確定二氫嘧啶脫氫酶基因表達的方法
2023-06-13 23:18:21 2
專利名稱：確定二氫嘧啶脫氫酶基因表達的方法
技術領域：
本發明涉及有效用於醫學，特別是癌症化療中的預測方法。本發明也涉及評估患者中的腫瘤細胞的基因表達。更具體地，本發明涉及寡核苷酸和方法，包括它們在使用RT-PCR檢測二氫嘧啶脫氫酶(DPD)mRNA表達中的用途。
背景技術：
當正常細胞經歷致癌性轉化並成為惡性細胞時癌症發生。轉化的(惡性)細胞逃離可規定細胞表型並抑制細胞增殖的正常生理控制。個體機體中的轉化細胞因此在沒有這些正常控制的情況下增殖，形成腫瘤。
當發現腫瘤時，臨床目標是選擇性破壞惡性細胞，同時減少對進行治療的個體的正常細胞的損害。化療方案是以對癌細胞具有選擇毒性(細胞毒性)的藥物的使用為基礎的。人們已經研製出了很多類化療藥物，包括幹擾核酸合成，蛋白合成，及其它重要代謝過程的藥物。
5-氟尿嘧啶(5-FU)是一種在許多不同的癌症類型，包括如胃腸道和乳腺的主要癌症中廣泛使用的藥物(Moertel，C.G. New Engl.J.Med.，3301136-1142，1994)。5-FU在40多年中一直是結直腸癌標準一線治療的單一試劑，但最近被5-FU和CPT-11的聯合替代為「護理標準」(Saltz等，Irinotecan Study Group.New EnglandJournal of Medicine，343905-14，2000)。5-FU和奧沙利鉑的聯合在結直腸癌中產生了高有效率(Raymond等，Semin.Oncol.254-12，1998)。因此，很可能5-FU將在許多年中用於癌症治療，因為它仍然是當前化療方案中的核心成分。此外，單獨的5-FU治療仍然用於一些患者，5-FU與CPT-11或奧沙利鉑的聯合對這些患者特別具有毒性。
5-FU是大多數抗癌藥中最典型的，因為只有少數患者對治療產生有利的反應。大量的隨機化臨床試驗證明，轉移性結直腸癌患者對作為單一試劑的5-FU的總體腫瘤反應率為15-25％(Moertel，C.G.New Engl.J.Med.，3301136-1142，1994)。與上述其它化療聯合時，對基於5-FU的方案的腫瘤反應率為約40％。然而，大多數受治療的患者沒有從接受基於5-FU的化療中得到明顯的益處，並且經歷了顯著的危險、不適和花費大量開支。由於目前還沒有可靠的在治療前預測個體腫瘤對治療的反應的方法，標準的臨床實踐是讓所有患者接受5-FU治療，發現大多數患者的結果不滿意。
為了鑑定藥物的抗腫瘤活性的最重要生化決定因素，一直在廣泛研究5-FU的活性和代謝途徑。最終的目的是通過a)調節5-FU的細胞內代謝和生化以及b)通過在治療前測量患者中的反應決定性因素以預測哪些患者最可能反應(或不反應)於藥物，從而改進5-FU的臨床有效性。這些研究中得到了兩個主要的決定因素1)5-FU的靶酶，胸苷酸合成酶(TS)的特性和2)5-FU代謝酶，二氫嘧啶脫氫酶(DPD)的特性。
對基於5-FU的治療的腫瘤反應預測領域的第一個研究是對其在結直腸癌中的靶酶，胸苷酸合成酶(TS)進行的。Leichman等(Leichman等，J.Clin Oncol.，153223-3229，1997)進行了一項前瞻性臨床試驗，用於在腫瘤對5-FU的反應和TS基因的表達之間建立聯繫，這是通過RT-PCR在結直腸癌的預治療活檢物中測定的。該研究表明1)在這些腫瘤中TS基因表達水平有大的50倍範圍；和2)反應和無反應腫瘤的TS基因表達水平之間具有顯著差異。反應組TS水平的範圍(0.5-4.1×10-3，相對於內部對照)窄於無反應組的範圍(1.6-23.0×10-3，相對於內部對照)。研究者確定了所得到的TS表達的「無反應截斷值」域水平，在該水平之上僅有無反應者。這樣，TS表達水平高於該「無反應截斷值」域的患者可以在治療前被陽性鑑定為無反應者。「無反應」分類包括所有腫瘤縮小＜50％，進展性生長導致腫瘤增加＞25％和非進展性腫瘤縮小＜50％，無改變或增加＜25％。這些腫瘤具有最高的TS水平。因此，高TS表達特別鑑定了具有抗性的腫瘤。TS表達水平高於某域值鑑定為對5-FU無反應的腫瘤亞型，而TS表達低於該數值的腫瘤預測具有稍高的反應率。
隨後的研究調查了DPD表達水平與TS表達水平聯合作為對5-FU治療的腫瘤反應決定因素的用途。DPD是一種減少5-FU的5，6雙鍵，使其作為細胞毒性劑而無活性的分解代謝酶。以前的研究表明，正常組織中的DPD水平可以影響5-FU的生物利用度，從而調節其藥代動力學和抗腫瘤活性(Harris等，Cancer Res.，50197-201，1990)。此外，已經提出了腫瘤中DPD水平與對5-FU的敏感性相關的證據(Etienne等，J.Clin.Oncol.，131663-1670，1995；Beck等，Eur.J.Cancer，301517-1522，1994)。Salonga等(Clin Cancer Res.，61322-1327，2000，在此引入其全文作為參考)研究了在已經確定了TS表達的一組腫瘤中作為5-FU/甲醯四氫葉酸治療的腫瘤反應決定因素的DPD基因表達。至於TS，與無反應腫瘤(0.2-16×10-3，80倍；相當於內部對照)相比，反應的腫瘤中DPD表達的範圍相對窄(0.6-2.5×10-3，4.2倍；相對於內部對照)。此外，反應的腫瘤中DPD表達水平都不超過約2.5×10-3的域值水平。此外，DPD和TS表達水平表現出彼此不相關，表明它們是獨立調節的基因。在TS和DPD表達水平都低於各自的「無反應截斷」域值水平的腫瘤組中，92％反應於5-FU/LV。因此，可以根據DPD和TS的低表達水平鑑定反應的腫瘤。
DPD也是5-FU毒性的重要標記。也發現進行基於5-FU的治療的具有非常低DPD水平(如在DPD缺陷症候群，即胸腺嘧啶尿嘧啶尿症)的患者受到了威脅生命的毒性的影響(Lyss等，Cancer Invest.，112390240，1993)。實際上，DPD水平在5-FU治療中的重要性得到了很大程度的說明，因為5-FU和抗病毒化合物索利夫定之間的不利的藥物相互作用使19名日本人死亡(Diasio等，Br.J.Clin.Pharmacol.46，1-4，1998)。隨後發現索利夫定的代謝物是DPD的強抑制劑。該治療導致DPD缺陷症候群樣DPD水平降低，這增加了5-FU對患者的毒性(Diasio等，Br.J.Clin.Pharmacol.46，1-4，1998)。
因此，由於a)5-FU方案在癌症治療中的廣泛用途，b)DPD表達在預測腫瘤對5-FU的反應的重要作用和c)DPD-缺陷症候群個體對常用的基於5-FU治療的敏感性，很明確在化療前進行DPD的準確確定將為癌症患者提供重要的益處。
測量DPD酶活性要求含活性酶的新鮮組織的顯著量。不利的是，大多數治療前腫瘤活檢物僅僅作為固定的石蠟包埋的(FPE)組織，特別是不含活性酶的福馬林固定的石蠟包埋的組織而得到。而且，活檢物一般只含有非常少量的非均質組織。
可以用RT-PCR引物和探針分析冷凍組織或新鮮組織中的DPD表達。然而，這些引物不適用於通過RT-PCR從固定組織中對DPD mRNA定量。目前存在的引物沒有得到結果或得到不穩定的結果。這被認為是由於以下原因a)DPD RNA本身水平低；b)石蠟中包埋的組織量非常小；和c)在石蠟中將RNA降解為＜100bp的小片。因此，其它的研究者進行了一致的，但不成功的嘗試，以獲得允許在石蠟包埋的組織中對DPD表達定量的寡核苷酸引物組。因此，需要從固定的組織中對DPD mRNA定量的方法，以便提供對預定的癌症治療的早期預後。因為已經證明DPD酶活性和相應mRNA表達水平相關性很好(Ishikawa等，Clin.Cancer Res.，5883-889，1999；Johnson等，Analyt.Biochem.278175-184，2000)，測量FPE標本中DPD mRNA表達提供了評估患者DPD表達水平狀態而不需要確定新鮮組織中酶活性的途徑。此外，FPE標本容易進行顯微解剖，因此可以在沒有被基質組織汙染的腫瘤組織中確定DPD基因表達。
因此，本發明的目的是通過檢測患者腫瘤細胞中DPD mRNA的量，並把它與預定的閾表達水平進行比較，而提供一種評估組織中DPD的水平，並預測患者腫瘤對基於5-FU的治療的可能抗性的方法。
發明內容
本發明的一方面提供了具有DPD3A-51F(SEQ ID NO1)或DPD3A-134R(SEQ ID NO2)的序列的寡核苷酸引物，以及寡核苷酸引物DPD3b-651F(SEQ ID NO7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO8)和與其基本相同的序列。本發明還提供了具有在嚴格條件下與DPD3A-51F(SEQ IDNO1)，DPD3A-134R(SEQ ID NO2)，DPD3b-651F(SEQ ID NO7)，DPD3b-736R(SEQ ID NO8)或其互補序列雜交的序列的寡核苷酸引物。
而且，本發明涉及一種確定化療方案的方法，包括從腫瘤標本中分離RNA；測定樣品中DPD的基因表達水平；把測定的DPD基因表達水平與該基因的預定閾水平進行比較；根據測定的DPD基因表達水平和預定閾水平的比較結果確定化療方案。
本發明還涉及一種標準化組織樣品中相對於內部對照基因的DPD的未校正基因表達(UGE)的方法，其中所述組織樣品是使用TaqMan技術分析的，所述方法是相對於樣品的內部對照，對已知的ERCC1表達水平進行分析而進行的。
圖1表示比較四對不同的寡核苷酸引物擴增來自10個不同的福馬林-FPE樣品的DPD mRNA的能力。樣品#1-5和#8-10來自於結腸腫瘤活檢物，#6來自於支氣管肺泡腫瘤活檢物，#7來自於小腸腫瘤活檢物。寡核苷酸引物對DPD1(DPD-70F，(SEQ ID NO3)和DPD-201R，(SEQ ID NO4))，DPD2(DPD2p-1129F，(SEQ ID NO5)和DPD2p-1208R，(SEQ ID NO6))對於測量這些樣品中的DPD mRNA水平無效。寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2))和DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO8))對於確定這些樣品中的DPD mRNA水平有效。
圖2表示比較寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2))和DPD1(DPD-70F，(SEQ ID NO3)和DPD-201R，(SEQ ID NO4))在冷凍組織樣品中的DPD mRNA擴增效率。該圖表示，寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2))不僅在測量冷凍組織樣品(以及FPE來源的樣品)中DPD表達水平中有效，而且比寡核苷酸引物對DPD1(DPD-70F，(SEQ ID NO3)和DPD-201R，(SEQ ID NO4))更有效。
圖3是舉例說明如何計算相對於內部對照基因的DPD表達的圖表。所述圖表包括用兩種試驗樣品獲得的數據，(未知1和2)，並舉例說明如何測定未校正基因的表達數據(UGE)UCG。該圖表還舉例說明了如何利用TaqMan儀器，採用以前公開的DPD值標準化所產生的UGE。這是通過用UGE乘以校正因子KDPD完成的。圖中的內部對照基因是β-肌動蛋白，校準RNA是來自Applied Biosystems的Universal PERNA，目錄號4307281，批號3617812014。
圖4是表示每種組織學類型標本中相對的校正DPD表達水平的柱狀圖。該柱狀圖表示第25和第75百分位(四分位之間)範圍。平均值表示為每個柱中的水平條。柱上面的橫線表示第25和第75百分位之外，但排除了離群值的水平。
具體實施例方式
本發明人公開了允許準確評估組織中DPD表達的寡核苷酸引物和基本與其相同的寡核苷酸引物。這些寡核苷酸引物，DPD3a-51F(SEQID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2)(也稱作寡核苷酸引物對DPD3A)和寡核苷酸引物DPD3b-651F(SEQ ID NO7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO8)(也稱作寡核苷酸引物對3B)在用於測定固定的石蠟包埋的(FPE)腫瘤標本中的DPD基因表達時特別有效。
此處針對核酸而使用的「基本相同的」表示在嚴格條件下與靶雜交的寡核苷酸，以及在具有適當的核苷酸插入和缺失的條件下進行適當比對時，在核苷酸的至少約60％，典型地至少約70％，更典型地至少約80％，通常至少約90％，更通常至少約95-98％的核苷酸中相同的核酸片段或其互補鏈。當雜交比總的特異性更具有選擇性時，存在選擇性雜交。見，Kanehisa，Nucleic Acids Res.，12203-213(1984)。
本發明包括在嚴格條件下(如此處所定義)與寡核苷酸引物序列DPD3A-51F(SEQ ID NO1)，其互補序列，DPD3A-134R(SEQ ID NO2)或其互補序列的全部或一部分雜交的基本相同的寡核苷酸。此外，本發明還包括在嚴格條件下(如此處所定義)與寡核苷酸引物序列DPD3b-651F(SEQ ID NO7)，其互補序列，DPD3b-736R(SEQ ID NO8)或其互補序列的全部或一部分雜交的基本相同的寡核苷酸。
在嚴格的雜交條件下，只有高度互補的，即，與此處所定義的基本上相似的核酸序列才能進行雜交。優選，這種條件會阻礙20個連續核苷酸中有4個或更多錯配，更優選20個連續核苷酸中有2個或更多錯配，最優選20個相連核苷酸中有1個或更多錯配的核酸進行雜交。
核酸的雜交部分通常至少約為10個(例如，15個)核苷酸長。雜交核酸進行雜交的部分與寡核苷酸引物序列DPD3A-51F(SEQ IDNO1)，其互補序列，DPD3A-134R(SEQ ID NO2)或其互補序列的全部或一部分至少約80％，優選至少約95％，或最優選至少約98％相同。此外，雜交核酸進行雜交的部分與寡核苷酸引物序列DPD3b-651F(SEQ ID NO7)，其互補序列，DPD3b-736R(SEQ ID NO8)或其互補序列的全部或一部分至少約80％，優選至少約95％，或最優選至少約98％相同。
寡核苷酸引物與核酸樣品在嚴格條件下的雜交在下面規定。核酸雙鏈體或雜交體的穩定性是以解鏈溫度(Tm)表示的，它是探針從靶DNA解離下來的溫度。解鏈溫度可用於限定所需的嚴格條件。如果所要鑑定的序列與探針基本上相同，而不是相同，那麼它可首先用於確定最低溫度，在最低溫度時，只有使用特殊濃度的鹽(例如，SSC或SSPE)才能進行同源雜交。然後，假定1％錯配導致Tm降低1℃，那麼雜交反應的最終洗滌溫度因此降低(例如，如果找到與探針的同一性＞95％的序列，那麼最終的洗滌溫度降低5℃)。實際上，Tm在0.5℃-1.5℃/1％錯配之間變化。
嚴格條件包括約68℃時，在5xSSC/5xDenhart’s溶液/1.0％SDS中雜交，室溫時，在0.2xSSC/0.1％SDS中洗滌。中度的嚴格條件包括約42℃時，在3xSSC中洗滌。改變鹽濃度和溫度參數，可在引物和靶核酸之間獲得最佳的同一性水平。有關這種條件的其它指導可在本領域中很容易地得到，例如，Sambrook，Fischer和Maniatis，MolecularCloning，a laboratory manual，(2nded.)，Cold Spring HarborLaboratory Press，NewYork，(1989)和F.M.Ausubel等編輯，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons(1994)。
本發明的這方面涉及使用從FPE標本可靠地提取RNA的方法，以及其次通過使用用於進行逆轉錄酶聚合酶鏈反應的寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2))或與其基本相同的寡核苷酸和DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO8))或與其基本相同的寡核苷酸而確定標本中DPD mRNA的含量。通過如1999年12月20日提交的美國專利申請No.09/469,338的描述通過任何從樣品中分離mRNA的方法從FPE細胞提取RNA，在此全文引入作為參考。
本發明的寡核苷酸引物允許評估固定的石蠟包埋(FPE)組織中的DPD表達(圖1)。此外，本發明的寡核苷酸引物可以準確測定新鮮或冷凍組織中的DPD表達水平，即它們對其靶RNA具有高特異性。因此，本發明的方法不限於使用石蠟包埋組織。此處公開的寡核苷酸引物能夠允許準確評估固定的石蠟包埋組織，以及冷凍或新鮮組織中的DPD基因表達(圖2)。這是由於來源於FPE樣品中的mRNA相對於新鮮或冷凍組織中的mRNA更成片段，因此更難以定量。因此，本發明提供了適用於測定FPE組織DPD表達水平的寡核苷酸引物，而以前沒有適當的測定方法。見圖1。
DPD mRNA的表達與基於5-FU的化療的臨床抗性相關。具體地，高水平DPD mRNA表達與基於5-FU的化療的抗性相關。
本發明的方法適用於各種腫瘤類型。它可製備個體「腫瘤表達分布」，由此在個體患者的樣品中測定DPD的表達水平，並預測對各種化療的反應。本發明的方法最優選用於支氣管肺泡、小腸或結腸腫瘤。對於將本發明的一些實施方案用於特定的腫瘤類型，優選證明DPD基因表達水平與存活力之間的關係，這是通過編輯在特定DPD表達和對基於5-FU的化療的臨床抗性之間建立聯繫的數據組而進行的。
本發明可以用於任何組織類型。例如，為了檢驗腫瘤組織的抗性，需要檢驗腫瘤組織。優選地，需要檢驗來自於獲得腫瘤的患者的正常組織的一部分。正常組織抗基於5-FU的化療化合物，但腫瘤組織預計對所述化合物敏感的患者可以然後接受較高量的化療組合物的治療。
本發明的方法包括從患者的腫瘤獲得細胞樣品的步驟。實體或淋巴瘤或其一部分是通過手術從患者切除下來的。如果不能在切除後立即從組織樣品中提取RNA，然後可以固定或冷凍樣品。然後可以用其獲得RNA。從冷凍或新鮮腫瘤樣品中分離出來的RNA是通過本領域任何一種典型的方法從細胞中提取出來的，例如Sambrook，Fischer和Maniatis，Molecular Cloning，a laboratory manual，(2nded.)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，NewYork，(1989)。優選在提取過程中，注意避免RNA降解。
或者，患者的組織可以被固定，例如，通常用福馬林(甲醛)或gluteraldehyde固定。本發明也通過醇浸漬而固定生物樣品。通常是使固定的生物樣品脫水，並將其包埋在石蠟或本領域那些技術人員已知的其它固體支持物中。將包埋固定組織的固體支持物設計為可用有機溶劑除去，隨後使保存的組織再水合。此處描述的固定和石蠟包埋(FPE)組織標本是指可以儲存並歸檔的組織樣品。
RNA是通過1999年12月20日提交的美國專利申請US 09/469,338中描述的任何一種方法從FPE細胞中提取出來的，所述專利申請全部引入此處作為參考。最優選地，從福馬林固定和石蠟包埋的組織標本中從腫瘤細胞提取RNA。
在本發明的一個優選實施方案中，RNA可從存檔的病理樣品或活檢樣品中分離出來，其首先脫石蠟。代表性的脫石蠟方法包括用有機溶劑，如二甲苯洗滌石蠟包埋的樣品。脫石蠟樣品還可用低級醇的水溶液再水合。適宜的低級醇包括，例如甲醇，乙醇，丙醇和丁醇。脫石蠟樣品可用逐漸降低濃度的低級醇溶液連續洗滌而再水合。可選擇地，樣品可同時脫石蠟和再水合。
一旦樣品再水合，從再水合組織中提取RNA。可利用機械，聲波或其它勻化工具勻化脫石蠟的樣品。在一個有效實施方案中，再水合的樣品可在含有離液劑，如硫氰酸胍(也可作為異硫氰酸胍銷售)的溶液中勻化。
「有效濃度的離液劑」的選擇是指從石蠟包埋的樣品中純化的RNA量比沒有離液劑情況下分離出來的RNA量高大約10倍。離液劑包括，如，胍化合物，脲，甲醯胺，碘化鉀，硫氰酸鉀及類似的化合物。本發明方法的優選離液劑是胍化合物，如異硫氰酸胍(也作為硫氰酸胍銷售)和鹽酸胍。很多陰平衡離子都是有用的，本領域的技術人員可用這種適宜的陰離子製備多種胍鹽。本發明所用胍溶液的有效濃度通常約為1-5M，優選約4M。如果RNA已存在於溶液中，那麼胍溶液的濃度可以更高，這樣，樣品中獲得的最終濃度約為1-5M。優選用適當的生化緩衝液，如Tris-HCl把胍溶液緩衝至pH約3-6，更優選約4。離液溶液還可含有還原劑，如二硫蘇糖醇(DTT)和β-巰基乙醇(BME)。離液溶液還可含有RNA酶抑制劑。
將離液溶液中的勻化樣品加熱至約50-約100℃，所述離液溶液含有有效量的離液劑，如胍化合物。優選的離液劑是硫氰酸胍。
然後通過苯酚-氯仿萃取，離子交換色譜或大小排阻色譜回收離液溶液中的RNA。然後，利用提取，電泳，層析，沉澱技術或其它適宜技術進一步純化RNA。
DPD mRNA的定量優選使用本領域常用的逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)進行，其中所述DPD mRNA來源於新鮮，冷凍，或固定組織的純化總mRNA。定量DPD mRNA的其它方法包括，例如，使用多重PCR中所用的分子指標和其它標記探針。此外，本發明還利用沒有PCR的系統測量DPD的mRNA，其中沒有PCR的系統使用的是與Invader測定(Third Wave Technologies，Inc.)中使用的探針相似的螢光標記探針。最優選，DPDcDNA及內部對照或管家基因(例如，β-肌動蛋白)的定量是利用基於螢光的實時檢測法(ABIPRISM 7700或7900Sequence Detection System[TaqMan]，Applied Biosystems，FosterCity，CA.)或與Heid等(Genome Res 1996；6986-994)和Gibson等(Genome Res 1996；6995-1001)所述相似的系統進行的。ABI7700(TaqManInstrument)的輸出量是以Ct’s或「循環閾」表示的。使用TaqMan系統，樣品中具有較高數量靶分子的高水平表達基因產生一種信號，並且PCR循環(較低的Ct)比具有較少靶分子(較高的Ct)的低水平相對表達的基因要少。
本發明部分在於以下發現，即DPD mRNA的相對量與對化療劑5-FU的抗性相關。此處發現，表達高水平DPD mRNA的腫瘤可能抗5-FU。相反，表達低DPD mRNA量的腫瘤可能對5-FU敏感。通過比較患者的腫瘤DPD mRNA的表達與DPD表達的預定域表達水平而判斷患者的腫瘤DPD mRNA的表達。
此處所用「管家」基因或「內部對照」是任何一種組成型或全局型表達基因，它的存在可評估DPD mRNA的水平。這種評估包括測定基因轉錄的總體組成型水平和RNA回收中變異的對照。「管家」基因或「內部對照」包括，但不限制於親環蛋白基因，β-肌動蛋白基因，轉鐵蛋白受體基因，GAPDH基因等。最優選內部對照基因是β-肌動蛋白基因，如Eads等，Cancer Research 1999；592302-2306所述。
RNA回收中變異的對照需要使用「校準RNA」。「校準RNA」可以是任何一種可得到的精確預定量的對照RNA。優選使用來自AppliedBiosystems的Universal PE RNA，目錄號4307281，批號3617812014。
此處所用「未校正基因表達(UGE)」是指由TaqMan儀器產生的相對於內部對照基因的DPD表達的數字輸出。用於確定UGE的公式在實施例4中表示，並用圖3樣品計算結果舉例說明。
本發明另一方面提供一種標準化未校正基因表達(UGE)值的方法，所述未校正基因表達(UGE)值是利用源於非-TaqMan技術的「已知相對基因表達」值，從TaqMan儀器獲得的。優選，由Salonga等，Clinical Cancer Research，61322-1327，2000(在此全文引入作為參考)以前公開的源於非-TaqMan的相對DPDβ-肌動蛋白表達值是用源於組織樣品的DPD UGE值標準化的。
此處所用「校正的相對DPD表達」是指標準化的DPD表達，UGE乘以DPD特異性校正因子(KDPD)得到一個值，該值可與DPD相對於內部對照基因的已知表達水平範圍相比較。圖3詳細說明了這些計算結果。
「以前公開的」相對基因表達是以靶基因的RT-PCR信號與組成型表達的基因(β-肌動蛋白)的比值為基礎的。在Pre-TaqMan技術研究中，PCR反應進行固定的循環數(即，30次)，並報告每份樣品的終點值。然後按照DPD表達與β-肌動蛋白表達的比值報導這些值。Salonga等，Clinical Cancer Research，61322-1327，2000，在此全文引入作為參考。
此處定義的DPD表達的「預定閾水平」是一種DPD表達水平，當高於此水平時，腫瘤可能對基於鉑的化療方案有抗性。表達水平低於該域值的腫瘤可能對基於鉑的化療方案敏感。相對DPD表達在反應於基於5-FU的化療方案的腫瘤中的範圍為低於約0.6×10-3-2.5×10-3(約4.2倍範圍)。不反應於基於5-FU的化療方案的腫瘤的相對DPD表達為約0.2×10-3-16×10-3(約4.2倍範圍)。如果相對DPD表達高於約2.0×10-3，優選高於約2.5×10-3，腫瘤一般不反應於5-FU治療。這些腫瘤值允許確定特定樣品的「校正的相對DPD表達」是高於還是低於「預定閾水平」。校正的相對DPD表達水平的閾值是約2.0×10-3-2.5×10-3。
本發明的方法可適於各種組織和腫瘤類型，可用於評估患者的臨床治療，並作為各種癌症，包括乳腺癌，頭頸癌，肺癌，食管癌，結腸直腸癌等的診斷或預後工具。在優選實施方案中，本發明的方法適於支氣管肺泡癌、小腸癌或結腸癌。
根據在腫瘤中表達DPD mRNA的量的測量，本領域的實施者可以進行關於腫瘤對基於5-FU的化療的腫瘤的臨床抗性。「基於5-FU的化療」包括給予5-FU，其衍生物，單獨給藥或與其它化療劑，如亞葉酸或DPD抑制劑，如尿嘧啶、5-乙炔基尿嘧啶、溴乙烯基尿嘧啶、胸腺嘧啶、苄氧基苄基尿嘧啶(BBU)或5-氯-2，4-二羥基吡啶聯合給藥。此外，已經發現，與5-FU或其衍生物與DPD抑制劑5-乙炔基尿嘧啶的聯合相比，式(I)的5』-脫氧胞嘧啶衍生物與5-FU或其衍生物的共同給藥顯著改進化療劑向腫瘤組織的選擇性遞送，並且在人癌症異種移植物模型中表現出抗腫瘤活性的顯著改進。
上面描述了本發明，本發明的實際操作是通過下面給出的實驗性實施例舉例說明的。技術人員應認識到說明實施例中使用的材料和方法可以各種方式進行改進。這種改進也被認為落在本發明的範圍之內。
實施例實施例1從FPE組織中分離RNARNA是通過下列一般過程從石蠟包埋組織中提取出來的。
A.切片的脫石蠟和水合(1)把約10μM的切片的一部分放在1.5mL塑料離心管中。
(2)加入600μL二甲苯，室溫(約20-25℃)用力振搖混合物約10分鐘。
(3)室溫時，以臺式離心機的最大速度(約10-20,000xg)將樣品離心約7分鐘。
(4)重複步驟2和3，直到絕大部分石蠟溶解。根據原始樣品部分所含的石蠟量，通常需要重複2次或更多次。
(5)用低級醇，優選用100％乙醇(約600μL)用力振搖約3分鐘，除去二甲苯溶液。
(6)按照步驟(3)將試管離心約7分鐘。傾出並棄去上清液。顆粒狀物變為白色。
(7)用更稀釋的乙醇溶液首先用約95％乙醇，然後用約80％乙醇，最後用約70％乙醇連續重複步驟5和6。
(8)按照步驟(3)，室溫將樣品離心7分鐘。棄去上清液，室溫乾燥顆粒狀物約5分鐘。
B.用苯酚-氯仿分離RNA(1)加入400μL含0.5％肌氨酸的異硫氰酸胍溶液和8μL二硫蘇糖醇。
(2)然後用組織勻漿器(Ultra-Turrax，IKA-Works，Inc.，Wilmington，NC)勻化樣品約2-3分鐘，速度從低速(速度1)到高速(速度5)逐漸升高。
(3)然後將樣品在大約95℃時加熱約5-20分鐘。優選在加熱到95℃之前，用細針刺入含樣品的試管的管帽。可選擇地，管帽可用塑料夾子或實驗用薄膜固定。
(4)然後用pH4.0的50μL 2M醋酸鈉和600μL苯酚/氯仿/異戊醇(10∶1.93∶0.036)萃取樣品，其中苯酚/氯仿/異戊醇(10∶1.93∶0.036)是用18mL苯酚和3.6mL 1∶49的異戊醇∶氯仿溶液新製備的。用力振搖溶液約10秒，然後在冰上冷卻約15分鐘。
(5)以最大速度將溶液離心約7分鐘。將上層的(水)相轉移到一個新的試管中。
(6)-20℃時，用約10μL糖原和400μL異丙醇沉澱RNA30分鐘。
(7)通過在臺式離心機中以最大速度離心約7分鐘，而使RNA成為顆粒狀物；傾出並棄去上清液；用大約500μL約70-75％的乙醇洗滌顆粒狀物。
(8)以最大速度將樣品再次離心7分鐘。棄去上清液，並將顆粒狀物風乾。然後將顆粒狀物溶解在適宜的緩衝液中，用於進一步的實驗(例如，50pL 5mM Tris氯化物，pH8.0)。
實施例2mRNA的逆轉錄和PCR逆轉錄如實施例1中舉例說明和1999年12月20日提交的美國專利申請US09/469,338中的描述(全文引入此處作為參考)，RNA是從顯微解剖或非-顯微解剖的福馬林固定的石蠟包埋(FPE)組織中分離出來的。用乙醇沉澱並離心後，將RNA顆粒狀物溶解在50μLpH8.0的5mM Tris/Cl中。所得RNA是隨機的六聚體和來源於LifeTechnologies的M-MLV(目錄號28025-02)逆轉錄的。逆轉錄是通過把25μL RNA溶液與25.5μL「逆轉錄混合物」混合進行的(見下文)。將反應物放在熱循環儀中，26℃時8分鐘(用於使隨機的六聚體與RNA結合)，42℃時45分鐘(用於M-MLV逆轉錄酶促反應)，95℃時5分鐘(用於DNA酶的熱滅活)。
「逆轉錄混合物」由以下成分組成10μl 5X緩衝液(250mMTris-HCl，pH8.3，375mM KCl，15mM MgCl2)，0.5μl隨機的六聚體(500.D.溶解在550μl，pH7.5的10mM Tris-HCl中)，5μl 10mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)，5μl 0.1M DTT，1.25μl BSA(在pH7.5的10mMTris-HCL中為3mg/ml)，1.25μl RNA Guard24，800U/ml(RNA酶抑制劑)(目錄號27-0816，Amersham Pharmacia)和2.5μl MMLV 200U/μl(Life Tech目錄號28025-02)。
反應組分的最終濃度是50mM Tris-HCl，pH8.3，75mM KCl，3mMMgCl2，1.0mM dNTP，1.0mM DTT，0.00375mg/ml BSA，0.62U/μl RNA Guard和10U/μl MMLV。
mRNA表達的PCR定量。DPD cDNA和內部對照或管家基因(例如β-肌動蛋白，如Eads等，Cancer Research 1999；592302-2306)cDNA的定量是使用Heid等，(Genome Res1996；6986-994)；Gibson等，(Genome Res1996；6995-1001)所述的基於螢光的實時檢測法(ABIPRISM 7700或7900序列檢測系統[TaqMan]，Applied Biosystems，FosterCity，CA.)進行的。簡言之，該方法使用一種雙重標記的產螢光TaqMan寡核苷酸探針，(DPD-530Tc(SEQ ID NO3)，Tm＝70℃)，其特異性地在正向和反向引物內退火。含反應混合物的加蓋孔內的雷射刺激引起3』猝滅劑染料(TAMRA)發射，直到探針在PCR延伸過程中被DNA聚合酶的5』-3』核酸酶活性裂解，引起5』報導染料(6FAM)的釋放。因此，擴增子的產生引起螢光信號的發射，這是通過TaqMan’sCCD(電荷耦合器件)檢測照相機檢測的，PCR反應純指數相內，閾循環所產生的信號量可反映目標序列的起始拷貝數。寡核苷酸引物對DPD1(DPD-70F(SEQ ID NO3)和DPD-201R(SEQ ID NO4))的TaqMan探針是DPD-108Tc(SEQ ID NO9)。寡核苷酸引物對DPD2(DPD2p-1129F(SEQ ID NO5)和DPD2p-1208R(SEQ ID NO6))的TaqMan探針是DPD-2p-1154Tc(SEQ ID NO10)。寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2))的TaqMan探針是DPD3A-71Tc(SEQ ID NO11)。寡核苷酸引物對DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO8))的TaqMan探針是DPD3b-685Tc(SEQ ID NO12)。
PCR反應混合物含有來自引物對DPD1(DPD-70F(SEQ ID NO3)和DPD-201R(SEQ ID NO4))；DPD2(DPD2p-1129F(SEQ ID NO5)和DPD2p-1208R(SEQ ID NO6))；DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO7)，Tm＝58℃和DPD3b-736R(SEQ ID NO8)，Tm＝60℃)；或寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)，Tm＝59℃和DPD3a-134R(SEQ IDNO2)，Tm＝59℃)。每一種PCR引物混合物由以下成分組成0.5μl含有cDNA以及600nM僅僅來自於一對(DPD1，DPD2，DPD3或DPD3A)引物的每一種寡核苷酸引物的逆轉錄反應物，200nM相應的TaqMan探針(用於DPD1，DPD2，DPD3或DPD3A)，5U AmpliTaq Gold聚合酶，200μM各dATP，dCTP，dGTP，400μM dTTP，5.5mM MgCl2，和含有參考染料的1xTaqman緩衝液A，最終的體積小於或等於25μl(所有試劑，Applied Biosystems，FosterCity，CA)。循環條件是，95℃10分鐘，然後是95℃15秒和60℃1分鐘循環45次。
實施例3寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2))和DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO8))允許通過RT-PCR，使用從石蠟包埋組織提取的RNA進行強的、可重複的DPD基因表達定量。圖1。寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2))也顯著增加了通過RT-PCR在新鮮的冷凍組織中分析DPD基因表達的敏感性。圖2。按上述實施例2的描述使用ABI Prism 7700序列檢測系統(Taqman)進行。
在PCR反應中使用30個循環。每一個循環由96℃變性1min，55℃退火1min，並且72℃延伸2min組成。用寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2))進行擴增的產物長度是84個鹼基對。擴增產物相當於跨越一部分5』非翻譯區(UTR)並進入外顯子1的DPD cDNA區域。用寡核苷酸引物對DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO8))進行擴增的產物長度是86個鹼基對。擴增產物相當於擴增DPD cDNA的一個相當於外顯子6的區域。
比較了寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2))和DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO7)和DPD3b-736R(SEQ ID NO8))與其它現存的引物組擴增來源於10個不同FPE組織樣品的DPD mRNA的能力。樣品#1-5和#8-10來自於結腸腫瘤活檢物，#6來自於支氣管肺泡腫瘤活檢物，#7來自於小腸腫瘤活檢物。使用的其它寡核苷酸引物對是DPD1(DPD-70F，(SEQID NO3)和DPD-201R，(SEQ ID NO4))和DPD2(DPD2p-1129F(SEQ IDNO5)和DPD2p-1208R(SEQ ID NO6))。
寡核苷酸引物對DPD3A(DPD3a-51F(SEQ ID NO1)和DPD3a-134R(SEQ ID NO2))準確確定各種樣品中的DPD水平中最有效。寡核苷酸引物對DPD3B(DPD3b-651F(SEQ ID NO7)和DPD3b-736R(SEQ IDNO8))也有效，但沒有產生強信號。結果見圖1。
實施例4測定DPD的未校正基因表達(UGE)進行兩對平行反應。「試驗」反應和「校準」反應。圖7。DPD擴增反應和β-肌動蛋白內部對照擴增反應是試驗反應。單獨的DPD和β-肌動蛋白擴增反應是在校準RNA模板上進行的，被稱作校準反應。TaqMan儀器產生4個不同的循環閾(Ct)值試驗反應的CtDPD和Ctβ-肌動蛋白，和校準反應的CtDPD和Ctβ-肌動蛋白。兩種反應的Ct差值是根據下列公式確定的ΔCt試驗＝CtDPD-Ctβ-肌動蛋白(「試驗」反應)ΔCt校準＝CtDPD-Ctβ-肌動蛋白(「校準」反應)下一步是按照下列公式計算2的負ΔCt次方。
2-ΔCt試驗(「試驗」反應)2-ΔCt校準(「校準」反應)為了從TaqMan儀器獲得DPD的未校正基因表達，進行了下列計算DPD的未校基因表達(UGE)＝2-ΔCt試驗/2-ΔCt校準用已知的相對DPD表達水平標準化UGE標準化的計算需要將UGE乘以對DPD和特定校準RNA特異的校正因子(KDPD)。還可測定任何一種內部對照基因和任何一種精確預定量的校準RNA的校正因子KDPD。優選，使用內部對照基因β-肌動蛋白和精確預定量的校準RNA，來自Applied Biosystems的Universal PERNA，目錄號4307281，批號3617812014。
標準化是使用ΔCt方法的改進法進行的，所述ΔCt方法由AppliedBiosystems，TaqMan製造商，在User Bulletin#2中和上文描述。為了進行該過程，使用上述TaqMan方法，分析了6個不同FPE試驗組織的UGE的DPD表達。使用內部對照基因β-肌動蛋白和校準RNA，來自Applied Biosystems的Universal PE RNA，目錄號4307281，批號3617812014。
用以前描述於Salonga等(在此全文引入作為參考)的各樣品L7，L91，L121，L150，L220和L164的相對DPD表達水平(PV)除以其相應的源於TaqMan的UGE，得到不平均的校正因子K。
K不平均的＝PV/UGE接下來，求全部K值的平均值，從而確定對DPD，校準RNA即Universal PE RNA，目錄號4307281，批號3617812014和β-肌動蛋白特異的單一KDPD校正因子。
因此，為了成規模地測定與pre-TaqManDPD表達研究一致的，未知組織樣品中的校正相對DPD表達，人們只需用源於TaqMan儀器的未校正基因表達數據(UGE)乘以KDPD特異性校正因子，前提是使用相同的內部對照基因和校準RNA。
校正的相對DPD表達＝UGE×KDPDKDPD可使用任何一種精確預定量的校準RNA或內部對照基因測定。未來來源的精確預定量RNA可按照上述方法，相對於樣品用已知的相對DPD表達校準或可相對於先前已經校準過的校準RNA，如UniversalPE RNA，目錄號4307281，批號3617812014。校準。
例如，如果隨後測定不同的內部對照基因和/或不同的校準RNA的KDPD，則人們必須相對於組織樣品校準內部對照基因和校準RNA，其中已經測定了相對於特定內部對照基因的DPD表達水平。這種測定可使用本領域熟知的標準pre-TaqMan，定量RT-PCR技術進行。用這些樣品的已知表達水平除以它們相應的UGE水平，可確定樣品的K值。然後根據已知樣品數，求K值的平均值，從而測定對不同內部對照基因和/或校準RNA特異的新KDPD。
實施例5FPE結直腸腫瘤樣品中的DPD表達將上文所述方法用於分析來自34名晚期結直腸癌患者的34個腫瘤樣品。所有患者用靜脈內5-FU/LV聯合方案治療，作為前瞻性多中心歐洲5-FU/CPT11交叉試驗V239的一部分。所有用靜脈內5-FU425mg/m2治療的患者在連續5天內進行15分鐘輸注，也在連續5天內用20mg/m2的亞葉酸進行輸注。該方案作為一線或二線緩解治療。
9名患者(25.5％)反應於5-FU/LV，該反應定義為包括完全反應，部分反應和最小反應的任何反應。具有進展性疾病或穩定疾病的患者分類為無反應者(25名患者，73.5％)。從顯微解剖的FPE預治療腫瘤樣品中分離總mRNA，並且按上文所述用定量PCR測量DPD/β-肌動蛋白的相對mRNA表達水平。
反應和無反應患者組的平均校正DPD/β-肌動蛋白的水平分別是0.87×10-3和2.04×10-3。採用比較兩個獨立樣品組值的秩的Mann-WhitneyU檢驗來比較反應和無反應患者組的校正的相對DPD表達水平。無反應者組中的相對DPD水平與無反應者相比顯著更低(P＝0.02)。這些患者中DPD mRNA表達和對5-FU/LV的反應之間的關聯如圖4所示。這些數據表明，DPD表達是對基於5-FU的化療的反應的預測因子。
序列表110K.D.達南伯格120確定二氫吡啶脫氫酶基因表達的方法13011220/15514009/796,8071412001-03-0214009/842,1111412001-04-2614009/879,2171412001-06-1316012170FastSEQ for Windows Version 4.0210121119212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物4001aggacgcaag gagggtttg 19210221120212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物4002gtccgccgag tccttactga20
210321122212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物4003tcactggcag actcgagact gt 22210421118212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物4004tggccgaagt ggaacaca 18210521122212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物4005ctgcctttga ctgtgcaaca tc 22210621127212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物4006attaacaaag ccttttctga agacgat272107
21123212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物4007gaagcctatt ctgcaaagat tgc23210821121212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物4008gagtacccca atcgagccaa a 21210921125212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物4009ccgccgagtc cttactgagc acagg 252101021125212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物40010cacacggcga gctccacaac gtaga 2521011
21129212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物40011cagtgcctac agtctcgagt ctgccagtg 292101221131212DNA213人工序列220
223寡核苷酸引物40012aaggaagcac aacttatact tgcaggccca g 3權利要求
1.一種確定腫瘤樣品對5-氟尿嘧啶的敏感性的方法，包括(a)從腫瘤樣品分離mRNA；(b)使用一對具有SEQ ID NO1的序列或其互補序列的寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO2的序列或其互補序列的寡核苷酸擴增mRNA，以獲得擴增樣品；(c)測定擴增樣品中二氫嘧啶脫氫酶(DPD)mRNA的量；(d)比較擴增樣品中二氫嘧啶脫氫酶(DPD)mRNA的量與DPD表達的預定閾水平；(e)基於擴增樣品中DPD mRNA的量和DPD基因表達的域水平的差異確定腫瘤樣品對5-氟尿嘧啶的敏感性。
2.權利要求1的方法，其中所述DPD基因表達的預定閾水平是內部對照基因表達水平的約2.0-約2.5倍。
3.權利要求1或2的方法，其中所述內部對照基因是β-肌動蛋白。
4.權利要求3的方法，其中所述腫瘤樣品是固定並包埋的。
5.權利要求3的方法，其中在有效量的離液劑存在下分離mRNA。
全文摘要
本發明涉及有效用於醫學，特別是癌症化療中的預測方法。本發明的目的是通過檢驗患者腫瘤細胞中的DPD mRNA量，並將其與預定的閾表達水平相比而提供一種評估組織中的二氫嘧啶脫氫酶(DPD)表達水平並預測患者的腫瘤對基於5－FU的治療的可能抗性的方法。更具體地，本發明提供寡核苷酸引物對DPD3A和DPD3B，以及包括將它們用於檢測二氫嘧啶脫氫酶(DPD)mRNA水平的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1840697SQ20061000707
公開日2006年10月4日 申請日期2002年2月22日 優先權日2001年3月2日
發明者K·D·達南伯格 申請人:應答遺傳公司