油桐幼葉基因組dna提取方法
2023-06-14 19:02:01
專利名稱：油桐幼葉基因組dna提取方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學實驗中植物基因組DNA分離提取技術，尤其涉及一種油桐幼葉基因組DNA提取方法。
背景技術：
基因組DNA的提取是分子生物學實驗很重要的一個環節。基因組DNA的質量和產量，直接影響分子生物實驗中與DNA有關的後續實驗的進行。藥用植物、芳香族植物及木本植物富含次生代謝產物；對這一類富含次生代謝產物的植物，傳統的DNA提取方法不易提到高質量的基因組DNA。這類植物葉片內次生代謝產物的種類極其複雜，且不同物種間甚至同一物種間不同季節，不同葉齡的葉片間次生代謝產物的異質性程度都較高；因此，一種植物的基因組DNA提取方法往往不能很好地應用於另一種植物基因組DNA的提取。油桐原產於中國，具有極高的工業價值。從油桐桐果中提取的桐油是我國傳統的大宗出口創匯物資。在我國，桐油主要用於油墨和塗料的生產。現今，能源危機不斷加劇， 環境問題日益嚴重，對可持續的新型清潔能源的需求迫在眉睫。油桐被選為能源植物物種， 從油桐果實中提取的桐油可作為生產生物柴油的原料。因此用先進的分子生物學手段深入的研究油桐資源將對選育高產品種以及將桐油轉化為生物柴油提供理論依據和技術支持。 目前油桐資源分子方面的研究還處於起步階段，提取高質量高產量的油桐基因組DNA是開展一系列後續分子生物學實驗的基礎。油桐葉片富含多糖、單寧、蛋白及多酚類物質，這些次生代謝產物影響油桐基因組DNA的提取。而物種間次生代謝產物的異質性致使其它物種基因組DNA的提取方法並不是油桐基因組DNA的最佳提取方法。研究發現油桐葉片的葉齡影響油桐基因組DNA的提取。經檢索，到目前為止，現有技術中還沒有專門針對油桐幼葉基因組DNA提取方法的報導。
發明內容
本發明的目的就在於克服現有技術存在的缺點和不足，針對油桐幼葉富含多糖、 單寧、多酚及蛋白的特點，提出了一種油桐幼葉基因組DNA提取方法(簡稱方法)。本發明的目的是這樣實現的1、本方法包括下列步驟①將幼葉組織樣品在液氮速凍下磨成細粉後，取0. 3g鮮葉或0. Ig幹樣轉入2mL 離心管中；②加入1. 5mL洗液，充分混勻後，冰中靜止15min，12000rpm離心棄上清液；③重複步驟②兩次後，加入500 μ 1預熱的3% CTAB提取液，充分混勻，65°C水浴 40min ；④12000rpm常溫離心15min，轉移上清液到新的1. 5mL離心管中，加入100 μ 1的 24 1的氯仿-異戊醇，充分混勻後，常溫12000rpm離心15min，抽提1 2次，抽提後的
3上清液轉入新的離心管中，加入兩倍體積的提前預冷到-20°C的100%酒精；放置於_20°C 冰櫃30min，讓DNA沉澱充分析出，將析出的DNA沉澱轉移到含有ImL 70%酒精的1. 5mL離心管中，漂洗1 2次，每次30min，倒幹酒精，待DNA沉澱乾燥後，用100 μ 1的Ta ^充分溶解，並用1μ 1濃度為10μ g/mLRNA酶37°C消化30min，該過程得到的DNA樣品，稱為IstDNA ；⑤對步驟④中轉移上清液後離心管底部的組織樣品，繼續加入500 μ 1的3% CTAB 提取液進行提取，該組織樣共循環提取4次，依此又得到3批次DNA樣品，分別稱為2ndDNA、 3rdDNA 和 4thDNA。所述100%酒精是指純的酒精溶液。所述70%酒精是指70mL純酒精用無菌純淨水定容到IOOmL的酒精溶液。本發明所提取的多批次DNA樣品中，高生長溫度下(30-37°C )採集的未低溫儲存幼葉IstDNAJndDNAdrfDNA和4thDNA產量較高，濃度大致為300 800ng/μ 1之間。本發明所提取的多批次DNA樣品中，長久低溫儲存及低生長溫度下採集的幼葉 IstDNA產量低，純度差，水浴後可棄掉離心產生的上清液，直接進行後續的3次DNA的提取； 而2η< )ΝΑ、3^ΝΑ，4^ΝΑ產量高，濃度大致為100 700ng/μ 1之間。本發明所使用的洗液的成分為50mM Tris-HCl,5mM EDTA，350mM山梨醇，2% PVP，
0.5%β-巰基乙醇，PH值為8.0。所述的2%是指 2g/100mL，所述的 0. 5%是指 0. 5mL/100mL。本發明所使用的3% CTAB 提取液成分為3% CTAB, IOOmM Tris-HCl, 20mM EDTA,
1.4M NaCl, 2% PVP, 0. 5% β _ 巰基乙醇，ρΗ 值為 8. 0。所述的3%是指3g/100mL，所述的2%是指2g/100mL，所述的0. 5%是指 0. 5mL/100mL。本發明所使用的TaiE 成分為=IOmM Tris-HCl,0. ImM EDTA，pH 8. O0工作原理油桐幼葉中富含的次生代謝產物，例如多糖、單寧、多酚等在DNA提取過程中與DNA共分離或抑制DNA的提取等。在用3% CTAB提取液裂解細胞前，先用洗液反覆預處理液氮研磨的葉片組織樣，前後共處理3次，可大量除去幹擾DNA分離的次生代謝產物。預處理後的幼葉組織樣加入3% CTAB提取液在65°C下裂解細胞，離心轉移的上清再經過氯仿異戊醇的萃取、酒精的沉澱，得到絮狀的DNA沉澱，最後利用70%乙醇洗滌DNA沉澱，得到第1次DNA沉澱，即lstDNA。而離心轉移上清後位於離心管底部的組織樣可繼續加 3 % CTAB提取液，進行新一輪的DNA提取，依此組織樣共循環提取4次，又得到3批次DNA 樣本。本發明可分離到高質量(少多糖、少多酚、少色素和蛋白質等)、高產量(1份組織樣得到4批次DNA沉澱)的油桐基因組DNA，滿足分子生物學實驗對DNA濃度和質量的要求。2、油桐基因組DNA的鑑定本方法提取的油桐基因組DNA樣品，可經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其濃度和質量。3、本方法的用途本方法可以從油桐幼葉鮮樣和幹樣中提取高產量高質量的基因組DNA。長久低溫儲存狀況下(_70°C )的油桐幼葉和低的生長溫度下(15°C -25°C )採集的油桐幼葉，葉內化學成分發生質的改變，致使本方法四次循環提取中第1次提取得到的基因組DNA產量非常低(瓊脂糖凝膠檢測不到)，純度也差O60/280 <1.8)，而後續三次得到的基因組DNA產量較高，純度好，故組織樣只提取1次的傳統方法較難從長久低溫儲存的油桐幼葉和低的生長溫度下採集的油桐幼葉中提取到高產量和高質量的基因組DNA ；但本方法可克服這種長久低溫儲存和低的生長溫度對幼葉DNA提取的影響，後3次提取能較好地得到高產量高質量的基因組DNA，滿足分子生物學後續實驗對DNA濃度和質量的要求。本發明具有下列優點和積極效果①本方法中的洗液，先後處理油桐幼葉組織樣3次，能有效地去除葉片內富含的多酚、多糖、單寧等次生代謝產物；②本方法中循環提取的步驟是傳統基因組DNA提取方法中所沒有的，1份組織樣可進行4次基因組DNA提取，得到4次基因組DNA樣本，使基因組DNA產量顯著提高；③本方法能從長期低溫(_70°C )儲存的幼葉和低的生長溫度下(15°C -25°C )採集的油桐幼葉中提取到高質量高產量的基因組DNA。本發明適用於油桐幼葉基因組DNA的提取。
圖1是用本方法提取的低溫生長的油桐幼葉混合樣鮮樣基因組DNA的電泳圖片 (11月份，氣溫20°C左右，10個基因型的混合樣)；圖中1、2、3、4分別為lst、2nd、3rf、4thDNA的電泳圖片，設置2個重複。圖2是圖一所述葉片矽膠乾燥處理的情況，設置3個重複。圖3是用本方法提取的高生長溫度下採集的油桐6個基因型幼葉鮮樣基因組DNA 的電泳圖片(7月份，氣溫37°C左右)；圖中1、2、3、4分別為lst、2nd、3rf、4thDNA的電泳圖片，設置2個重複，A、B、C、D、E、 F代表6個基因型。圖4是用本方法提取的低溫儲存1年的高生長溫度下採集的幼葉混合樣基因組 DNA的電泳圖片(7月份，氣溫37°C左右，10個基因型的混合樣)；圖中1、2、3、4分別為lst、2nd、3rf、4thDNA的電泳圖片，設置2個重複。英譯漢UCTAB =Cetyltrimethyl Ammonium Bromide，十六烷基三甲基溴化銨；2、EDTA =Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,乙二胺四乙酸；3, PVP =Polyvinyl Pyrrolidone，聚乙烯吡咯燒酮；4、β -Mercaptoethanol 巰基乙醇。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例詳細說明一、提取方法選取生長溫度20°C左右(11月份)採集的油桐幼葉混合樣鮮樣2份和幹樣3份， 以及氣溫37°C生長溫度下採集的低溫儲存1年的油桐幼葉混合樣2份和未經低溫儲存的油桐6個基因型幼葉鮮樣各兩份，使用本發明方法進行下述19次提取作業①在液氮中將葉片組織樣品充分研磨成粉末，迅速稱取0.3g鮮葉，或0. Ig幹樣， 快速轉移到2mL離心管中。放入-70°C冰箱，待用；
②加入1. 5mL洗液，充分混勻後，冰中靜止15min，12000rpm離心棄上清液；③重複步驟②兩次後，加入500 μ 1預熱的3% CTAB提取液，充分混勻，65°C水浴 40min ；④12000rpm常溫離心15min，轉移上清液到新的1. 5mL離心管中，加入100 μ 1的 24 1的氯仿-異戊醇，充分混勻後，常溫12000rpm離心15min，抽提2次，抽提後的上清液轉入新的離心管中，加入兩倍體積的提前預冷到_20°C的100%酒精；放置於-20°C冰櫃 30min,讓DNA沉澱充分析出，將析出的DNA沉澱轉移到含有ImL 70%酒精的1. 5mL離心管中，漂洗2次，每次30min，倒幹酒精，待DNA沉澱乾燥後，用100 μ 1的Ta ^充分溶解，並用 1 μ 1濃度為10 μ g/mL RNA酶37°C消化30min，該過程得到的DNA樣品，稱為IstDNA ；⑤對步驟④中轉移上清液後離心管下部的組織樣品，繼續加預熱的CTAB提取液， 充分混勻，進行新一輪的DNA提取步驟，這個過程中得到的DNA樣品為2ndDNA，依此循環又得到 3rfDNA 和 4thDNA。二、瓊脂糖凝膠電泳法檢測本方法提取的油桐幼葉基因組DNA如圖1，本方法對11月份氣溫20°C左右採集的油桐幼葉鮮樣提取的4次DNA， IstDNA在瓊脂糖上沒有檢測到條帶，2nd、3rd、4thDNA均檢測到清晰且明亮的電泳條帶。說明本方法適合低溫度下生長的油桐幼葉鮮葉基因組DNA的提取。如圖2，本方法對11月份氣溫20°C左右採集的油桐幼葉經矽膠乾燥後提取的4次 DNA，lstDNA在瓊脂糖上沒有檢測到條帶，2nd、3rd、4thDNA均檢測到清晰且明亮電泳條帶。說明本方法適合低溫度下生長的油桐幼葉幹樣基因組DNA的提取。如圖3，本方法對來自7月份的未經低溫儲存的油桐6個基因型幼葉鮮樣提取的4 次DNAastJndJnUthDNA均檢測到清晰且明亮電泳條帶。和圖1、圖2相比，不同點在於6 個基因型的IstDNA均檢測到清晰明亮的電泳條帶。說明油桐幼葉內次生代謝產物隨生長溫度的降低表現出明顯的異質性，對基因組DNA的提取造成明顯的影響。進一步說明本方法適合不同溫度下生長的油桐幼葉DNA的提取。如圖4，本方法對儲存1年的7月份幼葉混合樣提取的4批次基因組DNA，IstDNA在瓊脂糖上沒有檢測到條帶，而2ndDNA，3rfDNA，4thDNA均檢測到清晰且明亮電泳條帶。和圖3 相比，不同點在於來自7月份的油桐幼葉儲存1年後，IstDNA在瓊脂糖凝膠上沒有檢測到條帶。說明低溫長時間儲存可能導致油桐幼葉內次生代謝產物成分發生變化，與未儲存前表現出明顯的異質性，對DNA的提取造成明顯的影響。進一步說明本方法適合低溫長時間儲存條件下的油桐幼葉基因組DNA的提取。圖1至圖4，綜合分析，可看到如果採用傳統基因組DNA提取方法，組織樣只進行1 次提取，對長久儲存的油桐幼葉、生長溫度較低採集的油桐幼葉提取基因組DNA，得到的基因組DNA產量可能很低。而用本發明方法，能夠極大的提高油桐幼葉基因組DNA的產量，還可克服不同環境下油桐幼葉葉片間化學成分異質性對DNA提取的影響，拓寬了用於油桐基因組DNA提取的幼葉範圍。三、紫外分光光度計法檢測本方法提取的油桐幼葉基因組DNA的質量和產量以本方法提取的低生長溫度下採集的幼葉4批次基因組DNA為例，用紫外分光光度計(型號為Ultrospec 1100)檢測其質量和產量。分別測定4批次DNA在波長260納米和280納米的吸光值，並計算A260/A^0比值，結果見下表
權利要求
1.一種油桐幼葉基因組DNA提取方法，其特徵在於包括下列步驟①將幼葉組織樣品在液氮速凍下磨成細粉後，取0.3g鮮葉或0. Ig幹樣轉入2mL離心管中；②加入1.5mL洗液，充分混勻後，冰中靜止15min，12000rpm離心棄上清液；③重複步驟②兩次後，加入500μ 1預熱的3% CTAB提取液，充分混勻，65 °C水浴 40min ；④12000rpm常溫離心15min，轉移上清液到新的1.5mL離心管中，加入100μ 1的 24 1的氯仿-異戊醇，充分混勻後，常溫12000rpm離心15min，抽提1 2次，抽提後的上清液轉入新的離心管中，加入兩倍體積的提前預冷到_20°C的100%酒精；放置於-20°C 冰櫃30min，讓DNA沉澱充分析出，將析出的DNA沉澱轉移到含有ImL 70%酒精的1. 5mL離心管中，漂洗1 2次，每次30min，倒幹酒精，待DNA沉澱乾燥後，用100 μ 1的Ta ^充分溶解，並用1μ 1濃度為10μ g/mLRNA酶37°C消化30min，該過程得到的DNA樣品，稱為IstDNA ；⑤對步驟④中轉移上清液後離心管底部的組織樣品，繼續加入500μ 1的3% CTAB提取液進行提取，該組織樣共循環提取4次，依此又得到3批次DNA樣品，分別稱為2ndDNA、3IdDNA 和 4thDNA。
2.按權利要求1所述的一種油桐幼葉基因組DNA提取方法，其特徵在於所述的洗液的成分為50mM Tris-HCl,5mM EDTA，350mM 山梨醇，2% PVP，0. 5% β-巰基乙醇，PH值為8.0。
3.按權利要求1所述的一種油桐幼葉基因組DNA提取方法，其特徵在於所述的 3% CTAB 提取液成分為3% CTAB, IOOmM Tris-HCl, 20mM EDTA, 1. 4MNaCl,2% PVP,0. 5% β-巰基乙醇，ρΗ值為8.0。
4.按權利要求1所述的一種油桐幼葉基因組DNA提取方法，其特徵在於 所述的 Tci lE 成分為10mM Tris-HCl,0. ImM EDTA, pH 8. 0。
全文摘要
本發明公開了一種油桐幼葉基因組DNA提取方法，涉及分子生物學實驗中植物基因組DNA分離提取技術。本方法主要包括預處理葉片組織樣、細胞的破碎、非DNA成分的抽提、DNA的析出、離子的去除和組織樣品的循環提取。本發明使用洗液預處理油桐幼葉組織樣3次，能有效地去除葉片內富含的蛋白、多酚、多糖等次生代謝產物；本發明對油桐幼葉組織樣進行循環提取，該步驟在傳統基因組DNA提取方法中是不存在的，本方法1份組織樣可進行4次基因組DNA提取，使基因組DNA產量顯著提高；本發明能從長期低溫儲存的幼葉中，以及不同生長溫度下採集的新鮮幼葉中提取到高產量和高質量的基因組DNA。本發明適用於油桐幼葉基因組DNA的提取。
文檔編號C12N15/10GK102424822SQ20111045353
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月30日 優先權日2011年12月30日
發明者張玲玲, 彭俊華 申請人:中國科學院武漢植物園