一種篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的複合物及其應用方法
2023-06-14 08:34:31
一種篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的複合物及其應用方法
【專利摘要】本發明公開了一種篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的複合物及其應用方法。利用受體-配體親和反應原理，將中草藥樣品與黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子混合孵育，使中草藥樣品中活性成分的混合物與黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子混合，得到活性成分與酶負載的磁性納米粒子複合物。通過外界磁場作用進行磁分離，將複合物採用甲醇-水的混合溶液脫附，收集脫附液，運用液相色譜-質譜聯用技術對得到的活性成分進行分離和鑑定。該方法避免了傳統篩選方法篩選時間較長且有機溶劑消耗大的問題，其操作簡便、迅速、酶負載的磁性納米粒子複合物可重複使用，適於快速篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑，為尋找高活性的新型抗痛風藥物奠定基礎。
【專利說明】一種篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的複合物及其應用方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於中藥成分篩選領域，涉及一種篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的複合物及其應用方法。【背景技術】
[0002]痛風是由於嘌呤代謝紊亂導致血尿酸水平增高，或尿酸排洩減少而導致尿酸鹽在組織沉積的疾病，為臨床難治性疾病之一。其臨床特點是高尿酸血症，尿酸鹽沉積所導致反覆發作的急、慢性關節炎和軟組織損傷，尿酸性腎結石所致的痛風性腎病。痛風是一種非常古老的疾病，七千多年前出土的埃及木乃尹上就已發現尿酸鹽性腎結石。並且隨著現代經濟發展，人們生活水平的提高以及生活方式的改變，蛋白類食品成倍增加，痛風及高尿酸血症的患病率在全球範圍內呈上升趨勢。我國痛風發病形勢尤其嚴峻，以增長速度快、患者絕對數量龐大為特點，己有趨勢成為擁有世界上最多痛風病患者的國家。
[0003]高尿酸血症是痛風的生化標誌。尿酸的產生與排出之間的平衡關係決定了尿酸在細胞外液的濃度。尿酸生成量超過其排洩，就會產生尿酸累積，進而出現血尿酸增高。在人體內尿酸的生成過程中黃嘌呤氧化酶起著非常重要的作用。通過抑制黃嘌呤氧化酶的活性，可降低體內的尿酸生成量，從而緩解高尿酸血症而減少痛風的發生。並且，黃嘌呤氧化酶在催化反應過程中，還會產生大量的自由基，對人體造成更廣泛的損害。為了減少人體內尿酸及自由基的形成，可通過抑制劑對黃嘌呤氧化酶的活力進行抑制來實現。目前在臨床上使用的黃嘌呤氧化酶抑制劑只有別嘌醇，但是別嘌醇具有很多的毒副作用。因此發現和尋找新的黃嘌呤氧化酶抑制劑具有十分重要的意義。
[0004]傳統的從中草藥或天然藥物中篩選活性成分，往往首先通過柱層析、萃取、製備色譜等各種分離手段對複雜體系的化學成分進行系統分離與結構鑑定，再對得到的單體成分進行活性測試，最終尋找到活性成分。但這種方法在操作過程中存在操作繁瑣、工作量大、周期長、目標不明確、活性成分在分離過程中易丟失等不足，且大量的時間與精力花費在已知物質的分離鑑定上。隨著對中草藥的研究越發深入，對微量活性成分分析需求的增加，如何從中草藥等複雜體系中快速、高效地篩選出活性成分，成為現代藥物研究的重要課題之一。
[0005]四氧化三鐵磁性納米粒子不僅具有磁性材料的磁分離效應，還具備納米材料的量子尺寸效應、小尺寸效應和表面效應等性質，廣泛應用於冶金、磁學和生物學等領域。磁性納米粒子具有超順磁性，易在外加磁場作用下從反應體系中分離和回收，被廣泛用作製備固定化酶的載體材料。相比於游離酶在分離和重複使用上的不足，磁性材料固定化酶具有快速與反應物分離、較長時間內重複使用、提高酶的穩定性、提高酶的使用效率、降低成本等優點。本發明利用四氧化三鐵磁性納米粒子的特點，將其用黃嘌呤氧化酶修飾，製備篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的複合物，取得了很好的效果。
【發明內容】
:[0006]本發明的目的是基於現有中草藥中黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選步驟較為繁瑣，時間較長且耗費有機溶劑的問題，提供一種用於篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的複合物及其應用方法。本發明以黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子為篩選載體，利用受體-配體親和反應原理，從中草藥樣品中篩選到與受體黃嘌呤氧化酶結合的配體，再經過脫附、高效液相色譜-質譜聯用技術檢測，能夠實現快速篩選鑑定中草藥中的黃嘌呤氧化酶抑制齊?。該複合物製備過程簡單、安全無毒、成本低廉，可重複使用。用於篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的方法過程簡單、安全可靠、能高效快速的篩選出黃嘌呤氧化酶抑制劑，並能夠為尋找新型抗痛風藥物奠定基礎。
[0007]為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案:
[0008]一種篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的複合物，是通過戊二醛作為交聯劑，將黃嘌呤氧化酶固定在氨基化的四氧化三鐵納米粒子表面，得到的黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子。
[0009]所述的氨基化是將四氧化三鐵納米粒子分散在乙醇溶液中，通過3-氨丙基三乙氧基矽烷進行表面氣基化處理。
[0010]上述複合物具體是將粒徑在30~220nm的四氧化三鐵納米粒子分散在乙醇溶液中形成濃度為0.l-2mg/mL的四氧化三鐵納米粒子分散液，取50_200mL分散液，並向溶液中逐滴滴加0.4-8mL3-氨丙基三乙氧基矽烷；室溫下攪拌4_8小時後過濾用乙醇溶液洗滌三次，置於50°C真空乾燥箱中乾燥； l_10mg氨基化的四氧化三鐵納米粒子分散在1-1OmL的5wt%的戊二醛溶液中並攪拌0.5-2小時，反應後通過磁分離去除上清溶液，將l_4mL濃度為180 μ g/mL的黃嘌呤氧化酶的pH值為7的IOmM的磷酸鹽緩衝液溶液，加入到磁性納米粒子中振蕩反應0.5-4小時；得到的黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子用磷酸鹽緩衝液洗滌後待用。
[0011]所述的篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的複合物的應用方法，
[0012]將黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子與中草藥提取液孵育，再通過外界磁場進行磁分離得到活性成分與黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子複合物，將複合物採用甲醇-水的混合溶液脫附，收集脫附液，運用液相色譜-質譜聯用技術對得到的活性成分進行分離和鑑定，得到黃嘌呤氧化酶抑制劑。
[0013]所述孵育是將10_40mg黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子複合物加入到l-4mL中草藥提取液中，在25°C下振蕩0.5-3小時，之後磁分離收集磁性納米粒子，並用磷酸鹽緩衝液洗滌後，加入l-4mL80%的甲醇溶液並振蕩1-1Omin脫附已結合的活性成分。
[0014]中藥提取液的製備:將原料按照固液質量比為1:10的比例，用95%的乙醇溶液在85°C回流提取3小時，減壓蒸餾至95%的乙醇溶劑全部蒸除得到浸膏；將上述浸膏按照固液質量比為1:100的比例用二次蒸餾水溶解，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；分別通過減壓蒸餾蒸除其中的有機溶劑，得到幹膏狀石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位樣品；將各部位樣品按照固液 質量比為1:100用100%甲醇溶液溶解，分別過0.45 μ m濾膜備用。
[0015]所述的中藥提取液選自葛花提取物或甘草提取物。
[0016]在從中草藥樣品葛花提取液中篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑時，高效液相色譜的檢測條件為:
[0017]色譜柱:ffatersSunFire? C18色譜柱規格為 250mmX4.6mm 1.d., 5 μ m ;流動相:A相:含0.4%醋酸的水，B相:含0.4%醋酸的乙腈；梯度洗脫程序:t=0?12min，25%B相+75%A相；t = 12 ?15min，25 ?30%B 相 +75 ?70%A 相；t = 15 ?30min，30 ?38%B 相 +70 ?62%A 相；t = 30 ?33min，38 ?75%B 相 +62 ?25%A 相；流速:0.8mL/min ;柱溫:25°C;進樣量:20 μ L ;
[0018]在從中草藥樣品甘草提取液中篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑時，高效液相色譜的檢測條件為:
[0019]色譜柱:WatersSunFire? C18 色譜柱規格為 250mmX4.6mm 1.d., 5 μ m ;流動相:A相:含0.4%醋酸的水，B相:含0.4%醋酸的乙腈；梯度洗脫程序:t=0?lOmin，25%B相+75%A 相；t = 10 ?20min，25 ?30%B 相 +75 ?70%A 相；t = 20 ?35min，30 ?50%B 相+70 ?50%A 相；t = 35 ?45min, 50%B 相 +50%A 相；t = 45 ?60min, 50 ?80%B 相 +50 ?20%A 相；流速:0.8mL/min ;柱溫:25°C ;進樣量:20 μ L。
[0020]所述的篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的複合物還可以用於製備篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的製劑。
[0021]本發明的中草藥樣品可以包含天然產物提取物或中藥複方提取物。
[0022]作為優選，孵育條件為在25°C下孵育I小時。
[0023]作為優選，脫附條件為在25°C下反應lmin。
[0024]作為優選，本發明中孵育和脫附時振蕩的條件為50?200轉/min。
[0025]進一步優選的孵育和脫附時振蕩的條件為100轉/min。
[0026]作為優選，活性成分與黃嘌呤氧化酶負載的磁性納米粒子複合物在孵育後用pH值為7的IOmM的磷酸鹽緩衝液清洗。
[0027]進一步優選，孵育後，活性成分與黃嘌呤氧化酶負載的磁性納米粒子複合物用pH值為7的IOmM的磷酸鹽緩衝液清洗三次，每次用2mL的IOmM的磷酸鹽緩衝液洗去表面非特異性吸附的小分子物質。
[0028]從中草藥樣品葛花提取物中篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑時，質譜的檢測條件為:
[0029]採用負離子電離模式，流速為0.2mL/min，掃描範圍:m/zl00-1200，實驗前質量數均經過校正。噴霧電壓為3.5kV，金屬加熱毛細管溫度350°C，金屬毛細管電壓5V，殼氣流速為300mL/min,輔助氣流速為50mL/min。
[0030]從中草藥樣品甘草提取物中篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑時，質譜的檢測條件可以為:
[0031]電噴霧負離子模式，流速為0.2mL/min,噴霧電壓4.0kV,金屬毛細管電壓5V，金屬毛細管加熱溫度350°C，殼氣流速為300mL/min，輔助氣流速為50mL/min，掃描範圍m/zlOO ?1000。
[0032]本發明的優點在於:
[0033]I)本發明首次製備出黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子的複合物用於篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑；該複合物製備過程簡單、安全無毒、成本低廉，可重複使用；
[0034]2)本發明打破黃嘌呤氧化酶抑制劑篩選【技術領域】的常規思路，首次以黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子為篩選載體，利用受體-配體親和反應原理，從中草藥樣品中篩選到與受體黃嘌呤氧化酶結合的配體，再經過脫附、高效液相色譜-質譜聯用技術檢測，能夠實現快速篩選鑑定中草藥中的黃嘌呤氧化酶抑制劑。該方法過程簡單、安全可靠、能高效快速的篩選出黃嘌呤氧化酶抑制劑，並能夠為尋找新型抗痛風藥物奠定基礎。克服了傳統篩選方法步驟繁瑣、耗時長，有機溶劑耗量大，且工作量大等問題；
[0035]3 )此外，本發明用於篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的複合物還可以通過進一步研究用於製備出其他多樣化的用於篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的製劑產品，為推廣使用奠定基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0036]圖1為實施例1中葛花提取物的高效液相色譜圖；其中，峰I為鳶尾苷，峰2為葛根素，峰3為大豆苷，峰4為3』 -甲氧基大豆苷，峰5為鳶尾黃素；
[0037]圖2為實施例1中葛花提取物與黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子孵育、脫附後的脫附液的高效液相色譜圖；其中，峰I為鳶尾苷，峰2為葛根素，峰3為大豆苷，峰4為3』 -甲氧基大豆苷，峰5為鳶尾黃素；
[0038]圖3為實施例2中甘草提取物的高效液相色譜圖；其中，峰I為異甘草苷，峰2為甘草素，峰3為甘草皂苷G2，峰4為二氫7-羥基-3- (4-羥苯基)-4-苯並吡喃酮，峰5為甘草酸，峰6為甘草香豆素；
[0039]圖4為實施例2中甘草提取物與黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子孵育、脫附後的脫附液的高效液相色譜圖；其中，峰I為異甘草苷，峰2為甘草素，峰3為甘草阜苷G2,峰4為二氫7-輕基-3-(4-輕苯基)-4-苯並批喃酮,峰5為甘草酸,峰6為甘草香豆素。
【具體實施方式】:
[0040]以下結合實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。
[0041]實施例1:
[0042]IOOmg粒徑在30?220nm的四氧化三鐵納米粒子分散在200mL乙醇溶液中，向溶液中逐滴滴加2mL3-氨丙基三乙氧基矽烷。室溫下攪拌6小時後用乙醇溶液洗滌三次，至於50°C真空乾燥箱中乾燥。2mg氨基化的四氧化三鐵納米粒子分散在2mL的戊二醛溶液中(5%w/v)並攪拌I小時，反應後將磁分離得到的磁性納米粒子加入到4mL的黃嘌呤氧化酶溶液中(濃度為180 μ g/mL,並採用pH值為7的IOmM的磷酸鹽緩衝液配製)振蕩反應2小時。得到黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子用磷酸鹽緩衝液洗滌後待用。
[0043]將20mg黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子加入到2mL葛花提取液中，在25°C下振蕩I小時。磁分離收集磁性納米粒子，並用磷酸鹽緩衝液洗滌三遍後，加入2mL80%的甲醇溶液並振蕩5min脫附已結合的活性成分，將脫附液收集並進行高效液相色譜_質譜分析。
[0044]葛花中藥提取液的製備:將原料按照固液質量比為1:10的比例，用95%的乙醇溶液在85°C回流提取3小時，減壓蒸餾至95%的乙醇溶劑全部蒸除得到浸膏；將上述浸膏按照固液質量比為1:100的比例用二次蒸餾水溶解，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；分別通過減壓蒸餾蒸除其中的有機溶劑，得到幹膏狀石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位樣品；將乙酸乙酯部位樣品按照固液質量比為1:100用100%甲醇溶液溶解，過0.45 μ m濾膜備用。
[0045]用Dionex UltiMate3000型高效液相色譜儀進行高效液相色譜檢測,條件如下:
[0046]色譜柱:ffatersSunFire? C18色譜柱(250mmX4.6mm 1.d., 5 μ m);流動相:水(含
0.4%醋酸，A)和乙腈(含0.4%醋酸，B);梯度洗脫程序:t=0min,25%B(75%A) ;t=0~12min,25%B (75%A) ;t = 12 ~15min，25 ~30%B(75 ~70%A) ;t = 15 ~30min，30 ~38%B(70 ~62%A) ;t = 3O ~33min，38 ~75%B(62 ~25%A);流速:0.8mL/min ;柱溫:25°C ;進樣量:20 μ L。
[0047]質譜條件如下:
[0048]A Finnigan LCQdeca plus離子肼質譜儀,採用負離子電離模式,流速為0.2mL/min,掃描範圍:m/zl00-1200，實驗前質量數均經過校正。噴霧電壓為3.5kV，金屬加熱毛細管溫度350°C，金屬毛細管電壓5V，殼氣流速為300mL/min，輔助氣流速為50mL/min。
[0049]葛花提取物乙酸乙酯部位樣品中黃嘌呤氧化酶抑制劑質譜鑑定信息見表1。
[0050]表1葛花提取物乙酸乙酯部位樣品中黃嘌呤氧化酶抑制劑質譜鑑定
[0051]
【權利要求】
1.一種篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的複合物，其特徵在於，是通過戊二醛作為交聯劑，將黃嘌呤氧化酶固定在氨基化的四氧化三鐵納米粒子表面，得到的黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子。
2.根據權利要求1所述的篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的複合物，其特徵在於， 將四氧化三鐵納米粒子分散在乙醇溶液中，通過3-氨丙基三乙氧基矽烷進行表面氨基化處理。
3.根據權利要求2所述的篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的複合物，其特徵在於， 將粒徑在30~220nm的四氧化三鐵納米粒子分散在乙醇溶液中形成濃度為0.l_2mg/mL的四氧化三鐵納米粒子分散液，取50-200mL分散液，並向溶液中逐滴滴加0.4_8mL3-氨丙基三乙氧基矽烷；室溫下攪拌4-8小時後過濾用乙醇溶液洗滌三次，置於50°C真空乾燥箱中乾燥；1-1Omg氨基化的四氧化三鐵納米粒子分散在1-1OmL的5wt%的戊二醛溶液中並攪拌0.5-2小時，反應後通過磁分離去除上清溶液，將l_4mL濃度為180 μ g/mL的黃嘌呤氧化酶的pH值為7的IOmM的磷酸鹽緩衝液溶液，加入到磁性納米粒子中振蕩反應0.5-4小時；得到的黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子用磷酸鹽緩衝液洗滌後待用。
4.權利要求1-3任一項所述的篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的複合物的應用方法，其特徵在於， 將黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子與中草藥提取液孵育，再通過外界磁場進行磁分離得到活性成分與黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子複合物，將複合物採用甲醇-水的混合溶液脫附，收集脫附液，運用液相色譜-質譜聯用技術對得到的活性成分進行分離和鑑定，得到黃嘌呤氧化酶抑制劑。
5.根據權利要求4所述的應用方法，其特徵在於，所述孵育是將10-40mg黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子複合物加入到l_4mL中草藥提取液中，在25°C下振蕩0.5-3小時，之後磁分離收集磁性納米粒子，並用磷酸鹽緩衝液洗滌後，加入l-4mL80%的甲醇溶液並振蕩1-1Omin脫附已結合的活性成分。
6.根據權利要求5所述的應用方法，其特徵在於， 中藥提取液的製備:將原料按照固液質量比為1:10的比例，用95%的乙醇溶液在85°C回流提取3小時，減壓蒸餾至95%的乙醇溶劑全部蒸除得到浸膏；將上述浸膏按照固液質量比為1:100的比例用二次蒸餾水溶解，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；分別通過減壓蒸餾蒸除其中的有機溶劑，得到幹膏狀石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位樣品；將各部位樣品按照固液質量比為1:100用100%甲醇溶液溶解，分別過0.45μπι濾膜備用。
7.根據權利要求6所述的應用方法，其特徵在於，中藥提取液選自葛花提取物或甘草提取物。
8.根據權利要求7所述的應用方法，其特徵在於， 在從中草藥樣品葛花提取液中篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑時，高效液相色譜的檢測條件為: 色譜柱:Waters SunFire? C18 色譜柱規格為 250mmX4.6mm 1.d., 5 μ m ;流動相:A 相:含0.4%醋酸的水，B相:含0.4%醋酸的乙腈；梯度洗脫程序:t=0~12min，25%B相+75%A相；t = 12 ~15min，25 ~30%B 相 +75 ~70%A 相；t = 15 ~30min，30 ~38%B 相 +70 ~62%A 相；t = 30 ~33min，38 ~75%B 相 +62 ~25%A 相；流速:0.8mL/min ;柱溫:25°C;進樣量:20 μ L ; 在從中草藥樣品甘草提取液中篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑時，高效液相色譜的檢測條件為: 色譜柱:Waters SunFire? C18 色譜柱規格為 250mmX4.6mm 1.d., 5 μ m ;流動相:A 相:含0.4%醋酸的水，B相:含 0.4%醋酸的乙腈；梯度洗脫程序:t=0~lOmin，25%B相+75%A相；t = 10 ~20min，25 ~30%B 相 +75 ~70%A 相；t = 20 ~35min，30 ~50%B 相 +70 ~50%A 相；t = 35 ~45min，50%B 相 +50%A 相；t = 45 ~60min，50 ~80%B 相 +50 ~20%A 相；流速:0.8mL/min ;柱溫:25°C ;進樣量:20 μ L。
9.權利要求1-3任一項所述的篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的複合物的應用方法，其特徵在於，用於製備篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的製劑。
【文檔編號】G01N30/02GK103558306SQ201310529115
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月31日 優先權日:2013年10月31日
【發明者】陳曉青, 劉亮亮, 施樹雲 申請人:中南大學