以紅糖為碳源明串珠菌發酵產甘露醇的方法
2023-06-14 15:22:06 3
以紅糖為碳源明串珠菌發酵產甘露醇的方法
【專利摘要】本發明公開了一種以紅糖為碳源明串珠菌發酵產甘露醇的方法，涉及微生物發酵工藝，該培養基的配方為紅糖19～21克、酵母浸粉1.9～2.1克、乙酸鈉5克、磷酸氫二鉀2克、檸檬酸銨2克，溶於1000ml水中；250ml三角瓶中分裝50ml培養基後滅菌；活化好的明串珠菌菌種以1%接菌量加入到培養基中，於30℃120轉/分振蕩養16～18小時；培養液經10000轉/分離心10分鐘，去除沉澱(菌體)，往上清液中加入等量的乙醇，經12000轉/分離心15分鐘，去除沉澱(葡聚糖)，將上清液在4℃結晶而獲得甘露醇；從而有效地降低了培養基的成本。
【專利說明】以紅糖為碳源明串珠菌發酵產甘露醇的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及發酵生產甘露醇【技術領域】，具體地說是涉及以紅糖為碳源製備培養基以及應用該培養基通過明串珠菌發酵產甘露醇的方法。
【背景技術】
[0002]甘露醇被廣泛的應用於醫藥、食品、化工和電子等行業。全球甘露醇消費量約佔多元醇總量的11%，每年約為15萬噸。美國是甘露醇的最大消費國。其它如歐洲國家，用於生產口香糖、口含片、嘴嚼片的用量均較大。我國目前甘露醇消費主要是直接用於生產甘露醇注射液、藥品輔助添加劑和無糖型食品添加劑等。由於食品行業尤其是口香糖對甘露醇需求量快速增加，甘露醇市場容量迅速擴大。甘露醇在醫藥行業用量較大，目前我國僅甘露醇注射液每年就要消耗甘露醇4500噸，2003年醫藥行業消費甘露醇5600噸。近年來我國肥胖和糖尿病較為嚴重，而且有越來越嚴重的趨勢，因此對無糖並具有營養的甜味劑甘露醇需求潛力巨大，2004年我國食品及其添加劑領域對甘露醇的需求量約3000噸。 [0003]目前生產甘露醇的方法主要有四種:
[0004](I)海藻提取法:提取I噸甘露醇約需13~15噸幹海帶，生產過程產生大量廢水，能耗高，汙染嚴重，收率低；
[0005](2)催化加氫法:以蔗糖或葡萄糖為原料的催化加氫法具有原料來源穩定，生產期限不受限制，成本低，但是其產率較低，且有山梨醇伴生；
[0006](3)酶轉化法:酶法氫化須要在體系中加入價格昂貴的輔酶，不經濟；
[0007](4)微生物發酵法:自然界中能合成甘露醇的微生物種類較多，細菌、酵母和黴菌中都有一些菌株具有產甘露醇的能力。在乳酸菌轉化甘露醇的過程中，甘露醇為主要產物，同時產乳酸、乙酸、乙醇和二氧化碳，而不產生其它多元醇等副產物，因而易於純化分離及精製，並且條件溫和、轉化率較高。同時乳酸菌是一種相對安全的菌種，用乳酸菌來生產甘露醇的研究有著明顯的優勢。目前，微生物發酵法處於實驗室研究階段。
【發明內容】
[0008]本發明的目的是針對現有技術中存在的技術缺陷，而提供一種以紅糖為碳源的製備培養基和明串珠菌應用該培養基發酵產甘露醇的方法；該培養基是根據紅糖的成分改進MRS培養基而製成的，降低了培養基的成本，縮短了發酵時間，從而克服了微生物發酵法生產甘露醇的瓶頸問題。
[0009]本發明解決該技術問題所採用的技術方案是:以紅糖為碳源明串珠菌發酵產甘露醇的方法，其特徵在於具體步驟如下:
[0010](I)以紅糖為碳源製備培養基:
[0011](1.1)準備原料
[0012]準確稱取紅糖19~21克、酵母浸粉1.9~2.1克、乙酸鈉5克、磷酸氫二鉀2克、檸檬酸銨2克備用；[0013](1.2)調配與溶化
[0014]磁力攪拌器上放置裝300ml水的燒杯，將步驟(1.1)稱取的原料加入到燒杯的水中，充分溶化後補加700ml水，即製成培養基；
[0015](1.3)分裝與滅菌
[0016]在250ml三角瓶中加入步驟(1.2)製備的培養基50ml後封口，置於高壓滅菌鍋中121°C滅菌20分鐘；
[0017](2)明串珠菌發酵產甘露醇
[0018](2.1)活化菌種
[0019]將明串珠菌以1%接菌量加入到50ml三角瓶內的IOml MRS培養基中，振蕩培養12~16小時；所述明串珠菌的分類命名為腸膜明串珠菌，拉丁文學名是Leuconostocmesenteroides,保藏人與2009年12月31日交由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC )進行保藏，保藏單位根據保藏人的申請於2013年9月18日出具存活證明。
[0020](2.2)接菌
[0021]在超淨工作檯將步驟(2.1)活化好的菌種以1%接菌量加入到步驟(1.3)滅菌後的250ml三角瓶內的50ml培養基中 ；
[0022](2.3)培養
[0023]將步驟(2.2)接菌後的三角瓶置於搖床中，在30°C下以120轉/分的速度振蕩培養16~18小時,得培養液；
[0024](2.4分離純化
[0025]將步驟(2.3)製得的培養液經10000轉/分離心10分鐘，去除菌體沉澱得上清液A ;在上清液A中加入等量的乙醇，經12000轉/分離心15分鐘，去除葡聚糖沉澱得上清液B，將上清液B在4°C結晶即製得甘露醇。
[0026]上述步驟(2)中明串珠菌發酵產甘露醇的工藝中，所用到的試劑由供應商提供，成分均是公知的；所涉及到的設備和工藝操作方法均為本【技術領域】技術人員所公知的。需要說明的，本發明所用的明串珠菌的分類命名為腸膜明串珠菌，拉丁文學名是Leuconostocmesenteroides ;保藏日期為2009年12月31日，保藏單位全稱是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏編號=CGMCCl.10327。
[0027]本發明的有益效果是:
[0028]( I)與海藻提取法、催化加氫法、酶轉化法相比，本發明的特別之處在於:通過乳酸細菌專一性地產生甘露醇這一主產物，因此生產過程是環境友好的，符合產業發展方向；
[0029](2)與現有微生物發酵法生產甘露醇的技術相比，本發明的以紅糖為碳源明串珠菌發酵產甘露醇的方法與以蔗糖或果糖、葡萄糖為碳源發酵乳酸細菌生產甘露醇的方法相t匕，有效地降低了培養基的成本。這是因為紅糖是從甘蔗或甜菜中粗提的產物，價格較低；蔗糖是高純度的化工原料，蔗糖或果糖、葡萄糖的價格相對要高；相比於現有技術中以蔗糖為原料明串珠菌發酵生產甘露醇的工藝，本發明的原料組成中去除了蛋白腖、酵母浸粉的用量減少很多，因此製備成本便降低很多。
[0030]生物材料保藏說明
[0031]分類命名:腸膜明串珠菌[0032]拉丁文學名:Leuconostocmesenteroides ；
[0033]保藏日期:2009年12月31日
[0034]保藏單位全稱:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0035]保藏單位簡稱:C G M C C
[0036]保藏編號:1.10327
【具體實施方式】
[0037]以下結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
[0038]實施例1
[0039]以紅糖為碳源明串珠菌發酵產甘露醇的方法，其步驟如下。
[0040]第一步，準備原料
[0041]準確稱取紅糖19克、酵母浸粉1.9克、乙酸鈉5克、磷酸氫二鉀2克、檸檬酸銨2克；
[0042]第二步，調配與溶化
[0043]磁力攪拌器上放置裝300ml水的燒杯，按照第一步中準備的原料加入到燒杯的水中，充分溶化後補加700ml水。
[0044]第三步，分裝與滅菌
[0045]250ml三角瓶中加入50ml培養基後封口，置於高壓滅菌鍋中121°C滅菌20分鐘。
[0046]第四步，活化菌種
[0047]於零下80°C冰箱保存的菌種，以1%接菌量加入到50ml三角瓶的IOml MRS培養基中，振蕩培養14小時。
[0048]第五步，接菌
[0049]在超淨工作檯將活化好的菌種以1%接菌量加入到250ml三角瓶的50ml培養基中。
[0050]第六步，培養
[0051]接好菌的三角瓶置於搖床中，於30°C 120轉/分振蕩養18小時。
[0052]第七步，分離純化
[0053]培養液經10000轉/分離心10分鐘，去除沉澱(菌體)，往上清液中加入等量的乙醇，經12000轉/分離心15分鐘，去除沉澱(葡聚糖)，將上清液在4°C結晶而獲得甘露醇。
[0054]實施例2
[0055]以紅糖為碳源明串珠菌發酵產甘露醇的方法，其步驟如下。
[0056]第一步，準備原料
[0057] 準確稱取紅糖21克、酵母浸粉2.1克、乙酸鈉5克、磷酸氫二鉀2克、檸檬酸銨2克。
[0058]第二步，調配與溶化
[0059]磁力攪拌器上放置裝300ml水的燒杯，按照第一步中準備的原料加入到燒杯的水中，充分溶化後補加700ml水。
[0060]第三步，分裝與滅菌[0061]250ml三角瓶中加入50ml培養基後封口，置於高壓滅菌鍋中121°C滅菌20分鐘。
[0062]第四步，活化菌種
[0063]於零下80°C冰箱保存的菌種，以1%接菌量加入到50ml三角瓶的IOml MRS培養基中，振蕩培養13小時。
[0064]第五步，接菌
[0065]在超淨工作檯將活化好的菌種以1%接菌量加入到250ml三角瓶的50ml培養基中。
[0066]第六步，培養
[0067]接好菌的三角瓶置於搖床中，於30°C 120轉/分振蕩養18小時。
[0068]第七步，分離純化
[0069]培養液經10000轉/分離心10分鐘，去除沉澱(菌體)，往上清液中加入等量的乙醇，經12000轉/分離心15分鐘，去除沉澱(葡聚糖)，將上清液在4°C結晶而獲得甘露醇。
[0070]實施例3
[0071]以紅糖為碳源明串珠菌發酵產甘露醇的方法，其步驟如下。
[0072]第一步，準備原料
[0073]準確稱取紅糖20克、酵母浸粉2克、乙酸鈉5克、磷酸氫二鉀2克、檸檬酸銨2克。
[0074]第二步，調配與溶化
[0075]磁力攪拌器上放置裝300ml水的燒杯，按照第一步中準備的原料加入到燒杯的水中，充分溶化後補加700ml水。
[0076]第三步，分裝與滅菌
[0077]250ml三角瓶中加入50ml培養基後封口，置於高壓滅菌鍋中121°C滅菌16分鐘。
[0078]第四步，活化菌種
[0079]於零下80°C冰箱保存的菌種，以1%接菌量加入到50ml三角瓶的IOml MRS培養基中，振蕩培養14小時。
[0080]第五步，接菌
[0081]在超淨工作檯將活化好的菌種以1%接菌量加入到250ml三角瓶的50ml培養基中。
[0082]第六步，培養
[0083]接好菌的三角瓶置於搖床中，於30°C 120轉/分振蕩養18小時。
[0084]第七步，分離純化
[0085]培養液經10000轉/分離心10分鐘，去除沉澱(菌體)，往上清液中加入等量的乙醇，經12000轉/分離心15分鐘，去除沉澱(葡聚糖)，將上清液在4°C結晶而獲得甘露醇。
[0086]實施例4
[0087]以紅糖為碳源明串珠菌發酵產甘露醇的方法，其步驟如下。
[0088]第一步，準備原料
[0089]準確稱取紅糖21克、酵母浸粉1.9克、乙酸鈉5克、磷酸氫二鉀2克、檸檬酸銨2克，溶於1000ml水中。
[0090]第二步，調配與溶化
[0091]磁力攪拌器上放置裝300ml水的燒杯，按照第一步中準備的原料加入到燒杯的水中，充分溶化後補加700ml水。
[0092]第三步，分裝與滅菌
[0093]250ml三角瓶中加入50ml培養基後封口，置於高壓滅菌鍋中121°C滅菌20分鐘。
[0094]第四步，活化菌種
[0095]於零下80°C冰箱保存的菌種，以1%接菌量加入到50ml三角瓶的IOml MRS培養基中，振蕩培養15小時。
[0096]第五步，接菌
[0097]在超淨工作檯將活化好的菌種以1%接菌量加入到250ml三角瓶的50ml培養基中。
[0098]第六步，培養
[0099]接好菌的三角瓶置於搖床中，於30°C 120轉/分振蕩養17小時。
[0100]第七步，分離純化
[0101]培養液經10000轉/分離心10分鐘，去除沉澱(菌體)，往上清液中加入等量的乙醇，經12000轉/分離心15分鐘，去除沉澱(葡聚糖)，將上清液在4°C結晶而獲得甘露醇。
[0102]硫酸鎂和硫酸錳是在發酵過程中必需的成分，但本專利中使用了紅糖就不用添加硫酸鎂和硫酸錳，這是因為紅糖中都含有鎂離子和錳離子。經過測定，實施例1-4中發酵所獲得的甘露醇含量如表1所示。
[0103]表1實施例1-4所獲得的甘露醇含量
[0104]
【權利要求】
1.以紅糖為碳源明串珠菌發酵產甘露醇的方法，其特徵在於具體步驟如下: (1)以紅糖為碳源製備培養基: (1.1)準備原料 準確稱取紅糖19~21克、酵母浸粉1.9~2.1克、乙酸鈉5克、磷酸氫二鉀2克、檸檬酸銨2克備用； (1.2)調配與溶化 磁力攪拌器上放置裝300ml水的燒杯，將步驟(1.1)稱取的原料加入到燒杯的水中，充分溶化後補加700ml水，即製成培養基； (1.3)分裝與滅菌 在250ml三角瓶中加入步驟(1.2)製備的培養基50ml後封口，置於高壓滅菌鍋中121°C滅菌20分鐘； (2)明串珠菌發酵產甘露醇 (2.1)活化菌種 將明串珠菌以1%接菌量加入到50ml三角瓶內的IOml MRS培養基中，振蕩培養12~16小時； (2.2)接菌 在超淨工作檯將步驟(2.1)活化好的菌種以1%接菌量加入到步驟(1.3)滅菌後的250ml三角瓶內的50ml培養基中； (2.3)培養 將步驟(2.2)接菌後的三角瓶置於搖床中，在30°C下以120轉/分的速度振蕩培養16~18小時，得培養液； (2.4)分離純化 將步驟(2.3)製得的培養液經10000轉/分離心10分鐘，去除菌體沉澱得上清液A ;在上清液A中加入等量的乙醇，經12000轉/分離心15分鐘，去除葡聚糖沉澱得上清液B，將上清液B在4°C結晶即製得甘露醇。
【文檔編號】C12P7/18GK103667367SQ201310537851
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月1日 優先權日:2013年11月1日
【發明者】金紅星 申請人:天津志卓生物科技有限公司