用分化胎兒和成年供體細胞進行的核轉移的製作方法

2023-06-14 10:40:46 3

專利名稱：用分化胎兒和成年供體細胞進行的核轉移的製作方法
1發明領域本發明涉及一種克隆方法，通過該方法將來自分化的哺乳動物胎兒或成年細胞的細胞核作為供體核移植入與供體核屬於相同種類的去核哺乳動物卵母細胞中。細胞核經重新編程可完成克隆胚胎的發育，其可再被轉移到雌性受體來產生胎兒及後代，或用於製備培養的內細胞團細胞(CICM)。也可將克隆胚胎與受精胚胎結合形成嵌合胚胎、胎兒和/或後代。
2發明背景可從早先預移植的小鼠胚胎中體外獲得胚胎幹細胞系(ES)的方法已公知。(見如，Evans等人，自然(Nature)，29154-156(1981)；Martin美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，787634-7638(1981))。在成纖維飼餵層細胞(Evans等人，出處同前)或分化抑制劑存在(Smith等人，發育生物學(Dev.Biol.)1211--9(1987))的情況下，ES細胞可以以未分化狀態傳代。
曾有報導表明ES細胞有許多用途。例如，曾報導ES細胞可作為體外分化模型來研究尤其是參與早期發育調節的基因。將小鼠ES細胞導入預移植的小鼠胚胎可產生種系嵌合體，並表現出其多能性(Bradley等人，自然，309255-256))。
由於ES細胞可將其基因組傳至下一代，通過使用經過或未經過期望的遺傳修飾的ES細胞，ES細胞具有可進行家畜的種系操作的潛在用途。另外，對家畜如有蹄類而言，來自如預移植家畜胚胎的核可支持去核卵母細胞發育至足月(Smith等人，生殖生物學(Biol.Reprod.)，401027-1035(1989)；和Keefer等人，生殖生物學，50935-939(1994))。與之不同的是，來源於超過轉移後8細胞期的小鼠胚胎的核並不支持去核卵母細胞的發育(Cheong等人，生殖生物學，48958(1993))。因此家畜的ES細胞很合乎需要，因為不論是否經過遺傳操作，它們可以為核轉移方法提供全能的供體核來源。
一些研究小組報導了據稱是多能胚細胞系的分離。例如，Notarianni等人，受精生殖學雜誌增刊(J.Reprod.Fert.Suppl.)，43255-260(1991)，報導了據稱來自豬和羊囊胚泡的穩定多能細胞系的建立過程，該細胞系的形態與生長特性均與用免疫外科方法自羊囊胚泡中分離的內細胞群原代培養物中的細胞類似。Notarianni等人，受精生物學雜誌增刊，4151-56(1990)也公開了來自豬囊胚泡的公認的多能胚細胞系培養過程中的維持與分化現象。Gerfen等人，動物生物技術(Anim.Biotech)，6(1)1-14(1995)公開了源自豬囊胚泡的胚細胞系的分離。在沒有使用條件培養基的情況下，這些細胞可在小鼠胚胎的成纖維細胞飼餵層上穩定維持，並且據報導在培養過程中分化成不同的細胞類型。
另外，Saito等人，Roux′s Arch.Dev.Biol.，201134-141(1992)報導，培養的牛胚胎幹細胞樣細胞系存活了三代，在第四次傳代後死亡。Handyside等人，Roux發育生物學文獻，196185-190(1987)公開了用免疫外科方法分離的羊胚胎內細胞群在允許來自小鼠ICM的小鼠ES細胞系分離的條件下的培養。Handyside等人報導在上述條件下，羊ICM貼附、擴展並發育成ES細胞樣細胞和內胚層樣的細胞，但延長培養後僅可見到內胚層樣細胞。
最近，Cherny等人，動物基因學(Theriogenology)，41175(1994)報導，牛多能原始生殖細胞衍生的細胞系可在長期培養中維持。培養約7天後，這些細胞可產生鹼性磷酸酶(AP)染色陽性的ES樣集落，表現出可形成胚狀體，並自發分化成至少兩種不同的細胞類型的能力。據報導這些細胞還可表達轉錄因子OCT4、OCT6和HES1的mRNA，這是據認為只被ES細胞表達的同源異型框基因的模式。
最近，Campbell等人，自然，38064-68(1996)報導，在可促進小鼠中ES細胞系分離的條件下，自培養第九天的綿羊胚中培養的胚盤(ED)細胞進行核轉移後，可產生活羊羔。作者認為來自第九天羊胚的ED細胞通過核轉移獲得了全能性，並在培養中保持了全能性。
Van Stekelenbueg-Hamers等人，分子生殖發育(Mol.Reprod.Dev)40444-454(1995)，報導了據稱源自牛囊胚泡內細胞團細胞的永久細胞系的分離與表徵。作者在不同條件下自8或9天牛囊胚泡中分離、培養了ICM，以確定支持牛ICM細胞貼壁和生長的最佳飼餵細胞和培養基。他們得出結論認為，使用STO(小鼠成纖維細胞)飼餵細胞(而不是牛子宮上皮細胞)和將經活性炭過濾的血清(而不是正常血清)補至培養基中後，可提高培養的ICM細胞的貼壁及生長能力。然而VamStekelenburg等人報導，他們的細胞系更像上皮細胞而不是多能ICM細胞。
Smith等人，WO94/24274(1994年10月27日公開)、Evans等人，WO90/03432(1990年4月5日公開)和Wheeler等人，WO94/26889(1994年11月24日公開)報導了據稱可用來獲得轉基因動物的動物幹細胞的分離、篩選和增殖方法。Evans等人也報導了可用於生產轉基因動物的來自豬和牛的據稱是多能胚胎幹細胞的獲得方法。另外，Wheeler等人，WO94/26884(1994年11月24日公開)公開了據稱可用於生產嵌合和轉基因有蹄動物的胚胎幹細胞。
因此根據前述，例如因為它們在克隆或轉基因胚胎的生產中及在核移植中有潛在應用價值，很顯然許多小組已嘗試培養ES細胞系。
也有將有蹄動物內細胞團(ICM)細胞用於核移植的報導。例如，Collas等人，分子生殖發育，38264-267(1994)公開了通過將裂解的供體細胞顯微注射入去核的成熟卵母細胞中進行牛ICM的核轉移。Collas等人公開了體外培養胚胎7天以產生15個囊胚泡，囊胚泡轉移到牛體內後4隻懷孕2隻產仔。同樣，Keefer等人，生殖生物學，50935-939(1994)公開了在核轉移方法中可用牛ICM細胞作為供體核產生囊胚泡，再將囊胚泡移植入受體牛內產生多個活的後代。另外，Sims等人，美國國家科學院院報，906143-6147(1993)公開了將體外短期培養的牛ICM細胞的核轉移入成熟去核卵母細胞中產生牛犢。
也有報導稱將培養的胚盤細胞進行核轉移後可以產生活羊羔(Campbell等人，自然，38064-68(1996))。還有報導稱，將牛的多能胚胎細胞用於核轉移並產生嵌合胎兒。(Stice等人，生殖生物學，54100-110(1996)；Collas等人，分子生殖發育，38264-267(1994))。Collas等人證明在克隆牛的技術中可用顆粒細胞(成年細胞)來產生胚胎。但是未見關於經過胚胎早期階段後(囊胚泡期)的發育的報導。而且，顆粒細胞不易培養並且只能從雌性獲得。Collas等人沒有嘗試去擴增培養的顆粒細胞或對其進行遺傳修飾。
雖然用胚胎細胞作為供體可以進行基因型的複製，現存的方法存在一些問題。例如，用現存方法只能用有限數量的胚胎供體核(少於100)或與體外細胞系進行胚胎克隆。直到克隆動物長至成年才能知道該胚胎基因組是否編碼了優良基因型。
在轉基因哺乳動物的生產領域也存在著一些問題。用現有的方法將異源DNA導入早期胚胎或胚細胞系後，其在胎兒期分化成許多細胞類型並最終發育成轉基因動物。但是，產生一個轉基因動物需要許多早期胚胎，因此上述方法效率很低。再者，也沒有簡單有效的方法以在將胚胎植入代理母體而花費時間和金錢之前對轉基因胚胎進行篩選。另外用早期胚胎轉基因方法不易實施基因打靶(gene targeting)技術。
使用小鼠胚胎幹細胞使得研究者篩選轉基因細胞和進行基因打靶成為可能。較其它的轉基因技術可以進行更多的遺傳操作。可是，胚胎幹細胞系和其它的胚細胞系須在未分化狀態下維持，該狀態需要有飼餵細胞層和/或補加細胞因子至培養基中。即使在這些預防措施存在的情況下，這些細胞常常進行自發分化，無法用現有方法用它們產生轉基因後代，而且有些胚細胞系必須以不可進行基因打靶技術的方式增殖。
因此，儘管目前文獻中已報導了諸多方法，仍需改進的克隆哺乳動物細胞的方法。
發明目的及概述本發明目的之一是提供新的改進方法用以產生克隆的哺乳動物細胞。
本發明更具體的一個目的是提供一種克隆哺乳動物細胞的新方法，包括將分化的哺乳動物細胞核移植入屬於相同種類的去核卵母細胞中。
本發明另一目的是提供一種方法來繁殖已證明有遺傳優勢或其它所需特性的成年哺乳動物。
本發明另一目的是提供一種改進的方法來產生經遺傳操作的或轉基因哺乳動物(即胚胎、胎兒、後代)。
本發明一個更具體的目的是提供一種方法來產生經遺傳操作的或轉基因哺乳動物，通過該方法在用分化細胞或用細胞核形成NT單位之前，在分化的哺乳動物細胞或細胞核中將目的基因插入、移出或在其中進行修飾。
本發明另一目的是提供經遺傳操作或轉基因的哺乳動物(即胚胎、胎兒、後代)，方法是由將分化細胞的核移植入與分化細胞屬於相同種類的去核卵母細胞中。
本發明另一目的是提供產生哺乳動物CICM細胞的新方法，包括將已分化細胞的核移植入與該分化細胞屬於相同種類的去核卵母細胞中。
本發明另一目的是提供CICM細胞，該細胞由將分化哺乳動物細胞的核移植入與該分化細胞屬於相同種類的去核卵母細胞中獲得。
本發明更具體的一個目的是提供用於產生人類CICM細胞的方法，包括將人類細胞如人成年細胞的核移植入人類去核卵母細胞中。
本發明另一目的是用該CICM細胞進行治療或診斷。
本發明一個具體的目的是把該CICM細胞，包括人類和有蹄類CICM細胞，用於治療或診斷任何適合用細胞、組織或器官移植方法治療或診斷的疾病。該CICM細胞可在同種類內或不同種類間使用。
本發明另一目的是用來自NT胚胎、胎兒或後代的組織，包括人類和有蹄類組織，治療或診斷任何適合用細胞、組織或器官移植方法治療或診斷的疾病。該組織可在同種類內或不同種類間使用。
本發明另一具體目的是應用根據本發明產生的CICM細胞製備分化的細胞、組織或器官。
本發明的一個更具體的目的是用根據本發明產生的人類CICM細胞製備分化的人細胞、組織或器官。
本發明另一具體目的是體外應用根據本發明產生的CICM細胞，用於例如細胞分化的研究和用於分析如藥物研究的目的。
本發明另一目的是提供改進的移植治療的方法，包括來自根據本發明產生的CICM細胞的同基因系細胞、組織或器官的應用。這些治療以舉例的方式包括帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默氏病、ALS、脊髓損傷、多發性硬化、肌營養不良、糖尿病、肝臟疾病、心臟病、軟骨更新、燒傷、血管病、泌尿道疾病、以及免疫缺陷病、骨髓移植、癌症和其它疾病的治療。
本發明另一目的是提供經遺傳操作或轉基因的CICM細胞，方法是由在使用分化的細胞或細胞核形成NT單位之前在已分化的哺乳動物細胞或細胞核內插入、移出或修飾目的基因。
本發明另一目的是用本發明所產生的轉基因或經遺傳操作的CICM細胞來進行基因治療，尤其是用於上述疾病和損傷的治療和/或預防。
本發明另一目的是把本發明所產生的CICM細胞或本發明所產生的轉基因或經遺傳操作的CICM細胞作為核供體用於核移植。
因此，一方面，本發明提供了一種克隆哺乳動物(如胚胎、胎兒、後代)的方法。該方法包括(i)在適於核轉移(NT)單位形成的條件下，將所需分化的哺乳動物細胞或細胞核插入與該分化細胞或細胞核屬於相同種類的去核哺乳動物卵母細胞中；(ii)活化產生的核轉移單位；(iii)培養所述經活化的核轉移單位直至超過兩細胞發育期；並且(iv)將所述培養的NT單位轉移到宿主哺乳動物體內以使NT單位發育成胎兒。
該胎兒的細胞、組織和/或器官可用於細胞、組織和/或器官移植的領域。
本發明還包括克隆經遺傳操作或轉基因哺乳動物的方法，用該方法在將分化的哺乳動物細胞或細胞核插入到去核卵母細胞中之前，在已分化哺乳動物的細胞或細胞核內插入、移出或修飾目的基因。
本發明還提供了用上述方法獲得的哺乳動物及其後代。
本發明優選用於克隆有蹄類動物。
另一方面，本發明提供了產生CICM細胞的方法。該方法包括(i)在適於核轉移(NT)單位形成的條件下，將所需分化的哺乳動物細胞或細胞核插入到與該分化細胞或細胞核屬於相同種類的去核哺乳動物卵母細胞中；(ii)活化產生的核轉移單位；(iii)培養所述已活化的核轉移單位直至超過兩細胞發育期；並且(iv)培養獲自所述培養的NT單位的細胞以獲得CICM細胞。
該CICM細胞可用於細胞、組織和器官移植領域。
根據上述和其它目的，可以明顯看到本發明的優勢及特點，參考下面本發明優選實施方案的詳述和附加權利要求，可以更清楚地理解本發明的本質。
發明詳述本發明提供了通過核轉移或核移植來克隆哺乳動物的改進的方法。該主題申請中，核轉移或核移植或NT可互換使用。
根據本發明，將來自分化胎兒或成年哺乳動物細胞的細胞核移植入與供體核屬於相同種類的去核哺乳動物卵母細胞中。該核經重新編程以完成克隆胚胎的發育，再將克隆胚胎轉移入雌性受體來產生胎兒及後代，或用於產生CICM細胞。也可將克隆胚胎與受精胚胎結合以產生嵌合胚胎、胎兒和/或後代。
在克隆過程中現有技術方法使用的是胚胎細胞類型。這包括Campbell等人(自然，38064-68，1996)和Stice等人(生殖生物學，54100-110，1996)的研究工作。在二者的工作中，胚細胞系來自受孕不到10天的胚胎。在二者的研究中，細胞是在飼餵層上維持，以避免用於克隆方法中的供體細胞的明顯分化。本發明使用已分化的細胞。
出人意料的是，內含分化供體核的克隆胚胎可發育至高級胚胎及胎兒期。以往的科學教條認為只有胚胎或未分化的細胞類型能導致此類發育。出人意料的是，大量克隆胚胎可來自這些已分化的細胞類型。也未曾想到的是，新的轉基因胚胎細胞系可從轉基因克隆胚胎中方便獲得。
因此根據本發明，繁殖有優良基因型的哺乳動物，包括有蹄類，成為可能。這將允許繁殖已證明有遺傳優勢或其它所需特性的成年動物，從而加速如許多重要有蹄類動物種類的發育。根據本發明可獲得的上億胎兒或成年細胞，並將其用於克隆方法。這將很可能導致在短期內產生許多同樣的後代。
通過使用可被克隆增殖的分化的細胞來源，本發明還可簡化轉基因步驟。這就無需在未分化狀態下維持細胞生長，從而使遺傳修飾包括隨機整合及基因打靶更易於完成。另外，通過將核轉移與體外修飾和篩選這些細胞相結合，本方法比以前的轉基因胚胎技術更有效。根據本發明，可在無細胞因子、條件培養基和/或飼餵層的情況下克隆增殖這些細胞，從而簡化、便利了轉基因方法。在按照本發明的克隆方法中使用轉染的細胞時，可產生轉基因胚胎，其可發育成胎兒及後代。另外，這些轉基因克隆胚胎可用於產生CICM細胞系或其它胚胎細胞系。因此，本發明無需從體外獲得並維持用於施行基因工程技術的未分化細胞系。
本發明還可用來產生CICM細胞、胎兒及後代，它們可用於例如細胞、組織及器官移植。從動物中獲取胎兒或成年細胞用於克隆步驟，克隆胎兒經過器官發生而進行發育時可從中獲得許多細胞、組織及可能的器官，也可以從克隆後代中分離出細胞、組織及器官。該方法可為許多醫學及獸醫治療包括細胞及基因治療提供了「材料」來源。如果將細胞轉移回其來源的動物體內，可防止發生免疫排斥反應。而且由於可從這些克隆中分離出許多細胞類型，用其它方法學如造血嵌合可以避免在相同種類內和不同種類間發生免疫排斥反應。
因此，一方面，本發明提供了一種克隆哺乳動物的方法。一般而言，通過包括以下步驟的核轉移方法可產生哺乳動物(i)獲得所需的分化哺乳動物細胞，將其作為供體核的來源；(ii)從與供體核來源細胞屬於相同種類的哺乳動物中獲得卵母細胞；
(iii)去掉所述卵母細胞的核；(iv)通過如融合或注射的方法將所需分化細胞或細胞核轉移至去核卵母細胞中形成NT單位；(v)活化產生的NT單位；(vi)培養上述活化的NT單位直至超過兩細胞發育期；並且(vii)將上述培養的NT單位轉移到宿主哺乳動物內以使該NT單位發育成胎兒。
本發明還包括了克隆經遺傳操作或轉基因的哺乳動物的方法，通過該方法，在分化哺乳動物細胞或細胞核插入去核卵母細胞之前，在分化哺乳動物細胞或細胞核中插入、移出或修飾目的基因。
本發明還提供了用上述方法獲得的哺乳動物及其後代。本發明優選用於克隆有蹄類。
本發明還提供了可用於細胞、組織及器官移植領域的NT胎兒及NT和嵌合後代。
另一方面，本發明還提供了一種產生CICM細胞的方法。該方法包括(i)在適於核轉移(NT)單位形成的條件下，將所需分化哺乳動物細胞或細胞核插入與該分化細胞或細胞核屬於相同種類的去核哺乳動物卵母細胞中；(ii)活化產生的核轉移單位；(iii)培養所述已活化的核轉移單位直至超過兩細胞發育期；並且(iv)培養獲自所述培養的NT單位中的細胞以獲得CICM細胞。
該CICM細胞可有效地用於細胞、組織和器官移植領域，或用來產生胎兒或後代，包括轉基因胎兒或後代。
優選地，將NT單位培養到至少2-400個細胞的大小，優選為4-128個細胞，最優選為至少約50個細胞的大小。
核轉移或核移植技術公知於文獻，並且發明背景所引用的許多參考文獻中描述了該技術。尤其見Campbell等人，動物生殖學(Theriogenology)，43181(1995)；Collas等人，分子生殖發育(Mol.Report Dev.)，38264-267(1994)；Keefer等人，生殖生物學，50935-939(1994)；Sims等人，美國國家科學院院報，906143-6147(1993)；WO94/26884；WO94/24274和WO90/03432，在此全文引入作為參考。另外，美國專利第4,944,384號和第5,057,420號描述了牛的核移植方法。
分化哺乳動物細胞是超過胚胎早期的細胞。更具體而言，分化細胞是來自至少經過胚盤期(牛胚胎發生第10天)的細胞。分化細胞可來自外胚層、中胚層或內胚層。
哺乳動物細胞包括人類細胞可用周知方法獲得。用於本發明的哺乳動物細胞包括以舉例方式，如上皮細胞、神經細胞、表皮細胞、角質細胞、造血細胞、黑色素細胞、軟骨細胞、淋巴細胞(B和T淋巴細胞)、紅細胞、巨噬細胞、單核細胞、成纖維細胞、心肌細胞或其它肌細胞等。另外，用於核轉移的哺乳動物細胞可獲自不同的器官，如皮膚、肺、胰、肝、胃、腸、心臟、生殖器官、膀胱、腎、尿道及其它泌尿器官等。這些僅僅為合適的供體細胞的實例。用於本發明的合適的供體細胞可從機體的任何細胞或器官獲得，包括所有體細胞或生殖細胞。
成纖維細胞是一種理想的細胞類型，因為它們可從正在發育的胎兒及成年動物中大量獲得。成纖維細胞已分化到一定程度，因此曾被認為不是適用於克隆過程的細胞類型。重要的是，這些細胞體外倍增時間短，易於增殖，並能克隆增殖以用來進行基因打靶操作。本發明創新之處還在於使用了分化細胞類型。本發明的優勢在於這些細胞在體外容易進行增殖、遺傳修飾和篩選。
合適的哺乳動物卵母細胞的來源包括綿羊、母牛、豬、馬、兔、豚鼠、小鼠、倉鼠、大鼠、靈長類等。優選地，卵母細胞獲自有蹄類，最優選為牛。
分離卵母細胞的方法在本領域眾所周知。基本上包括從哺乳動物如牛的卵巢或生殖道中分離出卵母細胞。牛卵母細胞的便利來源是屠宰場的原料。
為了成功使用如基因工程、核轉移及克隆的技術，在卵母細胞作為受體細胞用於核轉移之前，以及在由精子細胞受精而發育成胚胎之前，必須先體外使其大體成熟。該過程通常需要從哺乳動物卵巢如來自屠宰場的牛卵巢裡收集未成熟(分裂前期I)的卵母細胞，在成熟培養基裡使之成熟至分裂中期II階段，就牛卵母細胞而言大體是在抽吸後約18-24小時，然後再使該卵母細胞受精或去核。對本發明目的而言，該時期稱為「成熟時期」。這裡計算該時期時，「抽吸」是指自卵巢濾泡中抽吸出未成熟的卵母細胞。
另外，在體內已成熟到分裂中期II階段的卵母細胞已經成功地應用於核轉移技術。基本上，成熟的分裂中期階段II的卵母細胞是在發情後或注射入人絨毛膜促性腺激素(hCG)或類似激素後35-48小時用外科方法從非超排卵或超排卵的母牛或小母牛中獲得。
去核和核轉移過程中卵母細胞的成熟期被認為對NT方法成功與否很重要(見如Prather等人，分化(Differentiation)48，1-8，1991)。通常，成功的哺乳動物胚胎克隆操作用分裂中期II階段的卵母細胞作為受體卵母細胞，因為據信卵母細胞在該階段能被或足夠被活化以處理導入的核，如同受精過程。家養動物尤其是牛的卵母細胞活化時間一般為抽吸後16-52小時左右，優選約28-42小時左右。
例如，如Seshagine等人在生殖生物學，40，544-606，1989中所述，將未成熟的卵母細胞在HEPES緩衝的倉鼠胚胎培養基(HECM)中洗滌後，在39℃放入輕石蠟或矽層下的成熟培養基滴中，該培養基包括50微升組織培養基(TCM)199，內含10％胎牛血清和適量促性腺激素如黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)。
經過一定時間的成熟期後將卵母細胞去核，此成熟期為從約10至40小時左右，優選為約16-18小時左右。去核前優選取出卵母細胞，放入含有1毫克每毫升透明質酸酶的HECM液中，再去掉卵丘細胞。可通過反覆用極細孔移液管移液或短促振蕩實現上述目的。然後根據極性小體的有無來篩選被剝離的卵母細胞，存在極性小體的為應選的分裂中期II卵母細胞，再將其用於核移植。下一步是去核。
可用已知的方法去核，如美國專利第4,994,384號中所述，在此引入作為參考。例如可將分裂中期II卵母細胞置入任選地含有7.5微克每毫升松胞素B的HECM中立即去核，或者置入合適培養基如胚胎培養基(如加入10％發情牛血清的CR1aa)中然後去核，優選不超過24小時之後，且更優選為16-18小時後。
可用顯微外科法去核，用微移液管去掉極性小體和周圍胞質。再篩選鑑定那些已成功去核的卵母細胞。篩選時可用含1微克每毫升33342Hoechst染料的HECM對卵母細胞進行染色，再在紫外照射下觀察卵母細胞不到10秒。將已成功去核的卵母細胞置入合適培養基如加入10％血清的CR1aa中。
本發明中，優選在體外成熟開始後約10至約40小時的時間範圍將受體卵母細胞去核，更優選為在體外成熟開始後約16至約24小時，最優選為在體外成熟開始後約16-18小時。
再將與去核卵母細胞屬於相同種類的單個哺乳動物細胞轉移到用來產生NT單位的去核卵母細胞的卵周隙。按照本領域已知方法使該哺乳動物細胞和去核卵母細胞形成NT單位。例如可用電融合法融合細胞。通過提供足以使質膜產生瞬態破裂的電子脈衝可以實現電融合。質膜破裂非常短暫是因為膜很快又恢復完整。因此，如果兩個相鄰質膜被誘導破裂並且在恢復完整脂雙層時發生混合，兩個細胞間的小管道將會開放。如此小的開口在熱動力學上是不穩定的，開口會擴大直到兩個細胞合二為一。參考文獻見Prather等人美國專利4,997,384(在此全部引入作為參考)，該文獻對此過程作了深入探討。可使用許多電融合介質包括如蔗糖、甘露醇、山梨醇和磷酸緩衝液。也可用仙臺病毒作為融合物實現融合(Graham wister Inot Symp Monogr，9，19，1969)。
另外在某些情況下(如小的供體核)，優選將核直接注射入卵母細胞而不是用電穿孔融合法。該技術見Collas和Barres分子生殖發育，38264-267(1994)，在此全部引入作為參考。
優選地，卵母細胞成熟開始約24小時後在500μm寬的槽內施以90-120V電脈衝約15微秒，使哺乳動物細胞和卵母細胞發生電融合。融合後將產生的融合NT單位置入合適的培養基如CR1aa培養基中直到活化。典型地，經過短暫時間後便開始活化，一般不超過24小時，優選為約4-9小時之後。
用已知方法可活化NT單位。該方法包括，例如，在亞生理溫度的條件下培養NT單位，也就是在涼或實際上冷的溫度刺激下培養NT單位。最方便的做法是在室溫下培養NT單位，因為相對於胚胎通常暴露於其中的生理溫度而言室溫是較低的。
另外，也可用已知的活化劑達到活化目的。例如，受精過程中精子穿入卵母細胞可以活化融合前的卵母細胞，從而在核移植後產生更多數量可生存下來的孕胎和多個有著相同基因的小牛。融合後也可用電或化學休克活化NT胚胎。適當的卵母細胞活化方法可見美國專利第5,496,720號，Susko-Parrish等人，在此全部引入作為參考。
另外，活化可通過同時或順序地進行下列操作而實現(i)提高卵母細胞內二價陽離子的水平，並且(ii)減少卵母細胞內細胞蛋白的磷酸化水平。
通常可通過將二價陽離子如鎂、鍶、鋇、鈣等通過以如離子載體的形式導入卵母細胞胞質中達到上述目的。其它提高二價陽離子水平的方法包括電休克、用乙醇處理和用骨架螯合劑處理。
可以用已知方法降低磷酸化水平，比如加入激酶抑制劑像絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑，如6-二甲基-氨基嘌呤、星形孢菌素、2-氨基嘌呤和神經鞘氨醇等。
另外，也可以通過將磷酸酶如磷酸酶2A和磷酸酶2B導入卵母細胞內來抑制胞內蛋白質的磷酸化。
在一實施方案中用以下方法活化NT，先將融合的NT單位短暫接觸含5μM離子黴素和1mg/ml BSA的TL-HEPES培養基中，再放入含30mg/ml BSA的TL-HEPES中洗滌，該過程應在融合後24小時左右內進行，優選是在融合後4-9小時左右進行。
NT單位活化後可在合適的體外培養基中培養直至產生CICM細胞和細胞集落。適合胚胎培養和成熟的培養基在本領域眾所周知。已知的培養基例如，可用於牛胚胎培養和維持的培養基包括Ham′s F-10+10％的胎牛血清(FCS)、組織培養基-199(TCM-199)+10％胎牛血清、Tyrodes-白蛋白-乳酸-丙酮酸(TALP)、Dulbecco′s磷酸緩衝鹽液(PBS)、Eagle′s和Whitten′s培養基。用來收集卵母細胞並使之成熟的最常用培養基之一是TCM-199，其補加1-20％血清，包括胎牛血清、新生血清、發情期母牛血清、小羊血清或閹牛血清。優選的維持培養基包括含Earl鹽、10％胎牛血清、0.2mM丙酮酸鈉和50μg/ml硫酸慶大黴素的TCM-199。上述任何一種培養基也涉及許多細胞類型如顆粒細胞、輸卵管細胞、BRL細胞、子宮細胞和STO細胞的共培養。
另一種維持培養基見Rosenkrans，Jr等人的美國專利第5,096,822號，在此引入作為參考。稱為CR1的胚胎培養基含有支持胚胎生長所必需的營養成分。
CR1培養基含有L-乳酸半鈣，含量為1.0mM-10mM，優選為1.0mM-5mM。L-乳酸半鈣是L-乳酸經摻入半鈣鹽所得。L-乳酸半鈣的重要性在於一種單一成分可滿足培養基兩方面的需要(i)收縮和細胞骨架排列所必需的鈣；以及(ii)代謝和電子轉運所必需的乳酸。L-乳酸半鈣還為胚胎存活提供了重要的礦物質和能量來源。
CR1培養基的優點在於不含血清如胎牛血清，也不需要共培養動物細胞或其它生物介質，亦即，含有動物細胞如輸卵管細胞的介質。生物介質有時是不利的，因為其中可含有對胚胎有害的微生物或痕量因子，這些成分不易檢測、定性和去除。
CR1培養基的主要成分的例子包括L-乳酸半鈣、氯化鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉和少量不含脂肪酸的牛血清白蛋白(Sigma A-6003)。另外，也可將一定量的必需和非必需胺基酸加入培養基中。含胺基酸的CR1縮寫為″CR1aa″。
CR1培養基優選包含含量如下的下列成分氯化鈉114.7mM氯化鉀3.1mM碳酸氫鈉 26.2mML-乳酸半鈣5mM
無脂肪酸的BSA3mg/ml在一實施方案中，將活化的NT胚胎單位置於含1.9mM DMAP的CR1aa培養基中約4個小時，在HECM中洗滌後置於含BSA的CR1aa中培養。
例如，可以將活化的NT單位轉移到含2.0mM DMAP(Sigma)的CR1aa培養基中並在室溫條件下培養，比如在約38.5℃、5％CO2下培養適當的時間如約4-5小時左右。
然後，優選洗滌培養的NT單位，再將其置於孔板內恰當的培養基如含10％FCS和6mg/ml的CR1aa培養基，該孔板優選含有合適的融合飼餵細胞層。合適的飼餵細胞層包括例如，成纖維細胞和上皮細胞(如有蹄動物的成纖維細胞和子宮上皮細胞)、雞成纖維細胞、嚙齒類(如大鼠和小鼠)成纖維細胞、STO和SI-M220飼餵層細胞系和BRL細胞。
在一實施方案中，飼餵細胞包括小鼠胚胎成纖維細胞。合適的成纖維飼餵細胞的製備方法將在下面的實施例中得到說明，該製備方法屬於該領域普通技術人員的範疇內。
在飼餵層上培養NT單位直至其長到適於轉移至雌性受體或用來獲得可產生CICM細胞或細胞集落的細胞的體積。優選地，將這些NT單位培養到至少約2-400個細胞左右，更優選的為約4-128個細胞左右，最優選為至少約50個細胞。在適當條件下即約38℃和5％CO2下培養，為了使細胞更好地生長，一般約每2-5天、優選約每3天更換一次培養基。
本發明中的核轉移方法和動物受體處理方法均為胚胎轉移工程中的標準步驟。同步轉移對本發明成功很重要，亦即NT胚胎發育階段要與雌性受體發情周期同步。其優勢以及如何維護受體見Siedel，G.E.，Jr.的綜述(「關於牛胚胎轉移的重要綜述」，體外受精與胚胎發育，Fertilization andEmbryonic Development in Vitro(1981)，L.Mastroianni，Jr.和J.D.Biggers編，Plenum出版社，紐約，NY，323頁)，在此引入作為參考。
本發明還可用於克隆經遺傳操作或轉基因的哺乳動物。如上所述，本發明優勢在於通過利用可被克隆增殖的分化細胞源進行操作簡化了轉基因步驟。具體地，在作為核供體的分化細胞內插入、移出或修飾目的基因。再將那些遺傳特性改變的分化細胞與去核卵母細胞一起用於核移植。
可用任何插入、刪除或修飾來自哺乳動物細胞目的基因的方法來改變作為核供體的分化細胞。可用這些方法移出一個基因的全部或部分，且基因可以是異源的。同源重組技術也包括在內，用該技術可以在細胞基因組一個特定位點或多個位點插入、刪除或修飾一個基因或多個基因。
因此可用本發明來提供帶有所需基因型的成年哺乳動物。尤其有用的是繁殖已證明有遺傳優勢或其它有利特性的成年有蹄類動物，包括轉基因或經遺傳操作過的動物和嵌合動物。另外，可用取自NT胎兒包括轉基因和/或嵌合胎兒的細胞和組織進行細胞、組織和器官移植，其與應用CICM相結合治療下述多種疾病。
為了獲得CICM細胞和細胞系，在得到合適大小的NT單位後，從條帶區機械法切下細胞再使用。優選實施方法是取出一般包括至少50個細胞的帶NT單位的細胞團，洗滌這些細胞並放到飼餵層比如照射過的成纖維細胞上。典型地，用來獲得幹細胞或細胞集落的細胞來自培養的NT單位的最內部，該NT單位優選為至少50個細胞大小。然而也可用含有較多或較少細胞數目的NT單位和NT單位其它部分的細胞來獲取ES細胞和細胞集落。細胞在合適的生長培養基中在飼餵層上維持，如補加了10％FCS、0.1mMβ-巰基乙醇(Sigma)和L-穀氨醯胺的αMEM培養基。為了細胞的最佳生長，要經常更換生長培養基，如約每2-3天更換一次。
此培養方法導致CICM細胞或細胞系的形成。為了維持特定CICM細胞的最佳生長狀態，本領域技術人員可以按照需要調整培養條件。也可用本發明獲得遺傳操作過或轉基因哺乳動物的CICM細胞。也就是說，上述方法可用於獲得NT單位，其中一個或多個目的基因已經被導入，或者一個或多個內源基因的全部或部分已經被移出或進行了修飾。這些遺傳操作過的或者轉基因NT單位可用於產生遺傳操作過或轉基因的CICM細胞，包括人類細胞。
產生的CICM細胞和細胞系，優選為人類CICM細胞和細胞系，有多種治療和診斷應用。特別尤其是CICM細胞可以用於細胞移植治療。用人類CICM細胞可以治療許多疾病。也可用人類M單位以自知方式治療疾病。
在這方面，已知小鼠胚胎幹細胞(ES)能夠分化成幾乎任何細胞類型，例如造血幹細胞。所以本發明產生的人類CICM細胞應有類似的分化能力。用已知方法可以誘導本發明產生的CICM細胞分化成所需細胞類型。例如，在分化培養基中和利於細胞分化的條件下培養人CICM細胞，可誘導其分化成造血幹細胞、肌細胞、心肌細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、尿道細胞等。導致CICM細胞分化的培養基和方法以及合適的培養條件在本領域眾所周知。
例如Palacios等人在美國國家科學院院報，927530-7537(1995)教導，通過將幹細胞經歷誘導步驟可以從胚胎細胞系產生造血幹細胞，該誘導步驟包括開始將細胞聚集體在無視黃酸的懸浮培養基中培養，再在含有視黃酸的同樣培養基中培養，再將細胞聚集體轉移到利於細胞貼附的底物中。
另外，Pedersen在生殖受精發育雜誌(J.Reprod.Fertil.Dev.)6543-552(1994)上參閱了大量文獻的綜述公開了胚胎幹細胞體外分化成各種分化細胞類型，包括造血幹細胞、肌細胞、心肌細胞、神經細胞及其它細胞的方法。
另外，Bain等人在發育生物學，168342-357(1995)上教導胚胎幹細胞體外分化成有神經元特性的神經細胞。上述文獻為從胚胎或幹細胞得到分化細胞的方法示例。在此全部引入上述文獻尤其是其中涉及分化胚胎幹細胞的方法的公開內容作為參考。
因此，本領域技術人員可以用已知方法和培養基來培養CICM細胞，包括遺傳操作過或轉基因的CICM細胞，以獲得所需分化細胞類型如神經細胞、肌細胞、造血細胞等。
可用主題CICM細胞來獲取任何所需分化細胞類型。這種分化人類細胞在治療上的用途是多種多樣的。例如，可以把人類造血幹細胞用於需要骨髓移植的醫療用途。用該方法可以治療許多疾病，比如，晚期癌症(如卵巢癌和白血病)以及損害免疫系統的疾病(如AIDS)。如上所述可通過比如使癌症或AIDS病人的成年體細胞(如上皮或淋巴細胞)與去核卵母細胞融合，得到CICM細胞，再將該細胞在利於分化的條件下培養直至得到造血幹細胞來獲得造血幹細胞。可用該造血幹細胞治療包括癌症和AIDS在內的疾病。
或者，來自神經失調患者的成年體細胞可與去核卵母細胞融合後得到人類CICM細胞，再在分化條件下培養這些細胞以產生神經細胞系。可用該人類神經細胞移植治療的疾病包括，例如，帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、ALS和腦癱及其它。具體就帕金森氏病而言，已證明移植的胎兒腦神經細胞可與周圍細胞形成正確連接並能產生多巴胺。這樣可導致帕金森氏症狀的長期逆轉。
本發明的主要優點在於，可以提供來源基本上不受限制的適合移植的同基因系或同系人類細胞。這就避免了與現有移植方法相關的重要問題，也就是由於宿主抗移植體或移植體抗宿主排斥反應導致的對移植組織的排斥現象。常規預防或減少排斥反應的方法是施用抗排斥藥物如環胞菌素。但是此類藥物有明顯的不良副作用，如免疫抑制、致癌性且價格昂貴。本發明無需抗排斥藥物，或至少會大大減少對抗排斥藥物的需要。
其它可用同基因系細胞療法治療的疾病包括，例如，脊髓損傷、多發性硬化、肌營養不良、糖尿病、肝病即高膽固醇血症、心臟病、軟骨置換、燒傷、足部潰瘍、胃腸道疾病、血管病、腎病、、尿道疾病，以及衰老相關疾病和狀況。
可用本方法置換缺陷基因如缺陷的免疫系統基因、囊性纖維化基因，或導入基因以表達有治療作用的蛋白質如生長因子、淋巴因子、細胞因子、酶等。比如，可以將編碼腦源生長因子的基因導入人類CICM細胞，該細胞分化成神經細胞，再將這些細胞移植入帕金森氏病患者中以延緩該病程中神經細胞的喪失。
以前，用BDNF轉染的細胞類型可以是原代細胞，也可以是永久細胞系，可以是衍生自神經或非神經(成肌細胞和成纖維細胞)的細胞。比如用逆轉錄病毒載體將BDNF基因轉染入星形膠質細胞中，並把該細胞移植入帕金森氏病大鼠模型中(Yshimoto等人，腦研究，(BrainReseach)，69125-36(1995))。
通過離體療法，移植後32天大鼠帕金森氏樣症狀最高可減少45％。將酪氨酸羥化酶的基因置於星形膠質細胞也會產生同樣效果(Lundberg等人，神經發育(Develop.Neurol)，13939-53(1996)，在此引入作為參考)。
但是該離體方法存在著問題。特別是，目前所用的逆轉錄病毒載體在體內被下調，轉基因僅得到瞬時表達(Mulligan綜述，科學(Science)，260926-932(1993))。另外該研究使用的是原代細胞、星形膠質細胞，這些細胞有一定壽限且複製緩慢。這些特性降低了轉染率，阻礙了對穩定轉染細胞的選擇。另外在同源重組技術中使用的進行基因打靶的原代細胞幾乎不可能大量擴增。與之形成對比的是，使用哺乳動物CICM細胞可以消除與逆轉錄病毒系統相關的困難。
可以導入CICM細胞的基因包括，例如上皮生長因子、基底成纖維生長因子、神經膠質細胞來源的神經營養生長因子、胰島素樣生長因子(I和II)、神經營養素-3、神經營養素4/5、睫狀神經營養因子、AFT-1、細胞因子基因(白細胞介素、幹擾素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子(α和β)等)、編碼治療用酶的基因等。
除了人類CICM細胞用於細胞、組織和器官移植的用途外，本發明還包括非人類細胞在治療人類疾病中的用途。因此可以用任何種類的CICM細胞、NT胎兒及NT和嵌合後代(轉基因或非轉基因)治療證明可以進行細胞、組織或器官移植的人類疾病。通常，可在相同種類內(自體的、同基因系的或同種移植)或不同種類間(異種移植)使用本發明的CICM細胞、胎兒及後代。例如可以用來自牛NT胎的腦細胞治療帕金森氏病。
另外，可以把CICM細胞，優選是人類細胞，用作體外分化模型，特別是用於研究參與早期發育調節的基因。此外，利用主題CICM細胞，分化的細胞、組織和器官也可用於藥物研究。
也可進一步將主題CICM細胞作為核供體來製備其它的CICM細胞和細胞集落。
為了更清楚地描述本發明，提供以下實施例。
實施例1牛和豬胚胎以及成年牛成纖維細胞原代培養物的分離牛和豬成纖維細胞原代培養物獲自胎兒(對於牛和豬胎兒分別為懷孕45天和35天)。以無菌操作除去頭、肝臟、心臟和消化道，絞碎胎兒並在預熱過的胰蛋白酶EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；GIBCO，GRAND Island，NY)中於37℃溫育30分鐘。將成纖維細胞置於組織培養皿中並在補充了10％胎牛血清(FCS)(Hyclone，Logen，UT)，青黴素(100IU/ml)和鏈黴素(50μl/ml)的α-MEM培養基中培養。將成纖維細胞置於空氣中帶有5％CO2的潮溼環境中於37℃生長。
從牛(約5歲)肺中分離成年成纖維細胞。將絞碎的肺組織在胰蛋白酶EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；GIBCO，GRANDIsland，NY)中於10℃溫育過夜。次日將組織和任何分化的細胞在預熱過的胰蛋白酶EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；GIBCO，GRAND Island，NY)中於37℃溫育一小時。連續洗滌3次並進行胰蛋白酶溫育(1小時)。將成纖維細胞置於組織培養皿中並在補充了10％胎牛血清(FCS)(Hyclone，Logen，UT)，青黴素(100IU/ml)和鏈黴素(50μl/ml)的α-MEM培養基中培養。基本上可在發育過程中的任何時間分離成纖維細胞，範圍大約從後胚盤期一直到動物的成年期(牛從受精後12至15天一直到10至15歲)。也可用此方法從其它哺乳動物包括小鼠中分離成纖維細胞。標記基因(外源異源DNA)導入胚胎和成年成纖維細胞對胚胎(牛和豬)和成年(牛)成纖維細胞進行下述電穿孔步驟。也可用標準的顯微注射方法將異源DNA導入成纖維細胞，然而，在此實施例中採用電穿孔，因為它更容易。
含有增殖的成纖維細胞的培養皿置於胰蛋白酶EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；GIBCO，GRAND Island，NY)中溫育直到細胞成為單細胞懸液。以500×g將細胞沉澱並用磷酸緩衝鹽液(PBS)以每毫升5百萬細胞的濃度再懸浮。
報告基因構件含有巨細胞病毒啟動子和β-半乳糖苷酶、新黴素磷酸轉移酶融合基因(β-GEO)。將報告基因和終濃度為50μg/ml的細胞加入到電穿孔槽。給予電穿孔脈衝後，將成纖維細胞轉移回補充了10％的胎牛血清(FCS)(Hyclone，Logen，UT)、青黴素(100IU/ml)和鏈黴素(50μl/ml)的生長培養基(α-MEM培養基)(BioWhittaker，Walkersville，MD)中。
電穿孔後第二天，選擇貼附的成纖維細胞用於報告基因的穩定整合。將G418加到生長培養基中維持15天(範圍從3天到培養細胞生命跨度的終點)。由於這些細胞不表達新黴素抗性基因，該藥物可殺死這些無β-GEO基因的細胞。最後存在的是穩定的轉基因細胞的集落，每一集落均獨立於其它集落進行繁殖。用X-gal進行轉基因成纖維細胞的染色以觀察β-半乳糖苷酶的表達，並用β-GEO基因的PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳證實整合為陽性。轉基因成纖維細胞用於核轉移方法以產生CICM細胞系和轉基因胎兒用衍生自牛胚胎成纖維細胞的一個集落的細胞系(CL-1)作為核轉移方法(NT)中的核供體。下面描述了常規的NT步驟。
屠宰場獲得的卵母細胞在體外成熟。卵母細胞剝除卵丘細胞並在大約成熟後小時(hpm)18至20小時用斜尖微移液管去核。在TL-HEPES中培養基補加Hoechst 33342(3μg/ml；Sigma))證實去核。然後將單獨的供體細胞(成纖維細胞)置於受體卵母細胞的卵黃周隙。用電融合技術使牛卵母細胞細胞質和供體核(NT單位)融合。NT單位在500μm寬的槽內接受由120V、15微秒的融合脈衝。此步操作在24hpm進行，NT單位被置於CRlaa培養基中直到26至27hpm。
上面已經描述了人工活化卵母細胞的常規步驟。NT單位的活化開始於26至27hpm之間。簡而言之，NT單位於補充了1mg/ml BSA的TL-HEPES中接觸離子黴素(5μM；CalBiochem，La Jolla，CA)4分鐘，然後用補充了30mg/ml BSA的TL-HEPES洗5分鐘經過離子黴素處理，NT單位也暴露於2mM的DMAP(Sigma)。洗滌後，將NT單位轉移到一滴含有2mM的DMAP(Sigma)的CRlaa培養基中，於38.5℃、5％CO2培養4至5小時。洗滌胚胎並將其置於含有鼠胚胎成纖維細胞鋪滿飼餵層的4孔板中，其中加入了含10％FCS和6mg/ml BSA的CRlaa培養基。將NT單位於38.5℃、5％CO2再培養3天。每3天更換培養基直到活化後5至8天。此時胚泡期NT胚胎可用於製備轉基因CICM(培養的內細胞群)細胞系或胎兒。這些NT單位的內細胞群可被分離並置於飼餵層中。NT單位也可被轉移進雌性受體。妊娠第35天流產。這導致兩種克隆的轉基因胎兒在所有被檢測的組織中具有β-GEO基因。因此，這是一種快速而簡單的製備CICM細胞系和胎兒的方法。此方法一般適合於CICM細胞系和胎兒的基因打靶。
下表概述了這些實驗的結果<
>*19個細胞係為β-GEO陽性，2個為陰性，1個在PCR檢查之前死亡。+一個胚兒死亡，另一個在妊娠後第35天發育略遲緩。在第38天得到的兩個胎兒為正常。全部胎兒均證實轉基因。
實施例2衍生自轉基因CICM細胞的嵌合胎兒。此轉基因CICM細胞系最初衍生自轉基因NT單位(分化的細胞)用衍生自轉基因NT胚胎(一株轉移入去核卵母細胞的CL-1細胞)的CICM細胞系製備嵌合胚胎和胎兒。用1-5mg/ml鏈黴蛋白酶或0.05％胰蛋白酶/EDTA加上機械解聚方法進行轉基因CICM細胞集落的解聚，以得到5個或更少細胞的團塊。通過用30至100％的胎牛血清多次洗滌細胞可滅活胰蛋白酶或鏈黴蛋白酶活性。將解聚的細胞置於含有TL-HEPES培養基的顯微操作板上。受精的胚胎也被置於板上，並用顯微操作裝置製備嵌合胚胎。將8至10個轉基因CICM細胞注射入8-16細胞期的受精胚胎，體外培養這些胚胎至胚泡期，然後轉移入受體動物。
共將6個胚泡期嵌合胚胎用非外科方法轉移入兩隻受體動物。妊娠5周後得到3個胎兒，此3個胎兒的幾種組織，包括生殖腺的生殖細胞(提示種系嵌合體)通過PCR擴增和將擴增產物與β-半乳糖苷酶片段進行Southern印記雜交來進行篩選。此3個胎兒中，2個為來自於轉基因CICM細胞的陽性個體。兩個胎兒的性腺均具有轉基因CICM。衍生自轉基因CICM細胞系的轉基因NT胚胎。轉基因CICM細胞系最初衍生自一個轉基因NT單位(分化的細胞)用相同轉基因CICM細胞系製備NT胚胎。採用實施例1描述的NT操作步驟，區別在於用CICM細胞代替成纖維細胞作為供體細胞與去核卵母細胞融合。用1-5mg/ml鏈黴蛋白酶或0.05％胰蛋白酶/EDTA加上機械解聚方法進行轉基因CICM細胞集落的解聚，以得到5個或更少細胞的團塊。在將細胞轉移入去核卵母細胞之前用30至100％的胎牛血清多次洗滌細胞以滅活胰蛋白酶或鏈黴蛋白酶。結果見表1(第3組)。得到了5個胚泡期的胚胎。
權利要求
1.一種克隆哺乳動物的方法，包括(i)在適合於核轉移(NT)單位形成的條件下，將所需的分化哺乳動物細胞或細胞核插入與該分化的細胞或細胞核屬於相同種類的去核哺乳動物卵母細胞；(ii)活化得到的核轉移單位；(iii)培養該活化的核轉移單位直到超過兩細胞發育期；並且(iv)將該培養的NT單位轉移進宿主哺乳動物，以使NT單位發育成為胎兒。
2.根據權利要求1的方法，其還包括將胎兒培養為後代。
3.根據權利要求1的方法，其中目的DNA在所述分化的哺乳動物細胞或細胞核中被插入、移出或被修飾，因此得到遺傳改變的NT單位。
4.根據權利要求3的方法，其還包括將胎兒培養為後代。
5.根據權利要求1的方法，其中分化的哺乳動物細胞或細胞核衍生自中胚層。
6.根據權利要求1的方法，其中分化的哺乳動物細胞或細胞核衍生自外胚層。
7.根據權利要求1的方法，其中分化的哺乳動物細胞或細胞核衍生自內胚層。
8.根據權利要求1的方法，其中分化的哺乳動物細胞或細胞核為成纖維細胞或細胞核。
9.根據權利要求1的方法，其中分化的哺乳動物細胞或細胞核來自有蹄類動物。
10.根據權利要求9的方法，其中有蹄類動物選自牛、綿羊、豬、馬、山羊和水牛。
11.根據權利要求1的方法，其中分化的哺乳動物細胞或細胞核為成年細胞或細胞核。
12.根據權利要求1的方法，其中分化的哺乳動物細胞或細胞核為胚胎細胞或胎兒細胞或細胞核。
13.根據權利要求1的方法，其中去核卵母細胞在去核前已經成熟。
14.根據權利要求1的方法，其中融合的核轉移單位通過接觸離子黴素和6-二甲氨基嘌呤而被活化。
15.根據權利要求3的方法，其中用顯微注射注入異源DNA。
16.根據權利要求3的方法，其中用電穿孔注入異源DNA。
17.一種根據權利要求1的方法得到的胎兒。
18.一種根據權利要求2的方法得到的後代。
19.一種根據權利要求18的後代的後代。
20.一種根據權利要求3的方法得到的轉基因胎兒。
21.一種根據權利要求4的方法得到的轉基因後代。
22.一種根據權利要求21的後代的後代。
23.根據權利要求1的方法，其還包括將克隆NT單位與受精胚胎結合以得到嵌合胚胎。
24.根據權利要求23的方法，其還包括將胎兒培養成為後代。
25.一種根據權利要求23的方法獲得的胎兒。
26.一種根據權利要求24的方法獲得的後代。
27.一種根據權利要求26的哺乳動物的後代。
28.一種製備CICM細胞系的方法，包括(i)在適合於核轉移(NT)單位形成的條件下，將所需的分化哺乳動物細胞或細胞核插入與該分化的細胞或細胞核屬於相同種類的去核哺乳動物卵母細胞；(ii)活化得到的核轉移單位；(iii)培養該活化的核轉移單位直到超過兩細胞發育期；並且(iv)培養獲自該培養的NT單位的細胞以得到CICM細胞系。
29.一種根據權利要求28的方法獲得的CICM細胞系。
30.根據權利要求28的方法，其中目的DNA在該分化的哺乳動物細胞或細胞核中被插入、移出或被修飾，因此導致產生遺傳改變的NT單位。
31.一種根據權利要求30獲得的轉基因CICM細胞系。
32.權利要求28的方法，其中得到的CICM細胞系被誘導至分化。
33.按照權利要求32的方法得到的分化細胞。
34.按照權利要求32的方法得到的人分化細胞。
35.一種治療方法，包括將根據權利要求34的同基因系分化細胞施予需要進行細胞移植治療的患者。
36.權利要求35的方法，其中所述細胞移植治療能有效地治療選自帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默氏病、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發性硬化、肌營養不良、囊性纖維化、肝臟疾病、糖尿病、心臟病、軟骨缺陷或損傷、燒傷、足部潰瘍、血管病、泌尿道疾病、愛滋病和癌症的病症。
37.一種治療方法，其包括將根據權利要求33的異基因分化細胞施予需要進行細胞移植治療的患者。
38.根據權利要求37的方法，其中異基因分化的細胞是牛細胞。
39.權利要求37的方法，其中所述細胞移植治療能有效地治療選自帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默氏病、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發性硬化、肌營養不良、囊性纖維化、肝臟疾病、糖尿病、心臟病、軟骨缺陷或損傷、燒傷、足部潰瘍、血管病、泌尿道疾病、愛滋病和癌症的病症。
40.權利要求35的方法，其中所述分化的人細胞是造血細胞或神經細胞。
41.權利要求35的方法，其中的治療是用於治療帕金森氏病，並且分化的細胞是神經細胞。
42.權利要求35的方法，其中的治療是用於治療癌症，並且分化的細胞是造血細胞。
43.一種治療方法，包括將獲自根據權利要求17的胎兒的異基因細胞施予需要進行細胞移植治療的人類患者。
44.根據權利要求43的方法，其中異基因細胞是牛細胞。
45.權利要求43的方法，其中所述細胞移植治療能有效地治療選自帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默氏病、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發性硬化、肌營養不良、囊性纖維化、肝臟疾病、糖尿病、心臟病、軟骨缺陷或損傷、燒傷、足部潰瘍、血管病、泌尿道疾病、愛滋病和癌症的病症。
46.一種治療方法，包括將獲自根據權利要求18後代的異基因細胞施予需要進行細胞移植治療的人類患者。
47.根據權利要求46的方法，其中異基因細胞是牛細胞。
48.權利要求46的方法，其中所述細胞移植治療能有效地治療選自帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默氏病、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發性硬化、肌營養不良、囊性纖維化、肝臟疾病、糖尿病、心臟病、軟骨缺陷或損傷、燒傷、足部潰瘍、血管病、泌尿道疾病、愛滋病和癌症的病症。
49.一種治療方法，包括將獲自根據權利要求20的轉基因胎兒的異基因轉基因細胞施予需要進行細胞移植治療的人類患者。
50.根據權利要求49的方法，其中異基因轉基因細胞是牛細胞。
51權利要求49的方法，其中所述細胞移植治療能有效地治療選自帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默氏病、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發性硬化、肌營養不良、囊性纖維化、肝臟疾病、糖尿病、心臟病、軟骨缺陷或損傷、燒傷、足部潰瘍、血管病、泌尿道疾病、愛滋病和癌症的病症。
52.一種治療方法，包括將獲自根據權利要求21的轉基因後代的異基因轉基因細胞施予需要進行細胞移植治療的人類患者。
53.根據權利要求52的方法，其中異基因轉基因細胞是牛細胞。
54.權利要求52的方法，其中所述細胞移植治療能有效地治療選自帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默氏病、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發性硬化、肌營養不良、囊性纖維化、肝臟疾病、糖尿病、心臟病、軟骨缺陷或損傷、燒傷、足部潰瘍、血管病、泌尿道疾病、愛滋病和癌症的病症。
55.根據權利要求28的方法，其還包括將克隆NT單位與受精胚胎結合以得到嵌合體。
56.根據權利要求55的方法，其還包括將嵌合CICM細胞系培養成為嵌合胚胎。
57.一種根據權利要求56獲得的嵌合胚胎。
58.根據權利要求56的方法，其還包括將嵌合胚胎培養成為嵌合胎兒。
59.一種根據權利要求58獲得的嵌合胎兒。
60.根據權利要求58的方法，其還包括將嵌合胎兒培養成為嵌合後代。
61.一種根據權利要求60獲得的嵌合後代。
62.根據權利要求55的方法，其中目的DNA在該分化的哺乳動物細胞或細胞核中被插入、移出或被修飾，因此導致遺傳改變的NT單位產生。
63.根據權利要求62的方法，其還包括將嵌合CICM細胞系培養成為嵌合胚胎。
64.一種根據權利要求63獲得的嵌合胚胎。
65.根據權利要求63的方法，其還包括將嵌合胚胎培養成為嵌合胎兒。
66.一種根據權利要求65獲得的嵌合胎兒。
67.根據權利要求65的方法，其還包括將嵌合胎兒培養成為嵌合後代。
68.一種根據權利要求67獲得的嵌合後代。
69.一種克隆哺乳動物的方法，包括(i)在適合於核轉移(NT)單位形成的條件下，將所需的分化CICM細胞或細胞核插入與該分化的CICM細胞或細胞核屬於相同種類的去核哺乳動物卵母細胞；(ii)活化得到的核轉移單位；(iii)培養該活化的核轉移單位直到超過兩細胞發育期；並且(iv)將該培養的NT單位轉移進哺乳動物宿主，以使NT單位發育成為胎兒。
70.根據權利要求69的方法，其還包括將胎兒培養成為後代。
71.一種根據權利要求69的方法獲得的胎兒。
72.一種根據權利要求70的方法獲得的後代。
73.一種獲自根據權利要求18的後代用於器官異種移植的器官。
74.一種獲自根據權利要求21的後代用於器官異種移植的器官。
75.一種獲自根據權利要求26的後代用於器官異種移植的器官。
76.一種獲自根據權利要求68的後代用於器官異種移植的器官。
77.一種獲自根據權利要求72的後代用於器官異種移植的器官。
全文摘要
提供了一種改進了的核轉移方法,其涉及將供體分化的細胞核轉移到與供體細胞屬於相同種類的去核卵母細胞中。獲得的核轉移單位可以通過產生胎兒和後代用於基因型和轉基因基因型的增殖,並可用於製備同基因系CICM細胞,包括人類同基因系胚胎或幹細胞。由於供體核的分化細胞來源可以進行遺傳修飾和克隆增殖,可用本方法促進基因工程的或轉基因的哺乳動物胚胎、胎兒和後代的產生。
文檔編號A61P9/00GK1248288SQ9880279
公開日2000年3月22日 申請日期1998年1月5日 優先權日1997年1月10日
發明者S·L·絲泰斯, J·西伯利, J·羅布, P·高魯克, F·A·旁絲德萊昂, D·J·傑裡 申請人:麻薩諸塞大學，麻薩諸塞州高等教育公立研究所