一種提高桑黃液體發酵產物中麥角甾醇含量的方法

2023-05-28 21:53:11

一種提高桑黃液體發酵產物中麥角甾醇含量的方法
【專利摘要】本發明公開了一種提高桑黃液體發酵產物中麥角甾醇含量的方法，包括步驟：(1)種子液製備：將活化後的桑黃菌種接種於添加青錢柳提取物的液體種子培養基中培養3天-7天，得種子液；(2)桑黃液體發酵培養：將步驟(1)中的種子液按佔液體發酵培養基體積5％-20％的量接種於液體發酵培養基中，培養1天-4天後，加入泛素蛋白，然後繼續培養2天-4天，終止發酵後，得到桑黃液體發酵產物。本發明根據藥用真菌桑黃液體發酵產物麥角甾醇合成代謝途徑的特點，通過添加青錢柳提取物並在特定的發酵階段添加泛素蛋白，大幅度提高了桑黃麥角甾醇含量。
【專利說明】一種提高桑黃液體發酵產物中麥角留醇含量的方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物發酵工程【技術領域】，具體涉及一種提高桑黃液體發酵產物中麥角 甾醇含量的方法。

【背景技術】
[0002] 桑黃（Phellinus igniarius)屬擔子菌亞門，層孔菌綱，鏽革孔菌科，針層孔菌屬。 桑黃菌提取物在抑制癌細胞轉移和防止癌症手術後復發等的臨床應用中具有顯著效果，是 目前國際公認的生物治癌藥劑中有效率最高的一種藥用真菌。
[0003] 由於受生理狀態的特殊性和複雜性以及外部環境的制約，造成桑黃在自然界中形 成子實體稀少，特別是形成可用子實體需要多年。而且人工栽培極其困難，培養條件苛刻， 且生長周期長達3-4年，難以滿足日益膨脹的市場需要。採用桑黃液體發酵的方法生產桑 黃藥用活性成分因為具有生產周期短、勞動力省以及受外部環境影響小等優點被認為是一 種有效的方法。目前，國內外對桑黃菌絲體培養生產活性藥用成分研究和工藝應用主要集 中在發酵條件及產物提取分離等層面上，整體發酵水平不高。
[0004] 麥角留醇又稱麥角固醇，是脂溶性維生素 D2的前體，當受到紫外線照射時可轉化 為維生素 D2。麥角留醇是真菌細胞膜的重要組分，它在確保膜結構的完整性、與膜結合酶的 活性、膜的流動性、細胞活力及物質運輸等方面起著重要作用。麥角留醇是一種重要的醫藥 化工原料，可用於可的松、黃體酮等藥物的生產，在食品、醫藥和飼料工業中應用廣泛（曹 龍輝，李曉捃，趙文紅等.麥角甾醇的研究進展[J].中國釀造，2014, 33(4) :9-11.)。
[0005] 泛素（Ubiquitin，Ub)，即泛素蛋白，是一種多肽，由76個胺基酸構成，其分子量約 8. 5kDa，1975年首次從小牛的胰臟中分離出來，隨後在許多不同有機體和組織中被發現，泛 素的胺基酸序列具有高度保守性。近年來，隨著對泛素研究的不斷深入，發現泛素不僅僅是 蛋白質降解的標記，還是細胞維持對那些受組成型調節和環境刺激產生的蛋白質水平的基 本調節方式，細胞內蛋白質泛素化參與細胞的多種生理過程，在蛋白質降解的標記、DNA修 復、基因轉錄調控及信號轉導等各個生命活動中發揮著重要的作用，與人類的各種疾病、植 物的生理生化過程存在著緊密聯繫（黃新敏，張豔霞，萬小榮.泛素蛋白的研究進展[J]. 廣東農業科學，2010,6:191-194.)。
[0006] 將泛素蛋白用於桑黃的液體發酵生產，提高其麥角留醇的含量，國內外尚未見報 道。


【發明內容】

[0007] 本發明針對現有技術的不足，提供了一種利用泛素蛋白提高桑黃液體發酵產物中 麥角留醇含量的方法。
[0008] 本發明採用的技術方案是：
[0009] -種提高桑黃液體發酵產物中麥角留醇含量的方法，包括步驟：
[0010] ⑴種子液製備：將活化後的桑黃菌種接種於添加青錢柳提取物的液體種子培養 基中培養3天-7天，得種子液；
[0011] ⑵桑黃液體發酵培養：將步驟（1)中的種子液按佔液體發酵培養基體積 5 % -20 %的量接種於液體發酵培養基中，培養1天-4天後，加入泛素蛋白，然後繼續培養2 天-4天，終止發酵後，得到桑黃液體發酵產物。
[0012] 本發明根據藥用真菌桑黃液體發酵產物麥角留醇合成代謝途徑的特點,通過添加 青錢柳提取物並在特定的發酵階段添加泛素蛋白，大幅度提高了桑黃液體發酵產物中麥角 甾醇的含量。
[0013] 所述的桑黃菌種可採用任意一種桑黃菌種，可採用市售產品。例如桑黃 (Phellinus linteus)ACCC51181菌種，來源於中國農業微生物菌種保藏管理中心。
[0014] 為了達到更好的發明效果，進行以下優選：
[0015] 步驟（1)中，每升液體種子培養基中青錢柳提取物的添加量為lg-10g。
[0016] 所述的青錢柳提取物可以選用市售產品，例如西安賽奧生物技術有限公司生產的 青錢柳提取物等，也可以採用現有方法製備；優選以青錢柳葉為原料製備的青錢柳提取物； 進一步優選由青錢柳葉乙醇提取物和青錢柳葉水提取物組成的青錢柳提取物，可採用以下 製備方法製備的青錢柳提取物，包括：
[0017] 稱取一定量的青錢柳葉，粉碎（優選過40目-100目），先加佔青錢柳葉重量10倍 量-16倍量的質量百分濃度為60% -80%的乙醇水溶液在60°C _80°C浸提lh-2h，過濾後得 到上清液，上清液濃縮後真空冷凍乾燥得提取物I ;上述醇提後的青錢柳葉殘渣加入佔青 錢柳葉重量10倍量-20倍量的水在85°C -95°C下浸提lh-2. 5h，過濾後得到上清液，上清液 濃縮至1/4體積後加入濃縮物體積2倍量-5倍量的無水乙醇，離心收集沉澱物，沉澱物真 空冷凍乾燥後得提取物II，合併上述提取物I和提取物II得青錢柳提取物。
[0018] 步驟（1)中，所述的活化後的桑黃菌種在添加青錢柳提取物的液體種子培養基中 培養的溫度為自然環境溫度，優選為20°C -30°C。一般IL添加青錢柳提取物的液體種子培 養基中接入2cm2-5cm2大小的活化後的桑黃菌種菌塊。
[0019] 步驟（1)中，桑黃菌種的活化方法為本領域常規的菌種活化方法，包括：將斜面保 藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養基上，進行活化培養，培養溫度22°C -30°C，培養時間4 天-10天，得到活化後的桑黃菌種。
[0020] 所述的PDA平板培養基和液體種子培養基均採用本領域種子培養常用的培養基， 可採用市售產品。優選，所述的PDA平板培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂15g-20g， 用水定容至l〇〇〇mL。優選，所述的液體種子培養基：葡萄糖5g-20g、酵母粉4g、蛋白腖3g、 KH2PO4Ig 和 MgSO4O. 5g，用水定容至 1000mL。
[0021] 步驟（2)中，所述的液體發酵培養基的組成為：以IL液體發酵培養基計，葡萄糖 20g、蛋白腖4g、麥麩5g、穀氨酸0. 5g-5g、KH2PO4L 5g、MgSO4O. 75g和餘量的水。
[0022] 優選，每毫升液體發酵培養基中添加泛素蛋白0. 2mg_3. Omg ;進一步優選每毫升 液體發酵培養基中添加泛素蛋白〇. 8mg-2. 4mg ;最優選的，每毫升液體發酵培養基中添加 泛素蛋白I. 6mg。
[0023] 所述的泛素蛋白採用從大多數食藥真菌或植物等原料中提取的泛素蛋白，可以 選用市售產品，也可以採用現有方法製備，如從靈芝原料中提取的泛素蛋白，可採用以下 製備方法製備，包括：向靈芝超微粉中加入佔靈芝超微粉質量10倍量-30倍量的蒸餾 水，再加入佔靈芝超微粉質量0.5 % -3 %的纖維素酶和佔靈芝超微粉質量0.3 % -2% 的果膠酶，在35 °C -55 °C攪拌lh-2h，然後在70MPa-100MPa下勻漿；3 °C -5 °C條件下 10000rpm-30000rpm(rpm表示轉/分鐘）離心10min-15min，收集上清液得到粗蛋白液；將 粗蛋白液通過微濾膜（如〇. 22 μ m的微濾膜）收集濾過液，以除去其中的微粒和細菌；將 所述濾過液在3°C _5°C下用截留分子量為5000Da-10000Da的超濾膜進行濃縮，得到泛素蛋 白。
[0024] 所述的靈芝超微粉為靈芝經超微粉碎得到，其製備包括：將靈芝子實體清洗、烘乾 後進行超微粉碎（如在超微粉碎機中進行超微粉碎），得到靈芝超微粉。所述的超微粉碎優 選溫度為l〇°C -40°C，處理時間3min-20min。
[0025] 所述的果膠酶的酶活力優選為3. 0萬U/g-5. 0萬U/g、纖維素酶的酶活力優選為 2. 0 萬 U/g-3. 0 萬 U/g。
[0026] 所述的桑黃液體發酵培養的溫度為自然環境溫度，一般為20°C -30°C，優選為 25°C -30°C。
[0027] 本發明，所述的桑黃液體發酵產物經過後續的分離處理可以從桑黃菌絲體中提 取、測定麥角留醇含量。所述的分離處理為本領域常規的分離方法，例如過濾或離心；可 包括：將所述的桑黃髮酵產物用紗布過濾，從過濾所得菌絲體中提取、測定麥角留醇含量。 具體的提取步驟包括：將菌絲體用水衝洗乾淨，在55°C -65°C乾燥至恆重，按料液質量比 1:10-30加入CHCl3，超聲波（優選功率250W-300W，頻率40kHz-50kHz)浸提lh-1. 5h，離心 取上清液，殘渣用CHCl3洗滌後離心取上清液，合併上清液得到含麥角留醇的提取液。
[0028] 本發明所用的培養基均需滅菌、冷卻後使用，滅菌的條件採用本領域的常規條件， 例如可在 120°C _125°C下滅菌 20min-30min。
[0029] 青錢柳（Cyclocarya paliurus)又名青錢李、搖錢樹等，系胡桃科青錢柳屬植物， 是中國特有的單種屬植物。青錢柳是一種高大速生喬木，奇數羽狀複葉，廣泛分布於江西、 浙江、江蘇、安徽、福建、臺灣、湖北、四川、貴州等地的海拔420m-2500m的山區、溪谷或石灰 巖山地。其樹皮、樹葉具有清熱解毒，止痛功能。
[0030] 靈芝（Ganoderma Lucidum(Leyss. ex Fr. )Karst.)外形呈傘狀，菌蓋腎形、半圓形 或近圓形，為多孔蓖科真菌靈芝的子實體。具有補氣安神，止咳平喘的功效，用於眩暈不眠， 心悸氣短，虛勞咳喘。
[0031] 本發明同現有技術相比有如下優點：
[0032] 1.本發明將泛素蛋白用於桑黃麥角留醇類成分的液體發酵生產，且優化了發酵方 法，大幅度提高了桑黃液體發酵產物中麥角甾醇的含量，可達到2. 15mg/g，提取的麥角甾醇 可用於食品、醫藥和飼料工業中。
[0033] 2.本發明所採用的桑黃菌絲體液體發酵方法簡單，重複性好，發酵周期短，效率 高，同時利用天然產物作為生產原料，環保無毒，成本低。整個發酵過程可控，不受外部環境 條件限制，非常適合工業化生產和應用推廣。本發明方法同樣適用於發酵罐規模化生產，具 有很好的工業化應用前景。
[0034] 3.本發明採用的泛素蛋白可從大多數食藥真菌及植物等原料中提取，來源廣泛， 成本較低，製備方法也相對簡單，可規模提取生產，對桑黃麥角留醇活性物質的發酵生產具 有很好的促進效果。

【具體實施方式】
[0035] 下面結合部分具體實施例對本
【發明內容】
進行進一步闡明，但本發明的內容並不僅 限於下面的實施例。
[0036] 桑黃（Phellinus linteus)ACCC51181菌種購於中國農業微生物菌種保藏管理中 心。
[0037] 實施例1
[0038] 一、材料準備
[0039] 果膠酶（酶活力為5. 0萬U/g)，纖維素酶（酶活力為3. 0萬U/g)，由廣西龐博生 物工程有限公司提供。
[0040] PDA平板培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂15g，用水定容至1000ml，自然 pH，在 121°C 下滅菌 20min。
[0041] 將斜面保藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養基上，進行活化培養，培養溫度25°C， 培養時間7天，得到活化後的桑黃菌種菌塊。
[0042] 青錢柳提取物的製備方法，包括：稱取一定量的青錢柳葉，粉碎過100目，先加佔 青錢柳葉重量13倍量的質量百分濃度為70%的乙醇水溶液在60°C浸提I. 0h，過濾後得到 上清液，上清液濃縮後真空冷凍乾燥得提取物I ;上述醇提後的青錢柳葉殘渣加入佔青錢 柳葉重量10倍量的蒸餾水在85°C下浸提lh，過濾後得到上清液，上清液濃縮至1/4體積後 加入濃縮物體積2倍量的無水乙醇，5000rpm離心IOmin收集沉澱物，沉澱物真空冷凍乾燥 後得提取物II，合併上述提取物I和提取物II得青錢柳提取物。
[0043] 以靈芝為原料製備的泛素蛋白，製備方法包括：將靈芝子實體清洗、烘乾後放入超 微粉碎機中進行超微低溫粉碎，溫度25°C，處理時間lOmin，得到靈芝超微粉。向靈芝超微 粉中加入佔靈芝超微粉質量20倍量的蒸餾水，再加入佔靈芝超微粉質量1 %的纖維素酶和 佔靈芝超微粉質量〇. 5%的果膠酶，在40°C攪拌lh，然後放入勻漿機中在80MPa下勻漿3 次；4°C條件下IOOOOrpm離心15min，收集上清液得到粗蛋白液；將粗蛋白液通過0. 22 μ m 微濾膜收集濾過液，以除去其中的微粒和細菌；將所述濾過液在4°C下用截留分子量為 SOOODa的超濾膜進行濃縮，得到濃縮液，即為泛素蛋白。
[0044] 二、桑黃液體發酵產物的製備
[0045] (1)種子液製備：取2cm2大小活化後的桑黃菌種菌塊接種於IL添加青錢柳提取物 的液體種子培養基中，每升液體種子培養基中青錢柳提取物的添加量為8g，IL液體種子培 養基組成為：葡萄糖l〇g/L、酵母粉4g/L、蛋白腖3g/L、KH 2P04lg/L、MgSO4O. 5g/L和餘量的 水，pH自然；25°C培養4天，得到種子液。
[0046] (2)桑黃液體發酵培養：將種子液按佔液體發酵培養基體積10%的量接種於液體 發酵培養基中，在28°C培養2天後，加入泛素蛋白，每毫升液體發酵培養基中添加泛素蛋白 I. 6mg，然後繼續培養3天，終止發酵後，得到桑黃液體發酵產物。其中，液體發酵培養基的 組成為：葡萄糖 20g/L、蛋白腖 4g/L、麥麩 5g/L、穀氨酸 2. 5g/L、KH2PO4L 5g/L、MgSO4O. 75g/ L和餘量的水。
[0047] 三、測定
[0048] 1.菌絲生物量的測定：桑黃液體發酵產物經8層紗布過濾，過濾所得菌絲體用蒸 餾水衝洗3次，然後置60°C烘箱中烘乾至恆重，即為樣品，稱重。
[0049] 2.麥角甾醇提取：精密稱取Ig菌絲體樣品，置於25mL容量瓶，加入20mL CHCl3 液，超聲波浸提Ih (功率250W，頻率40kHz)，然後4000r/min離心5min，取上清液，殘渣用 5mLCHCl3洗滌後4000r/min離心5min，取上清液。合併兩次上清液得到含麥角甾醇的提取 液。
[0050] 3.麥角甾醇含量測定：將含麥角甾醇的提取液用CHCl3定容至25mL得萃取液，取 2mL萃取液，氮氣吹乾後用5mL甲醇溶解，經0. 45 μ m微孔濾膜過濾，濾液供HPLC分析用。
[0051] 高效液相色譜條件：色譜柱：安捷倫C18色譜柱（200mm X 4. 6mm，5 μ m);流動相：甲 醇（色譜級），流速I. 2mL/min ;UV檢測波長：檢測波長282nm，柱溫30°C，進樣量10 μ L。
[0052] 檢測結果見表1。
[0053] 實施例2
[0054] 一、材料準備
[0055] 果膠酶（酶活力為3. 0萬U/g)，纖維素酶（酶活力為2. 0萬U/g)，由廣西龐博生 物工程有限公司提供。
[0056] PDA平板培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂20g，用水定容至1000ml，自然 pH，在 121°C 下滅菌 20min。
[0057] 將斜面保藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養基上，進行活化培養，培養溫度28°C， 培養時間9天，得到活化後的桑黃菌種菌塊。
[0058] 青錢柳提取物的製備方法，包括：稱取一定量的青錢柳葉，粉碎過60目，先加佔青 錢柳葉重量16倍量的質量百分濃度為80%的乙醇水溶液在80°C浸提2h，過濾後得到上清 液，上清液濃縮後真空冷凍乾燥得提取物I ;上述醇提後的青錢柳葉殘渣加入佔青錢柳葉 重量20倍量的蒸餾水在95°C下浸提2. 5h，過濾後得到上清液，上清液濃縮至1/4體積後加 入濃縮物體積5倍量的無水乙醇，5000rpm離心IOmin收集沉澱物，沉澱物真空冷凍乾燥後 得提取物II，合併上述提取物I和提取物II得青錢柳提取物。
[0059] 以靈芝為原料製備的泛素蛋白，製備方法包括：將靈芝子實體清洗、烘乾後放入超 微粉碎機中進行超微低溫粉碎，溫度40°C，處理時間3min，得到靈芝超微粉。向靈芝超微粉 中加入佔靈芝超微粉質量30倍量的蒸餾水，再加入佔靈芝超微粉質量3%的纖維素酶和佔 靈芝超微粉質量〇. 3%的果膠酶，在55°C攪拌I. 5h，然後放入勻漿機中在IOOMPa下勻漿3 次；5°C條件下30000rpm離心IOmin,收集上清液得到粗蛋白液；將粗蛋白液通過0. 22 μ m 微濾膜收集濾過液，以除去其中的微粒和細菌；將所述濾過液在5°C下用截留分子量為 IOOOODa的超濾膜進行濃縮，得到濃縮液，即為泛素蛋白。
[0060] 二、桑黃液體發酵產物的製備
[0061] (1)種子液製備：取5cm2大小活化後的桑黃菌種菌塊接種於IL添加青錢柳提取物 的液體種子培養基中，每升液體種子培養基中青錢柳提取物的添加量為l〇g，IL液體種子 培養基組成為：葡萄糖15g/L、酵母粉4g/L、蛋白腖3g/L、KH 2P04lg/L、MgS040. 5g/L和餘量的 水，pH自然；28°C培養5天，得到種子液。
[0062] (2)桑黃液體發酵培養：將種子液按佔液體發酵培養基體積15%的量接種於液體 發酵培養基中，在28°C培養3天後，加入泛素蛋白，每毫升液體發酵培養基中添加泛素蛋白 〇. 8mg，然後繼續培養4天，終止發酵後，得到桑黃液體發酵產物。其中，液體發酵培養基的 組成為：葡萄糖 20g/L、蛋白腖 4g/L、麥麩 5g/L、穀氨酸 5g/L、KH2PO4L 5g/L、MgSO4O. 75g/L 和餘量的水。
[0063] 三、測定
[0064] 1.菌絲生物量的測定：桑黃液體發酵產物經8層紗布過濾，過濾所得菌絲體用蒸 餾水衝洗3次，然後置65°C烘箱中烘乾至恆重，即為樣品，稱重。
[0065] 2.麥角留醇提取：精密稱取Ig樣品，置於25mL容量瓶，加入6.8mLCHCljf，超 聲波浸提I. 5h(功率300W，頻率50kHz)，然後4000r/min離心5min，取上清液，殘渣用 5mLCHCl3洗滌後4000r/min離心5min，取上清液。合併兩次上清液得到含麥角甾醇的提取 液。
[0066] 3.麥角甾醇含量測定：將含麥角甾醇的提取液用CHCl3定容至25mL得到萃取液， 取2mL萃取液，氮氣吹乾後用5mL甲醇溶解，經0. 45 μ m微孔濾膜過濾，濾液供HPLC分析用。
[0067] 高效液相色譜條件，同實施例1。
[0068] 檢測結果見表1。
[0069] 實施例3
[0070] 一、材料準備
[0071] 果膠酶（酶活力為4. 0萬U/g)，纖維素酶（酶活力為2. 0萬U/g)，由廣西龐博生 物工程有限公司提供。
[0072] PDA平板培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂15g，用水定容至1000ml，自然 pH，在 121°C 下滅菌 20min。
[0073] 將斜面保藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養基上，進行活化培養，培養溫度30°C， 培養時間4天，得到活化後的桑黃菌種菌塊。
[0074] 青錢柳提取物的製備方法，包括：稱取一定量的青錢柳葉，粉碎過40目，先加佔青 錢柳葉重量10倍量的質量百分濃度為60%的乙醇水溶液在70°C浸提I. 5h，過濾後得到上 清液，上清液濃縮後真空冷凍乾燥得提取物I ;上述醇提後的青錢柳葉殘渣加入佔青錢柳 葉重量15倍量的蒸餾水在90°C下浸提I. 5h，過濾後得到上清液，上清液濃縮至1/4體積後 加入濃縮物體積4倍量的無水乙醇，5000rpm離心IOmin收集沉澱物，沉澱物真空冷凍乾燥 後得提取物II，合併上述提取物I和提取物II得青錢柳提取物。
[0075] 以靈芝為原料製備的泛素蛋白，製備方法包括：將靈芝子實體清洗、烘乾後放入超 微粉碎機中進行超微低溫粉碎，溫度KTC，處理時間20min，得到靈芝超微粉。向靈芝超微 粉中加入佔靈芝超微粉質量10倍量的蒸餾水，再加入佔靈芝超微粉質量〇. 5%的纖維素酶 和佔靈芝超微粉質量2%的果膠酶，在35°C攪拌2h，然後放入勻漿機中在70MPa下勻漿3 次；3°C條件下20000rpm離心IOmin,收集上清液得到粗蛋白液；將粗蛋白液通過0. 22 μ m 微濾膜收集濾過液，以除去其中的微粒和細菌；將所述濾過液在:TC下用截留分子量為 5000Da的超濾膜進行濃縮，得到濃縮液，即為泛素蛋白。
[0076] 二、桑黃液體發酵產物的製備
[0077] (1)種子液製備：取3cm2大小活化後的桑黃菌種菌塊接種於IL添加青錢柳提取物 的液體種子培養基中，每升液體種子培養基中青錢柳提取物的添加量為5g，IL液體種子培 養基組成為：葡萄糖20g/L、酵母粉4g/L、蛋白腖3g/L、KH2P04lg/L、MgSO 4O. 5g/L和餘量的 水，pH自然；22°C培養6天，得到種子液。
[0078] (2)桑黃液體發酵培養：將種子液按佔液體發酵培養基體積20%的量接種於液體 發酵培養基中，在30°C培養4天後，加入泛素蛋白，每毫升液體發酵培養基中添加泛素蛋白 2. 4mg，然後繼續培養2天，終止發酵後，得到桑黃液體發酵產物。其中，液體發酵培養基的 組成為：葡萄糖 20g/L、蛋白腖 4g/L、麥麩 5g/L、穀氨酸 4g/L、KH2PO4L 5g/L、MgSO4O. 75g/L 和餘量的水。
[0079] 三、測定同實施例1。檢測結果見表1。
[0080] 實施例4
[0081] 一、材料準備
[0082] 果膠酶（酶活力為5. 0萬U/g)，纖維素酶（酶活力為3. 0萬U/g)，由廣西龐博生 物工程有限公司提供。
[0083] PDA平板培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂15g，用水定容至1000ml，自然 pH，在 121°C 下滅菌 20min。
[0084] 將斜面保藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養基上，進行活化培養，培養溫度22°C， 培養時間10天，得到活化後的桑黃菌種菌塊。
[0085] 青錢柳提取物和泛素蛋白同實施例1。
[0086] 二、桑黃液體發酵產物的製備
[0087] (1)種子液製備：取3cm2大小活化後的桑黃菌種菌塊接種於IL添加青錢柳提取物 的液體種子培養基中，每升液體種子培養基中青錢柳提取物的添加量為lg，IL液體種子培 養基組成為：葡萄糖8g/L、酵母粉4g/L、蛋白腖3g/L、KH 2P04lg/L、MgS040. 5g/L和餘量的水， pH自然；30°C培養3天，得到種子液。
[0088] (2)桑黃液體發酵培養：將種子液按佔液體發酵培養基體積8%的量接種於液體 發酵培養基中，在22°C培養1天後，加入泛素蛋白，每毫升液體發酵培養基中添加泛素蛋白 0. 2mg，然後繼續培養2天，終止發酵後，得到桑黃液體發酵產物。其中，液體發酵培養基的 組成為：葡萄糖 20g/L、蛋白腖 4g/L、麥麩 5g/L、穀氨酸 I. 5g/L、KH2PO4L 5g/L、MgSO4O. 75g/ L和餘量的水。
[0089] 三、測定同實施例1。檢測結果見表1。
[0090] 實施例5
[0091] 一、材料準備
[0092] 果膠酶（酶活力為5. 0萬U/g)，纖維素酶（酶活力為3. 0萬U/g)，由廣西龐博生 物工程有限公司提供。
[0093] PDA平板培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂15g，用水定容至1000ml，自然 pH，在 121°C 下滅菌 20min。
[0094] 將斜面保藏的桑黃菌種接種到PDA平板培養基上，進行活化培養，培養溫度22°C， 培養時間10天，得到活化後的桑黃菌種菌塊。
[0095] 青錢柳提取物，購於西安賽奧生物技術有限公司。
[0096] 泛素蛋白，同實施例1。
[0097] 二、桑黃液體發酵產物的製備
[0098] (1)種子液製備：取3cm2大小活化後的桑黃菌種菌塊接種於IL添加青錢柳提取物 的液體種子培養基中，每升液體種子培養基中青錢柳提取物的添加量為6g，IL液體種子培 養基組成為：葡萄糖5g/L、酵母粉4g/L、蛋白腖3g/L、KH2P04lg/L、MgS0 40. 5g/L和餘量的水， pH自然；20°C培養7天，得到種子液。
[0099] (2)桑黃液體發酵培養：將種子液按佔液體發酵培養基體積5%的量接種於液體 發酵培養基中，在20°C培養1天後，加入泛素蛋白，每毫升液體發酵培養基中添加泛素蛋白 3mg，然後繼續培養2天，終止發酵後，得到桑黃液體發酵產物。其中，液體發酵培養基的組 成為：葡萄糖 20g/L、蛋白腖 4g/L、麥麩 5g/L、穀氨酸 0· 5g/L、KH2PO4L 5g/L、MgSO4O. 75g/L 和餘量的水。
[0100] 三、測定同實施例1。檢測結果見表1。
[0101] 對比例1
[0102] (1)搖瓶種子培養
[0103] IL液體種子培養基：葡萄糖10g/L、酵母粉4g/L、蛋白腖3g/L、KH2P04lg/L、 MgS04(X5g/L和餘量的水。pH自然，在121°C下滅菌20min。
[0104] 培養方法：取2cm2大小實施例1中活化後的桑黃菌種菌塊接入滅菌冷卻後IL液 體種子培養基中，25°C，120r/min下搖床培養4天，得到培養好的種子液。
[0105] (2)搖瓶發酵培養
[0106] 液體發酵培養基同實施例1。pH自然，在121°C下滅菌20min。
[0107] 培養方法：將培養好的種子液按佔液體發酵培養基體積10%的接種量接入液體 發酵培養基中，在25°C，120r/min搖床中培養12天。每個試驗設3個平行。
[0108] 檢測結果見表1。
[0109] 對比例2僅添加青錢柳提取物，不添加泛素蛋白
[0110] 除了"二、桑黃液體發酵產物的製備（1)種子液製備：取3cm2大小活化後的桑黃菌 種菌塊接種於IL添加青錢柳提取物的液體種子培養基中，每升液體種子培養基中青錢柳 提取物的添加量為6g，IL液體種子培養基組成為：葡萄糖5g/L、酵母粉4g/L、蛋白腖3g/L、 KH2P04lg/L、MgSO4O. 5g/L和餘量的水，pH自然；20°C培養7天，得到種子液。⑵桑黃液體 發酵培養：將種子液按佔液體發酵培養基體積5 %的量接種於液體發酵培養基中，在20°C 培養1天後,繼續培養2天，終止發酵後，得到桑黃液體發酵產物。其中，液體發酵培養基的 組成為：葡萄糖 20g/L、蛋白腖 4g/L、麥麩 5g/L、穀氨酸 0. 5g/L、KH2PO4L 5g/L、MgSO4O. 75g/ L和餘量的水。"之外，其餘操作同實施例5。檢測結果見表1。
[0111] 對比例3僅添加泛素蛋白，不添加青錢柳提取物
[0112] 除了"二、桑黃液體發酵產物的製備（1)種子液製備：取3cm2大小活化後的桑黃菌 種菌塊接種於液體種子培養基，IL液體種子培養基組成為葡萄糖5g/L、酵母粉4g/L、蛋白 腖3g/L、KH 2P04lg/L、MgS040. 5g/L和餘量的水，pH自然；20°C培養7天，得到種子液。⑵桑 黃液體發酵培養：將種子液按佔液體發酵培養基體積5 %的量接種於液體發酵培養基中， 在20°C培養1天後，加入泛素蛋白，每毫升液體發酵培養基中添加泛素蛋白3mg，然後繼續 培養2天，終止發酵後，得到桑黃液體發酵產物。其中，液體發酵培養基的組成為：葡萄糖 20g/L、蛋白腖 4g/L、麥麩 5g/L、穀氨酸 0. 5g/L、KH2PO4L 5g/L、MgSO4O. 75g/L 和餘量的水。" 之外，其餘操作同實施例5。檢測結果見表1。
[0113] 表1桑黃液體發酵代謝產物含量檢測結果
[0114]

【權利要求】
1. 一種提高桑黃液體發酵產物中麥角留醇含量的方法，其特徵在於，包括步驟： (1) 種子液製備：將活化後的桑黃菌種接種於添加青錢柳提取物的液體種子培養基中 培養3天-7天，得種子液； (2) 桑黃液體發酵培養：將步驟（1)中的種子液按佔液體發酵培養基體積5% -20 %的 量接種於液體發酵培養基中，培養1天-4天後，加入泛素蛋白，然後繼續培養2天-4天，終 止發酵後，得到桑黃液體發酵產物。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟（1)中，每升液體種子培養基中青錢 柳提取物的添加量為lg-l〇g。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的青錢柳提取物為以青錢柳葉為原 料製備的青錢柳提取物。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述的青錢柳提取物由青錢柳葉醇提取 物和青錢柳葉水提取物組成。
5. 根據權利要求1或3所述的方法，其特徵在於，所述的青錢柳提取物的製備方法，包 括：稱取一定量的青錢柳葉，粉碎，先加佔青錢柳葉重量10倍量-16倍量的質量百分濃度為 60% -80%的乙醇水溶液在60°C -80°C浸提lh-2h，過濾後得到上清液，上清液濃縮後真空 冷凍乾燥得提取物I ;上述醇提後的青錢柳葉殘渣加入佔青錢柳葉重量10倍量-20倍量的 水在85°C -95°C下浸提lh-2. 5h，過濾後得到上清液，上清液濃縮至1/4體積後加入濃縮物 體積2倍量-5倍量的無水乙醇，離心收集沉澱物，沉澱物真空冷凍乾燥後得提取物II，合併 上述提取物I和提取物II得青錢柳提取物。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟（2)中，所述的桑黃液體發酵培養的 溫度為 20°C -30°C。
7. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的液體發酵培養基的組成為：以 1L液體發酵培養基計，葡萄糖20g、蛋白腖4g、麥麩5g、穀氨酸0. 5g-5g、KH2P041. 5g、 MgS040. 75g和餘量的水。
8. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，每毫升液體發酵培養基中添加泛素蛋白 0. 2mg-3. 0mg〇
9. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的泛素蛋白的製備方法，包括： 向靈芝超微粉中加入佔靈芝超微粉質量10倍量-30倍量的水，再加入佔靈芝超微粉 質量0.5 % -3 %的纖維素酶和佔靈芝超微粉質量0.3 % -2 %的果膠酶，在35 °C -55 °C 攪拌 lh-2h，然後在 70MPa-100MPa 下勻漿；3 °C -5 °C 條件下 10000rpm-30000rpm 離心 10min-15min，收集上清液得到粗蛋白液；將粗蛋白液通過微濾膜收集濾過液，以除去其中 的微粒和細菌；將所述濾過液在3°C _5°C下用截留分子量為5000Da-10000Da的超濾膜進行 濃縮，得到泛素蛋白。
【文檔編號】C12R1/645GK104278070SQ201410565891
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年10月21日 優先權日:2014年10月21日
【發明者】程俊文, 賀亮, 胡傳久, 魏海龍, 付立忠, 李海波 申請人:浙江省林業科學研究院