鼠源dcf1特異性多克隆抗體及其製備方法

2023-05-28 21:53:01 2

專利名稱：鼠源dcf1特異性多克隆抗體及其製備方法
技術領域：
本發明涉及了一種新的鼠源DCFl特異性多克隆抗體及其製備方法。
背景技術：
樹突狀細胞因子(dendritic cell factor I, DCFl)又名跨膜蛋白59(transmembrane protein 59, TMEM59),首先發現於免疫系統的樹突細胞中，是一個表達範圍比較普遍的單次跨膜蛋白。根據UniProt對其的注釋信息，DCFl主要定位在高爾基體上。目前對於該蛋白的功能研究報導還比較少，其功能可能與物質的運輸相關，已有報導和文章表明DCFl與其同源蛋白TMEM59-like能夠抑制澱粉樣前體蛋白APP向細胞膜的轉運以及進一步的剪切，而APP與阿爾茲海默症(Alzheimer’s disease, AD)的形成相關,說明DCFl與神經退行性疾病存在某種聯繫。
根據目前已有的信息，DCFl商品化的相關抗體只有抗人的多克隆抗體，雖然其說明上指出也能抗鼠源的DCF1，但是在實際應用中發現這種識別效果非常不好；而抗鼠源DCFl商品化的抗體還沒有。隨著DCFl研究的深入，相關功能的報導肯定會越來越多，而且為了深入研究，必然會藉助一些模式動物如小鼠、果蠅等。所以，製備一種新的抗鼠源DCFl的特異性抗體進行後續研究具有迫切性。

發明內容
本發明目的之一在於提供一種鼠源DCFl特異性多克隆抗體。本發明的目的之二在於提供該克隆抗體的製備方法。為達到上述目的，本發明採用如下技術方案
一種鼠源DCFl特異性多克隆抗體，其特徵在於所述的特異性多克隆抗體是將SEQ IDNO: 2的第44位到76位胺基酸殘基組成的多肽特異性結合。上述的特異性多克隆抗體是將SEQ ID NO: 2的第44位到76位胺基酸殘基對應的cDNA序列構建到原核表達質粒pGEX-4T-l中，得到重組質粒pGEX_4Tl_59a，再將該重組質粒轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，得到可溶表達帶有鼠源DCFl第44位到76位胺基酸殘基的多肽融和蛋白。上述的特異性多克隆抗體是將多肽融和蛋白作為抗原免疫動物而獲得。一種製備上述的鼠源DCFl特異性多克隆抗體的方法，其特徵在於該方法的具體步驟為
a.對DCFl胺基酸序列進行了蛋白跨膜結構預測，其中第I到239位胺基酸為胞外段結
構；
b.用PCR處於胞外段第44到76位胺基酸殘基對應的cDNA，重組入pGEX_4T_l中，構建成 pGEX-4Tl-59a 載體；
c.將載體轉化到BL21(DE3)中，原核可溶表達表達得到包含目的DCFl多肽的可溶性融合蛋白；d.將融合蛋白為抗原免疫動物燥，得到以上述製備的蛋白，按照多抗免疫方案進行動物免疫，得到特異性多克隆抗體。利用Western Blot和Immunohistochemical技術對製備得到的多克隆抗體進行特異性評測。同時利用製備的上述多克隆抗體檢測小鼠乳腺癌細胞4T1及正常小鼠乳腺組織DCFl的蛋白表達情況，發現4T1中DCFl的表達高於正常組織。為了更加確認這種結果，通過在4T1細胞的培養基中JNK inhibitor II，而JNK信號通路已被證實與多種疾病相關，因此，JNK被認為是可以調節疾病狀態細胞恢復到正常狀態的一個潛在靶點。當4T1細胞受到JNK inhibitor II的抑制後，出現增殖速度變慢這種癌細胞狀態發生改變的現象，再通過上述製備的多克隆抗體檢測DCFl的表達變化後發現，DCFl在4T1中的表達量隨著其 癌細胞狀態受抑制程度的加深而降低。用該抗體能檢測到小鼠乳腺癌細胞4T1與正常的小鼠乳腺組織中DCFl的表達差異，將4T1的癌細胞狀態通過JNK inhibitor II抑制後，通過製備的多克隆抗體也檢測到了 DCFl的蛋白表達減少，說明製備的多克隆抗體可以用來檢測小鼠乳腺癌不同狀態下DCFl的表達水平。


圖I為TMHMM Server V. 2. O預測的DCFl跨膜結構
圖2為擴增的抗原序列cDNA片段及重組質粒pGEX-4Tl-59a經BamHI和SalI雙酶切的電泳圖(A-擴增到的抗原序列cDNA片段；B-重組質粒pGEX-4Tl-59a酶切產物)，說明目的片段已經插入到PGEX-4T-1載體中。圖3為擴增的Elisa底物篩選序列cDNA片段及重組質粒pET-30a_59c經
和&7I雙酶切的電泳圖(A-Elisa底物篩選序列cDNA片段；B_重組質粒pET-30a_59c酶切產物)，說明目的片段已經插入到pET-30a載體中。圖4 A為pGEX-4Tl-59a轉化到BL21(DE3)中，經IPTG誘導表達，超聲破碎後的表達產物SDS-PAGE分析(I-Marker ;2_菌體超聲破碎後的上清液；3_菌體超聲破碎後的沉澱)，說明目的蛋白主要分布在可溶相；B為A中得到的上清液經Glutathione Resin純化後的SDS-PAGE分析(I-PBS稀釋的菌體破碎上清，即樣品；2_樣品經Glutathione Resin後的流出液；3_PBS洗滌流出液；4_洗脫流出液；5-Marker)，說明目的蛋白主要在洗脫液中，可以用作抗原。圖5 A為pET-30a-59c轉化到BL21(DE3)中，經IPTG誘導表達，超聲破碎後的表達產物SDS-PAGE分析(I-菌體超聲破碎後的上清液；2_菌體超聲破碎後的沉澱；3-Marker)，說明目的蛋白主要分布在可溶相；B為A中得到的上清液經Ni柱純化後的SDS-PAGE分析(I上樣樣品；2_樣品經Ni柱後的流出液；3-PBS洗滌流出液；4、5_洗脫流出液；6_Marker)，說明目的蛋白主要在洗脫液中，可以用作Elisa篩選用底物。圖6為在哺乳動物細胞HEK293T過表達鼠的DCF1，對製備的多克隆抗體進行Western Bolt分析(A-HEK293T白光照片；B-對HEK293T轉染pEGFP_N2質粒後的螢光照片；C對-HEK293T轉染pEGFP-N2-DCFl質粒後的螢光照片；D_抽提A，B, C蛋白進行的WesternBolt)，說明製備的多克隆抗體對內源DCFl的特異性結合能力。圖7為在哺乳動物細胞U251轉染pEGFP-N2-DCFl質粒後，對製備的多克隆抗體進行螢光共定位分析。(A，E)EGFP，綠色；(B，F)本發明製備的抗DCFl多克隆抗體，紅色；(C，G)DAPI，藍色；(D，H)Merge。說明製備的多克隆抗體能與細胞內的DCFl共定位，具有特異性結合能力。圖8為使用製備的多克隆抗體對小鼠乳腺癌細胞4T1與正常小鼠乳腺組織進行的DCFl表達水平分析，Western Bolt結果顯示在4T1中DCFl表達水平要高於正常組織。圖9為通過CCK-8檢測在4T1細胞的培養基中加入JNK inhibitor II後細胞的增殖情況，結果顯示加入抑制劑4T1的增殖受到明顯抑制，說明4T1細胞在JNK受到抑制後的癌症狀態發生改變，增殖能力顯著減弱。圖10為不同抑制劑濃度及作用時間下4T1細胞的生長狀態照片以及對應條件下4T1細胞內DCFl的表達情況，結果表明製備的多克隆抗體能夠檢測到4T1在癌症狀態發生改變後引起細胞內DCFl表達的變化。
具體實施例方式實施例一 pGEX-4Tl_59a與pET-30a_59c原核表達載體的構建與鑑定
用TMHMM Server v. 2. O對DCFl胺基酸序列進行的蛋白跨膜結構預測,利用Premier5. O軟體以及表達的融合蛋白不發生移碼突變的原理設計DCFl膜外段抗原序列及Elisa底物用蛋白序列的上遊和下遊引物，在其上遊和下遊引物中分別引入和&7I的酶切位點及相應的保護鹼基，並且在上下遊引物中分別加入起始密碼和終止密碼，引物由上海英濰捷基公司合成。其中抗原序列的上遊引物為5』 -CGCGGATCCatgGACACAGCGTCCTGTCAC-3』，下遊引物為5』 -CAAGACGTCGACctaCAGCCTGCAGCCTCTCTGG-3』 ； Elisa 底物用蛋白序列的上遊引物為5』 -CGCGGATCCatgGACACAGCGTCCTGTCAC-3，下遊引物為5』 - CAAGACGTCGACctaTCCAGAGTTMGAGATAG -3』。以小鼠腦cDNA為模板，用上下遊引物擴增抗原序列和Elisa底物用蛋白序列，將抗原序列插入到PGEX-4T-1載體中，將Elisa底物用蛋白序列插入到pET-30a載體中。酶切，PCR鑑定，測序正確，見圖2、圖3。載體構建完成後可以用於後續實驗。實施例二 抗原多肽融合蛋白的可溶性表達及純化
將pGEX-4Tl-59a載體熱激轉化到BL21 (DE3)感受態中，待平板上長出菌落後，用滅菌牙籤挑單菌落至裝有5mL LB培養基的試管中，37°C、220rpm振蕩培養過夜，按1%的接種量即2mL菌液加至裝有200mL LB培養基的三角瓶中，37°C振蕩培養之0D_為O. 8時，加入IPTG至終濃度為O. 5mM進行誘導培養，37°C繼續振蕩培養4h後，6000rpm離心5min將菌體收集到50 mL離心管中。將收集有菌體的50 mL離心管置於冰上，加入預冷的菌體超聲破碎緩衝液10mL，300W，30s超聲，15s暫停，持續30min。破碎完全後，將離心管放到離心機當中，4°C、IIOOOrpm離心15min，收集上清，純化前上清保存於一 80°C冰箱中。分別取少量上清與沉澱作為樣本，進行SDS-PAGE融合蛋白可溶性表達分析，見圖4-A。結果顯示目的蛋白主要存在於上清相中，達到了可溶性表達抗原多肽融合蛋白的目的。利用GST標籤對上清中的目的蛋白進行純化，具體流程參照GenScipt的Glutathione Resin產品說明書，並取純化過程中各組分進行SDS-PAGE分析，見圖4-B。結果表明目的蛋白主要存在於洗脫液當中，純化成功，可以用作後續免疫的抗原。實施例三=Elisa底物用蛋白的表達及純化
將pET-30a-59c載體熱激轉化到BL21 (DE3)感受態中，後續擴大培養、誘導發酵和超聲破碎同實施例二中的方法。分別取少量上清與沉澱作為樣本，進行SDS-PAGE融合蛋白可溶性表達分析，見圖5-A。結果顯示目的蛋白存在於上清相中。利用His標籤對上清中的目的蛋白進行純化，具體流程參照AmershamBiosciences的Ni Sepharose 6 Fast Flow產品說明書，並取純化過程中各組分進行SDS-PAGE分析，見圖5-B。結果表明目的蛋白主要存在於洗脫液當中，純化成功，可以用作後續Elisa檢測用底物包被蛋白。實施例四多克隆抗體製備
實施例二製備得到的融合蛋白可以作為抗原用於動物免疫，本發明主要以紐西蘭大白兔(購於復旦大學實驗動物中心)為免疫對象進行抗體製備，免疫過程如下取2kg重的紐西蘭大白兔，免疫前耳靜脈取血作為對照。首次免疫抗原量為400μ g蛋白，注射體積為500 μ L,佐劑為弗式完全佐劑,乳化完全後兔背部4點注射。15天後進行第二次免疫,抗原量為400 μ g蛋白，注射體積為500 μ L,佐劑為弗式不完全佐劑，乳化完全後兔背部4點注 射。此後第10和20天分別進行第三和四次免疫，免疫操作與第二次相同。第四次免疫一周後用Elisa法檢測抗血清效價，當效價未達到IO6時，繼續進行免疫，當效價達到IO6後，不再進行免疫，2周後可以進行取血和抗血清的收集。抗血清的收集將收集的血置於37°C半小時，4°C，IlOOOrpm離心15min，收集上清分裝保存於一80°C。實施例五間接Elisa法檢測抗血清效價
I.將實施例二製得的pET-30a-59c表達的蛋白用包被緩衝液稀釋成10 μ g/mL,吸取包被抗原到Elisa板中，100 μ L/孔，4°C過夜。說明此處以pET-30a_59c表達蛋白作為底物的目的是排除GST標籤引起的免疫反應(即假陽性)，因為pET-30a帶的標籤是His標籤，而插入的片段包括了用作抗原GST標籤蛋白的全部序列。2.倒掉Elisa板中的液體，PBST洗板3次，200 μ L/孔，拍幹。3.用封閉液進行封閉，300 μ L/孔，37 °C、2h，封閉完後倒掉封閉液，PBST洗板3次，200 μ L/孔，拍幹。4.抗血清用PBST稀釋成濃度梯度分別為1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:12800、1:256000、1:512000、1:1024000，每孔加入不同濃度
一抗100 μ L。對照為免疫前小鼠血清，稀釋梯度如上，37°C孵育2h。5.倒掉一抗，PBST洗板3次，200 μ L/孔，拍幹。6.羊抗兔 IgG-HRP 用 PBST 稀釋成 1:10000，每孔加樣 100yL，37°C 孵育 lh。7.倒掉二抗，PBST洗板3次，200 μ L/孔，拍幹。8.底物OPD用底物稀釋液稀釋成50 μ g/mL,每孔加樣100 μ L，37°C孵育30min。9.每孔加50 μ L終止液終止反應。10.在自動酶聯檢測儀上選擇490nm測0D，進行分析，結果見表I。結果顯示兔血清效價足夠強，可以用於後續檢測。表I間接Elisa法檢測兔多抗血清效價
OD 11000X [2000X I4000X [8000X I16000X [32000X I64000X 1128000X [256000X I512000X 11024000XCON ~0.085 ). 160 O. 078~ O. 080 O. 079 07083 O. 124 ~0. 107 ' O. 131 O. 103 O. 128兔血清 |l.328 |l.320 |l. 297 |l. 261 |l.239 |l. 121 |l. 061 |θ. 880 |θ. 630 |θ. 405 |θ. 302注0D > O. 2即為陽性
實施例六:Western Blot檢測多克隆抗體的特異性
在HEK293T細胞中轉染pEGFP-N2-DCFl質粒，以轉染pEGFP_N2空載體及不轉質粒的細胞為對照，質粒在細胞中的發光情況見圖6-A，B，C。通過發光情況可以說明細胞中已經表達了內源的DCF1，此時對細胞的總蛋白進行抽提。將製備的蛋白進行SDS-PAGE電泳，電泳結束進行轉膜，轉膜在Bio-Rad半乾轉印槽中進行，首先根據膠的大小剪濾紙和NC膜，剪好後在轉膜液中平衡lOmin。然後準備好半乾轉印槽，按濾紙、NC膜、膠、濾紙的順序放好，為避免氣泡產生，用拿玻璃棒碾幾下。之後開始轉膜，恆壓25V，時間lh。轉完膜後取出膜用PBS洗一下，然後將NC膜置於封閉液中(含1% BSA的PBS)封閉過夜。用封閉液將本發明製備的多抗血清按一定比例稀釋，室溫搖2h，吸出一抗，PBS洗3次，每次5min。用PBS稀釋紅外染料標記的Odyssey 二抗，稀釋比例為1:10000，室溫搖lh，吸出二抗，PBS洗3次，每 次5min。將膜晾乾後,在Odyssey雙色紅外突光掃描系統掃描成像,結果見6_D。WesternBlot結果說明本發明製備的多克隆抗體與在哺乳動物細胞內表達的蛋白進行特異性結合，且效果明顯。實施例七細胞免疫組化對多克隆抗體進行共定位分析
在24孔板上種植的U251細胞中轉染pEGFP-N2-DCFl質粒，以轉染pEGFP_N2空載的細胞作為對照。待螢光顯微鏡下觀察發光後，進行細胞免疫組化實驗，操作如下將種植到24孔板上U251細胞用PBS漂洗三次，用4%多聚甲醛固定15min，2次，吸除固定液，PBS漂洗三次，邊洗邊輕輕振蕩，用5%正常山羊血清37 °C封閉2h，PBS漂洗三次，再加入一抗(本發明製備的多克隆抗體)，4°C下孵育過夜，次日PBS漂洗三次，每次lOmin。然後加入二抗(TRITC-con jugated goat anti-rabbit antibodies),室溫孵育 lh,棄二抗，PBS 漂洗三次，加入DAPI顯色5min，棄掉DAPI，加入200 μ LPBS後，螢光顯微鏡下觀察，結果如圖7。免疫組化結果顯示本發明製備的多克隆抗體可以有效地和細胞內表達的DCFl進行特異性結合，達到共定位的目的。實施例八用本抗體檢測小鼠乳腺癌細胞中DCFl的表達情況
抽提小鼠乳腺癌細胞4Τ1與正常小鼠乳腺組織的總蛋白，按照實施例六的操作進行Western Blot檢測，一抗為本發明製備的多克隆抗體，結果見圖8。說明本發明製備的抗體不僅可以特異性結合外源質粒轉染到哺乳動物細胞中過表達得到的DCF1，而且可以特異性結合哺乳動物本身表達的DCF1，同時更為重要的是發現了 DCFl在小鼠乳腺癌細胞和正常小鼠乳腺組織的蛋白表達差異，這為建立DCFl與癌症的聯繫打下了基礎。實施例九用JNK inhibitor II改變4T1的癌症狀態
在4T1細胞的培養基加入不同量的JNK inhibitor II，使其終濃度分別為O μ Μ、22. 5 μ Μ、45 μ Μ、67· 5 μ Μ,通過CCK-8檢測細胞的增殖情況，結果如圖9所示，在22. 5 μ Μ、45 μ Μ、67. 5 μ M的抑制劑濃度下，抑制劑加入24h後4T1的增殖受到顯著抑制，說明JNK受到抑制後能夠改變4T1的癌細胞狀態，可以進行後續研究。同時看到45 μ M、67. 5 μ M條件下增殖抑制情況差別不大，因此選擇以O μ Μ、22. 5 μ Μ、45 μ M的抑制劑濃度為最終工作濃度。實施例十使用本抗體檢測在4Τ1不同狀態下細胞內DCFl的表達情況
根據實施例九中能改變4Τ1癌症狀態的條件設置，在4Τ1細胞的培養基加入相應濃度的抑制劑，分別以Oh、12h、24h和36h為時間節點提取細胞的總蛋白，進行Western Blot檢測，一抗為本發明製備的多克隆抗體。結果如圖10所示，當抑制劑的終濃度為45 μ M，加入24h後，4Τ1中表達DCFl的水平發生變化。當抑制劑的終濃度為22. 5 μ M時，加入36h後，4T1中DCFl的表達水平發生變化。結果不僅說明本發明製備的抗體可以檢測到4T1內DCFl 的表達隨著4T1癌細胞狀態的改變而發生變化，說明了 DCFl可以用來作為診斷乳腺癌的一個新標準。
權利要求
1.一種鼠源DCFl特異性多克隆抗體，其特徵在於所述的特異性多克隆抗體是將SEQID NO:2的第44位到76位胺基酸殘基組成的多肽特異性結合。
2.根據權利要求I所述的鼠源DCFl特異性多克隆抗體，其特徵在於所述的特異性多克隆抗體是將SEQ ID NO: 2的第44位到76位胺基酸殘基對應的cDNA序列構建到原核表達質粒pGEX-4T-l中，得到重組質粒pGEX-4Tl-59a，再將該重組質粒轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，得到可溶表達帶有鼠源DCFl第44位到76位胺基酸殘基的多肽融和蛋白。
3.根據權利要求2所述的鼠源DCFl特異性多克隆抗體，其特徵在於所述的特異性多克隆抗體是將多肽融和蛋白作為抗原免疫動物而獲得。
4.一種製備根據權利要求I、2或3所述的鼠源DCFl特異性多克隆抗體的方法，其特徵在於該方法的具體步驟為 a.對DCFl胺基酸序列進行了蛋白跨膜結構預測，其中第I到239位胺基酸為胞外段結構； b.用PCR處於胞外段第44到76位胺基酸殘基對應的cDNA，重組入pGEX_4T_l中，構建成 pGEX-4Tl-59a 載體； c.將載體轉化到BL21(DE3)中，原核可溶表達表達得到包含目的DCFl多肽的可溶性融合蛋白； d.將融合蛋白為抗原免疫動物燥，得到以上述製備的蛋白，按照多抗免疫方案進行動物免疫，得到特異性多克隆抗體。
全文摘要
本發明涉及一種鼠源DCF1特異性多克隆抗體及其製備方法。該特異性多克隆抗體是將SEQIDNO:2的第44位到76位胺基酸殘基組成的多肽特異性結合。用該抗體能檢測到小鼠乳腺癌細胞4T1與正常的小鼠乳腺組織中DCF1的表達差異，將4T1的癌細胞狀態通過JNKinhibitorII抑制後，通過製備的多克隆抗體也檢測到了DCF1的蛋白表達減少，說明製備的多克隆抗體可以用來檢測小鼠乳腺癌不同狀態下DCF1的表達水平。
文檔編號C07K16/24GK102702356SQ201210162998
公開日2012年10月3日 申請日期2012年7月18日 優先權日2012年7月18日
發明者文鐵橋, 程華 申請人:上海大學