蘇雲金芽胞桿菌菌株新菌株及其應用的製作方法

2023-05-28 21:39:11

專利名稱：：蘇雲金芽胞桿菌菌株新菌株及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種微生物新菌株及其應用，具體地說是一種蘇雲金芽孢桿菌及其在農業蟲害防治中的應用。
背景技術：
：在人類生產過程中，蟲害是造成農業生產損失及影響人類健康的重要因素，據FAO統計，全世界農業生產每年因蟲害造成的經濟損失高達14%,病害損失達12%，草害損失達11%。損失額高達1260億美元，相當於中國農業總產值的一半，英國的4倍多。另外，蛺媒病在預防醫學中佔有重要位置，其中登革熱和黃熱病等蚊媒病傳播力強、流行面廣、發病率高、危害性大。據WHO統計，全世界每年感染登革熱人數多達8000萬，我國的海南省在1980和1986年曾經暴發過兩次登革熱，發病分別達到437469例和113589例。登革熱和黃熱病主要由埃及伊紋傳播。為了減少這些損失，多年來，對農作物害蟲及蚊蟲普遍採用化學防治手段進行防治，但由於化學農藥的長期、大量使用，造成了對環境的汙染，農副產品中農藥殘留量增加，給人類的生存和健康帶來了危害。此外，化學農藥在殺滅害蟲的同時，也殺傷了天敵及其它有益物，破壞了生態平衡。與化學防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特點。並且避免了化學防治帶來的一系列問題。因此，生物防治技術成了人們研究的熱點。在生物殺蟲劑中，蘇雲金芽孢桿菌是目前世界上用途最廣、產量最大的一類微生物殺蟲劑。蘇雲金芽孢桿菌(Bfl"7/wsf/iMn、g!'eraz's,簡稱Bt)是一種革蘭氏陽性細菌，它的分布極為廣泛，在芽孢形成的同時可形成具有殺蟲活性的由蛋白質組成的伴胞晶體，又名殺蟲晶體蛋白(Insectididalcrystalproteins,簡稱ICPs)，ICPs是由c^基因編碼的，對敏感昆蟲有強烈毒性，而對高等動物和人無毒性。近幾十年來，Bt已廣泛應用於控制多種鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等害蟲。此外，Bt還對膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多種害蟲及植物病原線蟲、蟎類、原生動物有控害作用。目前在農田害蟲、森林害蟲及衛生害蟲的防治中Bt已成為化學合成農藥的有力替代品，Bt還是轉基因抗蟲工程植物重要的基因來源。自1981年Schnepf從菌株HD-lDipel中克隆了第一個能表達殺蟲活性的基因以來(AdangM.J""/，Characterizedflill-lengthandtruncatedplasmidclonesofthe3crystalproteinofBac/〃z^決m"."g7,e"5issubsp.A:z^toh'HD-73andtheirtoxicity.toManducasexta,Gene,1985，36(3):289~300.)，人們已經分離克隆了390多種編碼殺蟲晶體蛋白的基因，根據編碼的胺基酸序列同源性它們被分別確定為不同的群、亞群、類和亞類(CrickmoreN，ZeiglerDR，FeitelsonJ，wa/.Revisionofthenomenclatureforthe5(2"'〃ws//zwWwgz'em^pesticidalcrystalproteins.MicrobiolMolBiolRev,1998,62:807-813;http:〃麗w.biols.susx.ac.uk/Home/Nei1—Crickmore/Bt/)。一般而言，Cryl，Cry2和Cry9等毒蛋白對鱗翅目害蟲有效；其中研究的最多的是Cryl和Cry9類蛋白，它們編碼的殺蟲晶體蛋白分子量為130-140kD,許多基因目前已被廣泛應用於植物的鱗翅目害蟲的防治(Kozie，M.G.，Beland，G.L.，Bowman,C.，Wa/.Fieldperformanceofelitetransgenicmaizeplantsexpressinganinsecticidalproteinderivedfrom5a"7/wsA駅'wg/e服.s.Bio/Technology，1993，11:194-200;Perlak,F丄,Deaton,R.W"Armstrong,T.A.，a/.Insectresistantcottonplants,bio/technology,1990;8:939-943;VanFrankenhuyzen,K.，Gringorten,L.,andGauhier,D.1997.Cry9Caltoxin,aS"c/〃船//2肌'wg/e"^insecticidalcrystalproteinwithhighactivityagainstthesprucebudworm(Choristoneurafiiniferana).Appl.Environ,Microbviol.63:4132-4134;王飛，2001，蘇雲金芽孢桿菌特異菌株生物學特性及CO;9新基因的研究，碩士論文，南開大學)。蘇雲金芽胞桿菌以色列亞種(及決wn力g^ra^subsp.&rae/m^，簡稱Bti)產生的毒素蛋白對蚊蟲具有很好殺蟲活性，被廣泛運用於蚊蟲的防治(GoldbergLJ,andMargalitJ,1977.Abacterialsporedemonstratingrapidlarvicidalactivityagains"w0//2e/asse,ge"/"，t/rawo/ae"/"w"g"/cw/ato,Cw/ex"m'Wta打z^,aegy/"，andCWexpz)/era..MosqitoNews,.37:355-358;)。同時,Cyt蛋白具有溶細胞性，對某些Cry蛋白具有增效作用及延緩昆蟲的抗性(Wu，D.，Johnson,J.J.,andFederici，B.A.1994.SynergismofmosquitocidaltoxicitybetweenCytAandCryIVDProteinsusinginclusionsproducedfromclonedgenesof5"c7'〃mt決"n."g/e"w.義Mol.Microbiol.13:965-972;Wirth,M.C.，Georghiou,G.P"andFedereci，B.A.1997.CytAenablesCryIVendotoxinsof5a"7/"s^z鵬'"gz'em7'51toovercomehighlevelsofCryIVresistanceinthemosquito,Cw/ex，'"《w咖s"'aft/s.Proc.Natl.Acad.Sci.94:10536-10540)自本世紀初發現蘇雲金芽胞桿菌至今己有100多年的歷史，在農作物和園藝植物害蟲、森林害蟲以及衛生害蟲的防治方面得到廣泛的應用，也起到良好的效果。但是，由於大規模和反覆使用蘇雲金芽胞桿菌，許多昆蟲種群己相繼在不同程度上對殺蟲晶體蛋白產生了抗性。以Bt殺蟲晶體蛋白為基礎的殺蟲劑的使用已有50多年的歷史，最初一直沒有檢測到昆蟲對Bt的抗性，但是，上世紀80年中期開始，抗性問題不斷在實驗室及田間試驗中得到證實(McGaughey,W.H.1985.Insectresistancetothebiologicalinsecticide^8fl"7/wAwr/wgz'ew^.Science.229:193-195)，原因主要是持續使用單品種及亞致劑量的Bt以及Bt轉基因抗蟲植物的應用造成昆蟲種群長期受到殺蟲劑的選擇壓力。1985年，McGaughey報導倉庫穀物害蟲印度谷螟(Plodiainterpunctella)在Dipel(Btsubsp.kurstaikHD-1的商品製劑)的選擇壓力下，繁殖15代後，抗性增加97倍；在高劑量選擇壓力下，抗性可增加250倍。19卯年，在夏威夷首次證實大田中的小菜蛾對Bt殺蟲劑產生了明顯的抗性(Tabashnik,B.E.,Finson,N.,Groeters,F.R.,efa/.1994.Reversalofresistanceto5a"7/wsAwrz'"g/e"w;s/w/Vwfe〃aa;_y/oWe〃a.Proc,Natl.Acad.Sci.USA.91:4120-4124),上世紀90年代以來，在我國應用Bt殺蟲劑時間較長的深圳、廣州、上海等地，發現Bt殺蟲劑對小菜蛾防治效果明顯下降，意味著抗性已經形成(馮夏.1996.廣東小菜蛾對蘇雲金桿菌的抗性研究.昆蟲學報,39(3):238-244;Hofte,H.,VanRie,J.,Jansens,S.,VanHoutven,A.，Vanderbruggen,H.,andVaeck,M.，1988.Monoclonalantibodyanalysisandinsecticidalspectrumofthreetypesoflepidopteran-specificinsecticidalcrystalproteinsof5腦'〃ws說wW"gz'e,'s.Appl.Environ.Microbiol.54:2010-2017)。目前發現在實驗室及田間至少有十幾種昆蟲對Bt及其殺蟲晶體蛋白產生了抗性，用選擇壓力數學模型預測到，在Bt轉基因抗蟲植物選擇壓力的條件下，昆蟲將會產生抗性(Schnepf，E.，Crickmore,N.,VanPie,J.,etal.1998.Sczc/腸^2鵬'—e,'sanditspesticidalCrystalproteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev.65(3):775-806)。另外，有研究證明Bti在大田的使用中尚未發現抗性問題(RegisL,wa/.,2000.TheuseofbacteriallarvicidesinmosquitoandblackflycontrolprogramsinBrazil.Mem./組/加oOsw"WoOm,95:207-210.)，但是故蟲對其抗性問題不斷在實驗室中得到證實，這種情況也可能會在大田中出現(GeorghiouGP,andWirthMC,1997.InfluenceofexposuretosingleversusmultipletoxinsofBac飾s^2鵬-"g7'e肌isubsp./5rae/era/sondevelopmentofresistanceinthemosquitoCw/ex《w—z/eybsc/ato(Diptera:Culicidae).^pip/zW朋c/EhWra/wjewto/M〖craZ)/o/ogy,63:1095-1101.)。為避免抗性昆蟲所造成的損失，尋找新的高毒力菌株及基因資源是解決這個問題的有效途徑，這對我國的生物防治也有著十分重要的意義。
發明內容本發明的目的是提供一種對農業生產和衛生安全領域的一些主要害蟲，特別是蔬菜、棉花、玉米、水稻、以及森林等鱗翅目害蟲和傳播登革熱和黃熱病等蚊媒病的雙翅目害蟲具有較高毒力的蘇雲金芽孢桿菌新菌株BtMC28。本發明菌株是四川省沐川原始森林地區土壤中分離得到的蘇雲金芽孢桿菌(5ac7/wAw/wg/^w/s)新菌株，該菌株已於2008年10月21日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區大屯路甲3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為蘇雲金芽孢桿菌(5ac///^AwW"g/e"w:s)，保藏號為CGMCCNo.2719。BtMC28具體通過如下方法篩選獲得釆用醋酸鈉-抗生素分離法，稱取10g土樣(四川省沐川原始森林地區)放入裝有50ml醋酸鈉培養基的搖瓶中，分別加入青黴素鈉鹽和硫酸慶大黴素各400嗎/ml,搖床培養(200r/min，30°C)4h。培養結東後取土壤懸液10ml,加入無菌的離心管3000r/min離心15min，取上層混濁液2ml於65t水洛15min,取熱處理後的混濁液O.lml塗平板，將平板置30°C培養箱中培養；48h後從平板上挑取類似Bt的菌株塗片，發現一株含有球狀晶體形態的Bt菌株，將其命名為BtMC28。經鑑定，關於該菌株的信息包括能形成芽胞，同時能形成球形伴胞晶體(圖1),SDS-PAGE電泳表明，菌株BtMC28主要產生約130，70，28kDa左右大小的3種蛋白(圖2);其晶體蛋白在16小對開始表達，而生長曲線表明其16小時已進入停滯期(圖3),表明該晶體蛋白啟動子可能為依賴芽孢形成的；生物學測定表明，該菌株對甜菜夜蛾殺蟲活性最高，LG。為5.8|ag/mL;對伊蚊的ZC5。為6.02嗎/mL;對棉鈴蟲殺蟲活性最低，ZA。為13.6嗎/mL(表1)。表lBtMC28的殺蟲活性供試昆蟲LC50/(嗎/mL)95%confidence/(|ig/mL)甜菜夜蛾Zap/^gwacx/gr/a5.084.3-5.6棉鈴蟲/fe//cov"aar附/gera13.611.5-17.2伊紋v4ecfe6.024.2-7.8本發明進一步對菌株BtMC28中的C7j和基因進行了鑑定。結果表明，BtMC28中存在co4類、co^類、cr_y53類、類基因。採用基因組DNA純化試劑盒(購自賽百盛公司)提取菌株BtMC28的總DNA;分別設計全長基因引物並以菌株BtMC28總DNA為模板，分別擴增c^30、cr_y53、cry4、cj^的全長基因，結果表明它們的全長分別約為2kb、2.2kb、3.5kb以及800bp(圖4)。分別將純化後的PCR產物與pGEM-T載體連接，轉化，分別挑取有目的片段的陽性克隆，進行測序。將測序結果在GenBank上進行檢索，結果表明所獲的的基因均為新基因。co;M、ct少53、crW、c^2基因的核苷酸序列分別如序列表SEQIDNO所示。現將它們分別命名為crj30i^、coa53jW、c^^CW、qyCAd。通過對BtMC28的毒力測試表明，BtMC28對鱗翅目害蟲、雙翅目害蟲等等，均具有極高的毒力。因而，可以將本發明蘇雲金芽孢桿菌BtMC28製成殺蟲劑，用於農作物害蟲的防治。從而使蘇雲金芽孢桿菌殺蟲劑的產品多樣化和系列化，擴大了蘇雲金芽孢桿菌殺蟲劑的使用範圍。本領域技術人員還可以根據本發明公開的基因，將其轉化棉花、玉米、水稻、蔬菜等農作物，使其具備相應的抗蟲活性。從而降低農藥的使用量，減少環境汙染，具有重要的經濟價值和應用前景。圖1為BtMC28菌株的球形伴孢晶體、芽孢及營養細胞(5000X);圖2為BtMC28菌株SDS-PAGE電泳分析，其中M為蛋白質Marker;圖3為BtMC28菌株的生長曲線；圖4為BtMC28菌株中及基因型的PCR鑑定，其中M為DNAMarker100bp，l為cry30類基因擴增產物，2為trj4類基因擴增產物，3為c/j53類基因擴增產物，4為c^2類基因擴增產物；圖5菌株BtMC28中ct73(9，crj53，c/j^和全長基因的PCR擴增產物，其中M為DNA分子量標準，1為ciy4的PCR產物，2為ciy53的PCR產物，3為cyt2的PCR產物，4為ctjM的PCR產物。具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1含有多種c/j基因的蘇雲金芽孢桿菌的篩選與鑑定土壤採自四川省成都溫江地區。採用醋酸鈉-抗生素分離法，稱取10g土樣放入裝有50ml醋酸鈉培養基的搖瓶中，分別加入青黴素鈉鹽和硫酸慶大黴素各400嗎/ml，搖床培養(200r/min，30°C)4h。培養結束後取土壤懸液10ml,加入無菌的離心管3000r/min離心15min,取上層混濁液2ml於65。C水洛15min,取熱處理後的混濁液O.lml塗平板，將平板置30。C培養箱中培養。48h後從平板上挑取類似Bt的菌株塗片。發現一株含有球狀晶體形態的Bt菌株(見附圖1)。經用光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察，該菌株細胞呈杆狀，兩端鈍圓，菌株大小為0.9-1.1(imX2.7-4.0|im，通常單個、或兩個、或短鏈細胞存在，一個營養細胞為一個孢子囊，每個孢子囊內含有一個芽孢，次端生，另一端有一個伴孢晶體，孢子囊不膨大。實施例2菌株BtMC28中c/j和基因的鑑定根據C/T4類基因保守序列設計1對特異引物5-GTGTCAAGAGAACCAACAGTATG-35-ACTAAGTCTCCTCCTGTATGACCAG-3根據c77^類基因保守序列設計1對特異引物5-AAGATTGGCTCAATATGTGTC-35-GATTATCAGGATCTACACTAG-3根據crj;53類基因設計一對通用引物5-AATAAAAATGAATATGAAATATT-35-TTTCACAGCCGGAATTTGTGTAAT-3根據wG類基因設計一對通用引物5-ATTACAAATTGCAAATGGTATTCC-35-TTTCAACATCCACAGTAATTTCAAATGC-3用下列PCR反應體系鑑定10xbuffer2.5^1MgCl2(25mM)1.5^1Taq酶0.2^1dNTPs(2.5mM)2(J引物2|al模板最終反應體積25^1熱循環反應94'C預變性5min;94。C變性lmin，退火溫度根據引物而定，72。C延伸2min，30個循環；72'C延伸5min;4'C停止反應。擴增反應產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，置凝膠成像系統中觀察PCR擴增結果。結果如圖4所示，利用上述引物分別對模板進行擴增，分別得到了目標擴增產物，表明BtMC28中cry和c少？基因。實施例3c/^J^FVi，crj;53^A，c/j^Cc和基因的克隆採用基因組DNA純化試劑盒(購自賽百盛公司)提取菌株BtMC28的總DNA;設計其全長基因引物P1、P2、P3、P4、P5,P6，P7和P8(引物序列如下)；以菌株BtMC28總DNA為模板分別用所述引物進行PCR擴增，反應體系和反應程序同實施例2;用Pl和P2擴增co^0類全長基因，得到長約2kb的片段；用P3和P4擴增cry53類全長基因，得到長約2.2kb的片斷；用引物P5和P6擴增cr^類全長基因，得到長約3.5kb的片段；用引物P7和P8擴增cyt2類全長基因，得到長約800bp的片段(見附圖5)。將純化後的PCR產物與pGEM-T載體連接，轉化，分別挑取含有有目的片段的陽性克隆，測序，分別得到序列SEQIDNo.17、SEQIDNo.19、SEQIDNo.21、SEQIDNo.23和SEQIDNo.25。Pl:5'ATGAAGCCGTATCAAAGTG3'P2:5'GTTCACTGGACAAGCAAATGC3，P3:5，ATGAATTCATATCAAAATAAAAATG3，P4:5，TTATTCGACAAATAAACTATTTACA3'P5:5，ATGAATTCATATCAAAATAAAAATG3'P6:5，TTACCCTTTCATACAAAGAAACTCG3'P7:5，ATGTATACTAAAAATTTTA3，P8:5，TCAATTCGATAAATTTAAA3'1、co^OFb基因的序列分析序列SEQIDNo.19的全長為2064bp，分析表明，GC含量為33.87%，編碼687個胺基酸組成的蛋白。經測定，其胺基酸序列如SEQIDNo.24所示7^Rb^網站採用bacterialsigma7.0promoter程序對全序列進行預測表明，在基因編碼區上遊含有RNA聚合酶活化位點的序列，將其命名為co^0F"/。本發明進一步分析了Ciy30Fal蛋白的胺基酸組成(見表2)。表2Cry30Fal蛋白的胺基酸組成tableseeoriginaldocumentpage92、co;5W6基因的序列分析序列SEQIDNo.25的全長為2111bp,分析表明，GC含量為36.9%，編碼703個胺基酸組成的蛋白。經測定，其胺基酸序列如SEQIDNo.26所示。在softberry網站採用bacterialsigma7.0promoter程序對全序列進行預測表明，在基因編碼區上遊含有RNA聚合酶活化位點的序列，將其命名為coJWW。本發明進一步分析了Cry53Abl蛋白的胺基酸組成(見表3)。表3Cry53Abl蛋白的胺基酸組成tableseeoriginaldocumentpage103、co^Cc基因的序列分析序列SEQIDNo.27的全長為3474bp，分析表明，GC含量為35.72%，編碼1157個胺基酸組成的蛋白。經測定，其胺基酸序列如SEQIDNo.28所示。在softberry網站採用bacterialsigma7.0promoter程序對全序列進行預測表明，在基因編碼區上遊含有RNA聚合酶活化位點的序列，將其命名為co;4C"。本發明進一步分析了Cry4Ccl蛋白的胺基酸組成(見表4)。表4Cry4Ccl蛋白的胺基酸組成tableseeoriginaldocumentpage10序列SEQIDNo.29的全長為780bp,分析表明，GC含量為27.95%，編碼259個胺基酸組成的蛋白。經測定，其胺基酸序列如SEQIDNo.30所示。在softberry網站採用bacterialsigma7.0promoter程序對全序列進行預測表明，在基因編碼區上遊含有RNA聚合酶活化位點的序列該基因序列與已報導的c^Z4"7序列同源性皆高達99%,彼此之間僅存在著少數幾個核苷酸以及編碼胺基酸的差別，將其命名為qv^Ad。本發明進一步分析了Cyt2Aa3蛋白的胺基酸組成(見表6)。表6Cyt2Aa3蛋白的胺基酸組成tableseeoriginaldocumentpage11實施例4菌株BtMC28的活性檢測對鱗翅目害蟲將菌株BtMC28在液體LB培養基中30°C，200r/min振蕩培養30h;離心收集菌體(12,000r/min,15min，4°C),超淨工作檯風乾，計量菌體重量；然後把菌株懸浮於蒸餾水中，配製成從l嗎/ml到100ng/ml6個不同濃度；選老嫩適中的巻心菜葉片洗淨，晾乾；紫外燈下照射15min，剪成2x2cn^大小，分放在不同濃度菌液中，浸泡5min;取出新去多餘的液體，放在消毒的培養皿中晾乾，以LB浸泡葉片作為對照，每個培養皿放4片葉片；選放健康的2-3齡棉鈴蟲，甜菜夜蛾30頭；每處理重複3次，置室內，於3d後調查幼蟲死亡情況，用SPSS10.0軟體計算LC5Q;結果如表l，表明菌株對這兩類害蟲具有極高的毒殺活性。對雙翅目害蟲將菌株BtMC28在液體LB培養基中30°C，200r/min振蕩培養30h;離心收集菌體(12,000r/min,15min,4°C)，超淨工作檯風乾，計量菌體重量；然後把菌株懸浮於蒸餾水中，配製成從l嗎/ml到100ng/ml6個不同濃度；選放健康的4齡蟻蚊30頭於1L含不同菌體濃度懸浮液中；每處理重複3次，置28。C培養箱內，於2d後調查幼蟲死亡情況，用SPSS10.0軟體計算LC5;結果如表l，表明菌株對妖蚊具極高的毒殺活性。序列表說明SEQIDNo.l&2、SEQIDNo.3&4、SEQIDNo.5&6、SEQIDNo.7&8、分別是用於擴增類、a73O類、c77W類qy〃類基因保守序列的特異性引物；SEQIDNo.9&10、SEQIDNo.ll&12、SEQIDNo.l3&14、SEQIDNo.l5&16分別是引物對pl&p2、p3&p4、p5&p6、p7&p8，分別用於擴增co^OPa7,c^y5j爿W,co^/C"和t;y/Z4a3基因的特異性引物；SEQIDNo.17&18、SEQIDNo.l9&20、SEQIDNo.21&22、SEQIDNo.23&24分別是co/30P"7,co^_L4W,c^^Cc7和qy/Z4o基因的核苷酸序列及其編碼的胺基酸序列。序列表<110〉四川農業大學中國農業科學院植物保護研究所蘇雲金芽胞桿菌菌株新菌株及其應用KHP09112130.724Patentlnversion3.5<210〉1<211〉23DNA<213〉人工序列<400〉1gtgtcaagagaaccaacagtatg232<211〉25DNA人工序列<400〉2actaagtctcctcctgtatgaccag25<210〉3<211〉21DNA<213〉人工序列<柳〉3aagaUggctcaatatgtgtc21<210〉4<211〉21<212〉DNA<213〉人工序列<400〉4gattatcaggatctacactag215<211〉23<212〉DNA<213〉人工序列5aataaaaatgaatatgaaatatt23<210〉6<211〉24<212〉DNA<213〉人工序列<400〉6tttcacagccggaatttgtgtaat24<210〉7說<211〉24<212〉腿人工序列〈400〉7aLLacaaattgcaaatggtattcc24828腿〈213〉人工序列8tttcaacatccacagtaatttcaaatgc28919DNA人工序列93tgaagccgtstcaaagtg19<210〉10<211〉21麗<213〉人工序列<400〉10gttcactggacaagcaaatgc211125<212〉謹<2丄3〉人工序列<400〉11atgaattcatatcaaaataaaaatg2512<211〉25<212〉DNA<213〉人工序列<400〉12ttattcgacaaat肪3Ctattt8ca25<210〉13<211〉25<212〉薩<213〉人工序列<400〉13algaattcaLtitcaaaataaaaatg25<210〉14<211〉25<212〉DNAformulaseeoriginaldocumentpage15c犯gctggtaccaatgtaaaac3ggtagctctactggagcttccagacgt1740gcatgcgttatgctgc犯ataatgcatttacsgtgagtctatcatatact1800tt織gggtggtaatacaataggtacaacatttattaccgaacgtacattttcaagacct1860aataats_taataccaacggatttaaaatacg3gg兆ttt3stataatcaa1920attattacagtgacttcacctcaaaataca3tagtaactatagctattcg1980cc:gatccc肌tttatccagtggatcaagat2040gcatttgcttgtccagtgeieict犯2064〈210〉18<211〉687<212〉PRT<213〉蘇雲金芽胞桿菌菌株(Bacillus18MetLysProTyrGinSerGluAsnGlu15ProLysTyrSerAsnAsnAsnAsnMet50SerLys65AlaMetSerThrLysGluArgAsp130AlsLeu145AspLysGlyValAsnProAsnlie210TrpAla225GinlieTyrCysProAsnLeuGly290TyrPro35CysLeuProliePhe115AlaLysAspValAla195AspLysPheAlalie275AlaSer20GinGinValGlylie100ThrlieAspArgAsn180AsnLeuAlaTyrGlu260GinLeuValThrAlaPro85ProLysGluHisThr165GlyGinlielieAsp245ThrTrpAsplieProlieThr70GlylieGinlieMet150GinLysProLeuAsn230SerTyrAspLeuValCeuThr55AlaSerLeuGlylie135AsnThrlieAlaTyr215AspteuArglieVal295AsnGin40ProlieAlaTrpLeu120GlyAspAsnliePhe200GinSerLysAsnTyr280AlaVal25AsnLeuGlyValPro105GinAsnPheAlaAsp185LeuArgSerAlaSer265AsnLeuthuringiensis)BtMC28GlulieLeuAspArgTyrTyrTyr10TyrThrCyslieGly90AsnLeuAspGluThr170LeuAsnGlylieLys250LeuArgPheSerSerThrLeu75LeuAspPheValThr155TyrLysLeuAlaSer235lieThrTyrProPro60GlyPheAsnArgGin140LysLeuAsnTyrVal220ProLyslieArgAsn300Lys45lieAlaLeuThrPro125SerPhelieGinAla205TyrPheGluLeuArg285TyrPro30AspThrLeu15LeuAlaAsplieLysPro110GluGlyGluThrPhe190GinGlyAsnTyrLys270GluAspTrpLeulieAspPheLys80ThrPhe95lieTrpLeuGlyPheAsnlieTrp160AlsPhe175LeulieThrAlaAspAspSerSer240ThrAsn255AsnGinAlaThrI]eCys16GluLeuSerThr385lieSerAspGinMet465GinGlyValAlaPro545GinAlaPheThrPro625lieArgGluTyrSerAsnAsnSer370lieProGinMetThr450AsnThrGlyAspVal530GlyAlaSerThrThr610ThrlieGinPheProPheGinLeu355LeuLeulieTyrThr435TyrGlyAsnValLeu515LysHisGlyArgVal595PheAspThrLeuTyr675lieTyrLeu340TyrSerProlieArg420PheGinProHisTyr500AspAlaThrLysArg580SerlieLeuValAsn660ProSerThrLys310LeuGinAla325ThrHisProThrlieGlyLeuAsnPro390GlyLeu405HisProTyrLysAlaGlyGinAsn470lieLeu485AspPheAsnLeuAsnPheGlyGly550MetGin565TyrGlyLeuSerThrGluLysTyr630ThrSer645ProlieValAspArgGin375ProAsnAsnSerArg455AlaSerGlyTieLeu535AsplielieTyrArg615GluProProGinThrLeuProGlu360AlaAlaAsnAspAsp440AsnSerAspTyrVal520SerLeuGinArgThr600ThrGluGinAsnAsp680GluGinSer345AsnLysGinLeuCys425TyrSerSer丄leSer505ProSerValCysMet585LeuPhePheAsnAsp665AlaLeuThr315HisSer330LeuPhePheAsnTyrArgGlylie395Phelie410ValProAsnGlyAsnAsnSerAsn475LysMet490PheAlaAsnArgProAlaAlaLeu555LysThr570ArgTyrGinGlySerArgLysTyr635Thrlie650GinLeuPheAlaArgAsnThrProTyr380ThrTyrlieAsnVal460AsnAsnTrplieArg540LeuGlyAlaGlyPro620LysVallieCysLyslieTrpAla365ThrAsnI>ysAlaAla445lielieTyrThrThr525ValAsnSerAlaAsn605AsnGluThrliePro685ValGluLeu350LeuGinGlyLeuGly430SerAspSerAlaHis510GinlieGlySerAsn590ThrAsnTyrlieAsp670ValTyrThr335AsnGinAsnThrSer415lieAlaThrlieArg495ThrlieAlaGlyThr575AsnlielieAsnAla655ArgAsnMet320LeuGluValSerPro400MetSerThrPheAsn480SerSerProGlyThr560GlyAlaGlylieGin640lielie192111腿17<213〉蘇雲金芽胞桿菌菌株(Bacillusthuringiensis)BtMC28〈400〉19atgaattcatatcaaaataaaaatgaatatgaaatattggatgcttcacaaaacaactct60aatatgtctaatcgttatccaaggtatccattagcaaatgatccaca.a.gcttctatgcag120aatacgaattataaagattggttggctacgtgcaacggaacgcctgccccgctttataat180tcttcacaactacttaaaatttcaggaaatgtagtttctagggctctcggaatgcttccc240attcctgggattgctcctcttttaagttttctctctactttgctttggcc朋gtggatca300tccggaaatactatttgggaatcgttgatgaaagaagctgcggatttgatagaccaaaag360ttagaggagaatatattacgccaagcaacggccaatttagccggattacaaggactattg420ggatcatataacagcgcttttgcttcatggg犯gcaggcggcaatgcaactcctgatctg480gtaaa鄉ttatatggagagccttcatcgtacgtttgtgcaggatattataggcagcttc540acgataccaggttatga犯aaatattattacctacctatgcgattaccgccaattttcat600ttgatgttattacgtgacattgaaatttatggaggtaaaaaaaccccagaaggtaaagat660ggcctgaattttgatccaaaagacctaaatttttataattgtgaactaaagaaatataag720gaa"gLaLacgaatcattgcttaaatacttac朋taaaggtttggcctcagaaaaagaa7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