核苷酸編碼的H11多肽的方法，其包括培養權利要求11-15之一的宿主細胞和回收由所述多聚核苷酸編碼的H11多肽。
18.一種H11多肽，其具有由權利要求1-6之一的多聚核苷酸編碼的胺基酸序列或通過權利要求17方法可獲得。
19.一種抗體，其對由權利要求1-6之一的多聚核苷酸編碼的或通過權利要求17的方法可獲得的多肽具有特異性，所述抗體對可溶性IL-11R和IL-11基本無特異性。
20.一種藥物組合物，其包含權利要求11-15之一的或根據權利要求16可獲得的宿主細胞，或權利要求18的或按照權利要求17可獲得的H11，其進一步包含賦形劑、穩定劑、保護劑、緩衝劑和/或添加劑。
21.權利要求11或15之一的或按照權利要求16可獲得的宿主細胞或者權利要求18的H11在製造治療疾病的藥物中的應用，所述疾病選自增殖性疾病、細胞病變、輻射損傷、IL-11依賴的炎性疾病、IL-11依賴的退行性疾病和IL-11依賴或介導的軟組織疾病。
22.權利要求21的應用，其中所述增殖性疾病選自胃腸或結直腸道癌、肝癌、胰腺癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌、睪丸癌、皮膚癌、眼癌、黑素瘤、發育不良性口腔黏膜癌、侵入性口腔癌、小細胞和非小細胞肺癌、激素依賴性乳腺癌、非激素依賴性乳腺癌、移行和鱗狀細胞癌、神經惡性瘤，包括神經母細胞瘤、神經膠質瘤、星形細胞瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤、血管瘤、內分泌腫瘤、血液新生物包括白血病、淋巴瘤和其它骨髓增殖性和淋巴增殖性疾病、原位癌、增生性損傷、腺瘤、纖維瘤、組織細胞增多症、慢性炎症增生性疾病、血管增生性疾病和病毒誘導增生性疾病；尤其是黑素瘤、胰腺和腎癌。
23.權利要求21的應用，其中細胞病變選自血小板減少症、血細胞減少症和全血細胞減少症。
24.權利要求21的應用，其中IL-11依賴的炎性疾病選自肝功能衰竭；肝炎；肝病；敗血症；化療或放療引起的組織損傷，尤其是肺損傷；炎性疾病，尤其是炎性腸病，類風溼性關節炎，炎性肝病；黏膜炎；變態反應；子宮內膜異位症；血管炎；內皮炎症相關的血管疾病，尤其是缺血性心臟病或外周血管病；和銀屑病。
25.權利要求21的應用，其中IL-11依賴的退行性疾病選自退行性CNS疾病、PNS疾病和骨關節炎。
26.權利要求21的應用，其中IL-11依賴或介導的軟組織疾病選自肥胖症和特發性女性不育。
27.權利要求21-26中任一項的應用，其中在施用H11多肽或表達H11多肽的宿主細之前、同時或隨後施用至少一種進一步的細胞因子。
28.權利要求18或根據權利要求17的方法可獲得的IL-11在製造用於幹細胞治療期間輔助療法的藥物中的應用。
29.權利要求18或根據權利要求17的方法可獲得的IL-11的應用，用於細胞尤其是幹細胞或祖細胞體外分化。
全文摘要
本發明涉及一種新設計的被命名為H11的細胞因子，其通過用它們的天然序列融合兩種可溶性組分可溶性白介素11受體(sIL－11R)和白介素11(IL－11)來構建，和它在製造用於治療或預防疾病的藥物中的應用，所述疾病選自增殖性疾病、細胞病變、輻射損傷、IL－11依賴的炎性疾病、IL－11依賴的退行性疾病和IL－11依賴或介導的軟組織疾病。
文檔編號C12N15/62GK1956997SQ200580016353
公開日2007年5月2日 申請日期2005年5月20日 優先權日2004年5月21日
發明者安傑伊·馬茨凱維奇, 漢娜·達姆斯－科茲沃夫斯卡, 斯特凡·羅斯－約翰 申請人:愛吉瑞克斯有限公司