石菖蒲中含氮化合物的製備方法與流程

2023-06-14 18:00:36

本發明涉及石菖蒲中含氮化合物的製備方法。

背景技術：

石菖蒲為天南星科菖蒲屬植物，是一種常用中藥，其根莖入藥。《名醫別錄》記載：「久服聰耳明目，益心智，高智不老」，近年來藥理報導，石菖蒲對小鼠學習和記憶有促進作用，對東莨菪鹼造成的記憶獲得障礙有明顯的改善，可望治療老年痴呆症。

我國石菖蒲植物資源豐富，其化學成分除揮髮油有較多研究外，其餘成分卻很少有報導。僅發現授權專利CN1101812C報導了用石菖蒲經乙醇滲漉，滲漉液依次用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取，提取物採用矽膠，Sephadex LH-20及大孔樹脂等不同填充劑作層析分離得到了三個石菖蒲鹼。目前，未發現從石菖蒲中提取分離醯胺、胍基、胺基酸類等含氮化合物的報導。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是為了克服現有技術不能從石菖蒲中分離提取包括乙醯胺、胍基化合物、半胱氨酸的含氮化合物等缺點，而提供了石菖蒲中含氮化合物新的製備方法。本發明首次從石菖蒲中分離得到了乙醯胺、胍基化合物、半胱氨酸等含氮化合物，所述的乙醯胺(SCP-H-1)、胍基化合物(SCP-H-5和SCP-H-6)的結構式如下所示：

因此，本發明的方案之一是提供了一種石菖蒲中含氮化合物的製備方 法，其包含以下步驟：

(1)將經水提醇沉的石菖蒲藥材提取物的上清液，用大孔吸附樹脂吸附，洗脫樹脂，得洗脫液，即獲得石菖蒲提取物；

(2)將所述的石菖蒲提取物經過經矽膠柱層析，梯度洗脫，通過薄層色譜(TLC)檢測，合併相同比移植(Rf)斑點對應的矽膠柱洗脫液，先後得到5個流分Fr.1～Fr.5；得流分Fr.2，即可；其中TLC檢測的條件如下，展開劑為正丁醇、乙酸和水體積比為4∶1∶1～4∶1∶5的混合溶液；所述的含氮化合物為乙醯胺。

步驟(1)中，所述的石菖蒲藥材為本領域常規用來製備石菖蒲提取物的石菖蒲藥材。所述水提醇沉的方法和條件可參照本領域常規提取石菖蒲提取物的方法和條件。較佳地，將石菖蒲藥材和水混合提取後，收集提取液；向所述提取液中加醇類溶劑，沉降，收集上清液，即為本發明所述的經水提醇沉的石菖蒲藥材提取物的上清液。本發明特別優選以下條件：在所述水提的過程中，水的用量較佳地為石菖蒲質量的6～10倍，更佳地為6～8倍，最佳地為8倍；所述的水提的提取溫度較佳地為90℃～100℃；所述的水提的提取時間較佳地為30～120分鐘，更佳地為60～120分鐘；所述的水提的提取次數較佳地為1～4次，更佳地為2～3次，最佳地為3次。

較佳地，在所述的醇沉之前，將提取液按本領域常規的濃縮方法進行濃縮，如減壓濃縮；較佳地，將所述的提取液濃縮至1mL/1g石菖蒲藥材～2mL/1g石菖蒲藥材為止，更佳地濃縮至1mL/1g石菖蒲藥材，收集濃縮液。

在所述的醇沉的過程中，所述的醇類溶劑為本領域常規的石菖蒲水提醇沉所用醇類溶劑，較佳地為乙醇；所述的乙醇較佳地為95％乙醇，百分數為體積百分數；所述的醇類溶劑的加入量較佳地為在所述的醇類溶劑與所述的濃縮液的混合溶液中，加入至含有65～80％的醇類溶劑，更佳地為含有65～75％的醇類溶劑，百分數均為體積百分數；所述的沉降的時間較佳地為加入醇類溶劑後沉降8～12小時；所述的上清液的收集方法可參照本領域常規方法，如：離心收集上清液。

在步驟(1)所述的石菖蒲提取物的製備方法中，較佳地，將所述的上清液濃縮至幹並和水混合溶解後，再用大孔吸附樹脂吸附。所述的濃縮可按本領域常規的濃縮方法進行操作，如減壓濃縮；所述的水的用量為0.2mL/1g石菖蒲藥材～0.5mL/1g石菖蒲藥材。

所述的用大孔吸附樹脂吸附可參照本領域常規的樹脂吸附方法，本發明特別優選以下條件：所述的大孔吸附樹脂較佳地為D101大孔吸附樹脂，更佳地為D101大孔吸附樹脂柱；所述的D101大孔吸附樹脂柱的徑高比較佳地為1∶4～1∶12，更佳地為1∶8～1∶12；所述的用大孔吸附樹脂吸附的上樣流速較佳地為1～2BV/h，更佳地為1～1.5BV/h。所述的大孔吸附樹脂的用量較佳地為0.5mL樹脂/1g石菖蒲藥材～1mL樹脂/1g石菖蒲藥材，更佳地為0.6mL樹脂/1g石菖蒲藥材。

所述洗脫樹脂的方法和條件可參照本領域常規樹脂洗脫的方法和條件，較佳地，用樹脂洗脫劑洗脫吸附後的大孔吸附樹脂，收集樹脂洗脫液，即可。本發明特別優選以下條件：所述的樹脂洗脫劑較佳地為水，所述樹脂洗脫劑的用量較佳地為4～6倍樹脂體積，更佳地為5倍樹脂體積。

在步驟(1)所述的石菖蒲提取物的製備方法較佳地還包括活性炭吸附步驟：將所述樹脂洗脫液用活性炭吸附，洗脫活性炭，收集活性炭洗脫液，乾燥，即可。

較佳地，在所述的樹脂洗脫液用活性炭吸附之前，將所述的樹脂洗脫液按本領域常規的濃縮方法進行濃縮，如減壓濃縮。較佳地，將樹脂洗脫液濃縮至0.2mL/1g石菖蒲藥材～0.5mL/1g石菖蒲藥材為止。

所述的用活性炭吸附的方法和條件可參照本領域常規活性炭吸附的方法，本發明優選以下條件：所述的活性炭較佳地為活性炭柱，徑高比較佳地為1∶4～1∶12，更佳地為1∶8～1∶12；所述的活性炭吸附的上樣流速較佳地為1～2BV/h，更佳地為1～1.5BV/h。活性炭的用量較佳地為0.5mL活性炭/1g石菖蒲藥材～1mL活性炭/1g石菖蒲藥材，更佳地為0.6mL活性炭/1g石菖蒲藥材。

所述的洗脫活性炭的方法和條件可參照本領域常規洗脫活性炭的方法和條件，較佳地，用不同活性炭洗脫劑依次洗脫吸附後的活性炭，收集活性炭洗脫液，即可。本發明特別優選以下條件：所述的不同活性炭洗脫劑較佳地為水和乙醇水溶液；所述的乙醇水溶液較佳地為體積分數為30％的乙醇水溶液；所述的洗脫活性炭較佳地用所述的水洗脫活性炭後再用所述的乙醇水溶液洗脫活性炭；所述的水的用量較佳地為3～5倍活性炭體積，更佳地為4倍活性炭體積；所述的乙醇水溶液的用量較佳地為3～5倍活性炭體積，更佳地為4倍活性炭體積；所述的收集活性炭洗脫液較佳地收集30％乙醇水溶液的活性炭洗脫液。

所述的乾燥可按本領域常規乾燥方法操作，較佳地為減壓濃縮後乾燥。

步驟(2)中，所述的矽膠柱層析可參照本領域常規的矽膠柱層析的方法和條件進行。所述的梯度洗脫較佳地以乙酸乙酯的甲醇溶液為洗脫劑，初始梯度較佳地為乙酸乙酯與甲醇的體積比為1∶0；最終梯度較佳地乙酸乙酯與甲醇的體積比為0∶1；所述的混合溶液中，正丁醇、乙酸和水體積比較佳地為4∶1∶1；所述的TLC檢測條件還可包括顯色劑為茚三酮試劑。

本發明所述的石菖蒲中含氮化合物的製備方法較佳地還包括步驟(3)：將步驟(2)中獲得的Fr.2流分經十八烷基矽烷鍵合矽膠(ODS)柱層析，洗脫，得到ODS柱洗脫液，經薄層製備，即可。

步驟(3)中，所述的ODS柱層析可參照本領域常規的ODS柱層析的方法和條件進行。所述的洗脫可參照本領域常規的洗脫ODS柱的方法和條件進行，較佳的用水洗脫。所述的薄層製備可參照本領域常規的薄層製備的方法和條件進行，本發明優選以下條件：展開劑為正丁醇、乙酸和水的混合溶液，顯色劑較佳地為碘；所述的混合溶液中正丁醇、乙酸和水體積比較佳地為4∶1∶1～4∶1∶5，更佳地為4∶1∶1。

本發明的方案之二是提供了一種石菖蒲中含氮化合物的製備方法，其包含以下步驟：

(1)將上述的石菖蒲提取物經過經矽膠柱層析，梯度洗脫，通過TLC 檢測，合併相同Rf值斑點對應的矽膠柱洗脫液，先後得到5個流分Fr.1～Fr.5，得Fr.3流分，即可；其中TLC檢測的條件如下，展開劑為正丁醇、乙酸和水的體積比為4∶1∶1～4∶1∶5的混合溶液；

(2)將步驟(1)所述的Fr.3流分經活性炭柱層析，洗脫活性炭柱，得活性炭柱洗脫液，將所述的活性炭柱洗脫液經陽離子交換樹脂吸附，洗脫陽離子交換樹脂，得陽離子減緩樹脂洗脫液，將所述的陽離子交換樹脂洗脫液經薄層製備，即可；

其中，以正丁醇、乙酸和水體積比為4∶1∶1的混合溶液為展開劑的所述含氮化合物的Rf值為0.4。

該含氮化合物具有SCP-H-5結構式所示的結構；較佳地以鹼金屬鹽和/或鹼土金屬鹽的形式存在，例如鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽。

步驟(1)中，所述的矽膠柱層析可參照本領域常規的矽膠柱層析的方法和條件進行。所述的梯度洗脫較佳地以乙酸乙酯的甲醇溶液為洗脫劑，初始梯度較佳地為乙酸乙酯與甲醇的體積比為1∶0；最終梯度較佳地乙酸乙酯與甲醇的體積比為0∶1；所述的混合溶液中，正丁醇、乙酸和水體積比較佳地為4∶1∶1；所述的TLC檢測條件還可包括顯色劑為茚三酮試劑。

步驟(2)中，所述的活性炭柱層析可參照本領域常規的活性炭柱層析的方法和條件進行；所述的洗脫活性炭柱可參照本領域常規的洗脫活性炭柱的方法和條件進行，較佳地用10％-30％乙醇水溶液洗脫，百分數為體積百分數；所述的洗脫陽離子交換樹脂可參照本領域常規的洗脫陽離子交換樹脂的方法和條件進行，較佳地用5％氨水洗脫，百分數為體積百分數。

步驟(2)中，所述的Rf值為特定展開劑下獲得的檢測值；所述的特定展開劑為正丁醇、乙酸和水體積比為4∶1∶1的混合溶液；所述的特定展開劑 僅為檢測時使用的展開劑，並不能因此限制所述的薄層製備中使用的展開劑；所述的薄層製備可參照本領域常規的薄層製備的方法和條件進行，本發明優選以下條件：展開劑為正丁醇、乙酸和水的混合溶液，顯色劑較佳地為碘；所述的混合溶液中正丁醇、乙酸和水體積比較佳地為4∶1∶1～4∶1∶5，更佳地為4∶1∶1。

本發明的方案之三是提供了一種石菖蒲中含氮化合物的製備方法，其包含以下步驟：

(1)將上述的石菖蒲提取物經過經矽膠柱層析，梯度洗脫，通過TLC檢測，合併相同Rf值斑點對應的矽膠柱洗脫液，先後得到5個流分Fr.1～Fr.5，得Fr.3流分，即可；其中TLC檢測的條件如下，展開劑為正丁醇、乙酸和水的體積比為4∶1∶1～4∶1∶5的混合溶液；

(2)將步驟(1)所述的Fr.3流分經活性炭柱層析，洗脫活性炭柱，得活性炭柱洗脫液，將所述的活性炭柱洗脫液經陽離子交換樹脂吸附，洗脫陽離子交換樹脂，得陽離子減緩樹脂洗脫液，將所述的陽離子交換樹脂洗脫液經薄層製備，即可；所述的含氮化合物的結構式如下：

其中，以正丁醇、乙酸和水體積比為4∶1∶1的混合溶液為展開劑的SCP-H-6的Rf值為0.7。

步驟(1)中，所述的矽膠柱層析可參照本領域常規的矽膠柱層析的方法和條件進行。所述的梯度洗脫較佳地以乙酸乙酯的甲醇溶液為洗脫劑，初始梯度較佳地為乙酸乙酯與甲醇的體積比為1∶0；最終梯度較佳地乙酸乙酯與甲醇的體積比為0∶1；所述的混合溶液中，正丁醇、乙酸和水體積比較佳地為4∶1∶1；所述的TLC檢測條件還可包括顯色劑為茚三酮試劑。

步驟(2)中，所述的活性炭柱層析可參照本領域常規的活性炭柱層析 的方法和條件進行；所述的洗脫活性炭柱可參照本領域常規的洗脫活性炭柱的方法和條件進行，較佳地用10％-30％乙醇水溶液洗脫，百分數為體積百分數；所述的洗脫陽離子交換樹脂可參照本領域常規的洗脫陽離子交換樹脂的方法和條件進行，較佳地用5％氨水洗脫，百分數為體積百分數。

步驟(2)中，所述的Rf值為特定展開劑下獲得的檢測值；所述的特定展開劑為正丁醇、乙酸和水體積比為4∶1∶1的混合溶液；所述的特定展開劑僅為檢測時使用的展開劑，並不能因此限制所述的薄層製備中使用的展開劑；所述的薄層製備可參照本領域常規的薄層製備的方法和條件進行，本發明優選以下條件：展開劑為正丁醇、乙酸和水的混合溶液，顯色劑較佳地為碘；所述的混合溶液中正丁醇、乙酸和水體積比較佳地為4∶1∶1～4∶1∶5，更佳地為4∶1∶1。

本發明的方案之四是提供了一種石菖蒲中含氮化合物的製備方法，其包含以下步驟：

(1)將上述的石菖蒲提取物經過經矽膠柱層析，梯度洗脫，通過TLC檢測，合併相同Rf值斑點對應的矽膠柱洗脫液，先後得到5個流分Fr.1～Fr.5；其中TLC檢測的條件如下，展開劑為正丁醇、乙酸和水的體積比為4∶1∶1～4∶1∶5的混合溶液；

(2)將步驟(1)所獲得的Fr.4流分經矽膠柱層析，洗脫，通過TLC檢測，合併相同Rf值斑點對應的矽膠柱洗脫液，先後得到4個流分Fr.4-1～Fr.4-4；將流分Fr.4-4薄層製備，即可獲得所要製備的含氮化合物；其中TLC檢測的條件如下，展開劑為正丁醇、乙酸和水的體積比4∶1∶1～4∶1∶5的混合溶液；所述的含氮化合物為半胱氨酸。

步驟(1)中，所述的矽膠柱層析可參照本領域常規的矽膠柱層析的方法和條件進行。所述的梯度洗脫較佳地以乙酸乙酯的甲醇溶液為洗脫劑，初始梯度較佳地為乙酸乙酯與甲醇的體積比為1∶0；最終梯度較佳地乙酸乙酯與甲醇的體積比為0∶1；所述的混合溶液中，正丁醇、乙酸和水體積比較佳地為4∶1∶1；所述的TLC檢測條件還可包括顯色劑為茚三酮試劑。

步驟(2)中所述的矽膠柱層析可參照本領域常規的柱層析的方法和條件進行。所述的洗脫可參照本領域常規的洗脫方法和條件進行，本發明優選用添加甲酸的正丁醇水溶液洗脫；其中，甲酸的添加量較佳地為正丁醇水溶液體積的0.1％，正丁醇水溶液的濃度較佳地為95％～100％；百分數為體積百分數；所述的混合溶液中，正丁醇、乙酸和水體積比較佳地為4∶1∶1；所述的TLC檢測條件還可包括顯色劑為茚三酮試劑；所述的薄層製備可參照本領域常規的薄層製備的方法和條件進行，本發明優選以下條件：展開劑為正丁醇、乙酸和水的混合溶液，顯色劑較佳地為碘；所述的混合溶液中正丁醇、乙酸和水體積比較佳地為4∶1∶1～4∶1∶5，更佳地為4∶1∶1。

在不違背本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。

本發明所用試劑和原料均市售可得。

本發明的積極進步效果在於：採用本發明的製備方法，首次從石菖蒲中分離得到乙醯胺、胍基化合物、半胱氨酸等含氮類化合物。

附圖說明

圖1為實施例8中所述的SCP-H-8衍生化試劑的液相色譜圖譜。

圖2為實施例8中所述的半胱氨酸衍生化試劑的液相色譜圖譜。

具體實施方式

下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。

實施例1石菖蒲提取物的製備

取石菖蒲藥材3.0kg，加入6倍量水，100℃下提取1小時，提取3次，過濾合併提取液，60℃減壓濃縮至約3L，即濃縮至約1mL/g藥材，加入95％乙醇至乙醇濃度為70％，沉降8h，離心取上清液，濃縮至無醇味，離心取 上清液，濃縮至幹，並加1000mL水使溶解，溶液上D101大孔吸附樹脂，樹脂用量為0.6mL樹脂/1g石菖蒲藥材，即1800mL樹脂，柱徑高比為1∶8，上樣流速為1.0BV/h，上樣結束後，用5BV去離子水洗脫樹脂柱，收集水洗脫液，60℃減壓濃縮至約600mL，冷卻後上活性炭，活性炭柱用量為0.6mL活性炭/1g石菖蒲藥材，即1800mL活性炭柱，柱徑高比為1∶8，上樣流速為1.0BV/h。上樣結束後，先用4BV的去離子水洗脫活性炭柱，棄去水洗脫液，再用4BV的30％乙醇洗脫活性炭柱，收集30％乙醇洗脫液，60℃減壓濃縮，乾燥，即得樣品20.62g，得率約0.69％。

實施例2石菖蒲提取物的製備

取石菖蒲藥材5.0kg，加入8倍量水，100℃下提取1小時，提取3次，過濾合併提取液，60℃減壓濃縮至約5L，即濃縮至1mL/1g藥材，加入95％乙醇至乙醇濃度為70％，沉降12h，離心取上清液，濃縮至無醇味，離心取上清液，濃縮至幹，並加1500mL水使溶解，溶液上D101大孔吸附樹脂，樹脂用量為0.6mL樹脂/1g石菖蒲藥材，即3000mL樹脂柱，柱徑高比為1∶8，上樣流速為1.0BV/h，上樣結束後，用5BV去離子水洗脫樹脂柱，收集水洗脫液，60℃減壓濃縮至約1000mL，冷卻後上活性炭，活性炭柱用量為0.6mL活性炭/1g石菖蒲藥材，即3000mL，柱徑高比為1∶8，上樣流速為1.0BV/h。上樣結束後，先用4BV的去離子水洗脫活性炭柱，棄去水洗脫液，再用4BV的30％乙醇洗脫活性炭柱，收集30％乙醇洗脫液，60℃減壓濃縮，乾燥，即得樣品68.03g，得率約1.36％。

實施例3石菖蒲提取物的製備

取石菖蒲藥材5.0kg，加入10倍量水，95℃下提取0.5小時，提取4次，過濾合併提取液，60℃減壓濃縮至約10L，即濃縮至2mL/1g藥材，加入95％乙醇至乙醇濃度為65％，沉降12h，離心取上清液，濃縮至無醇味，離心取上清液，濃縮至幹，並加2500mL水使溶解，溶液上D101大孔吸附樹脂，樹脂用量為1mL樹脂/1g石菖蒲藥材，即5000mL樹脂柱，柱徑高比為1∶4，上樣流速為2.0BV/h，上樣結束後，用4BV去離子水洗脫樹脂柱，收集水洗 脫液，60℃減壓濃縮至約2500mL，冷卻後上活性炭，活性炭柱用量為1mL活性炭/1g石菖蒲藥材，即5000mL，柱徑高比為1∶4，上樣流速為2.0BV/h。上樣結束後，先用3BV的去離子水洗脫活性炭柱，棄去水洗脫液，再用3BV的30％乙醇洗脫活性炭柱，收集30％乙醇洗脫液，60℃減壓濃縮，乾燥，即得樣品55.26g，得率約1.11％。

實施例4石菖蒲提取物的製備

取石菖蒲藥材3.0kg，加入10倍量水，90℃下提取2小時，提取1次，過濾合併提取液，60℃減壓濃縮至約6L，即濃縮至2mL/1g藥材，加入95％乙醇至乙醇濃度為80％，沉降10h，離心取上清液，濃縮至無醇味，離心取上清液，濃縮至幹，並加900mL水使溶解，溶液上D101大孔吸附樹脂，樹脂用量為0.5mL樹脂/1g石菖蒲藥材，即1500mL樹脂柱，柱徑高比為1∶12，上樣流速為1.5BV/h，上樣結束後，用6BV去離子水洗脫樹脂柱，收集水洗脫液，60℃減壓濃縮至約900mL，冷卻後上活性炭，活性炭柱用量為0.5mL活性炭/1g石菖蒲藥材，即1500mL，柱徑高比為1∶12，上樣流速為1.5BV/h。上樣結束後，先用5BV的去離子水洗脫活性炭柱，棄去水洗脫液，再用5BV的30％乙醇洗脫活性炭柱，收集30％乙醇洗脫液，60℃減壓濃縮，乾燥，即得樣品29.18g，得率約0.97％。

實施例5石菖蒲提取物的製備

取石菖蒲藥材3.0kg，加入6倍量水，100℃下提取2小時，提取2次，過濾合併提取液，60℃減壓濃縮至約3L，即濃縮至1mL/1g藥材，加入95％乙醇至乙醇濃度為75％，沉降12h，離心取上清液，濃縮至無醇味，離心取上清液，濃縮至幹，並加600mL水使溶解，溶液上D101大孔吸附樹脂，樹脂用量為0.7mL樹脂/1g石菖蒲藥材，即2100mL樹脂柱，柱徑高比為1∶8，上樣流速為1BV/h，上樣結束後，用5BV去離子水洗脫樹脂柱，收集水洗脫液，60℃減壓濃縮至約1000mL，冷卻後上活性炭，活性炭柱用量為0.7mL活性炭/1g石菖蒲藥材，即2100mL，柱徑高比為1∶8，上樣流速為1BV/h。上樣結束後，先用5BV的去離子水洗脫活性炭柱，棄去水洗脫液，再用5BV 的30％乙醇洗脫活性炭柱，收集30％乙醇洗脫液，60℃減壓濃縮，乾燥，即得樣品30.09g，得率約1.00％。

實施例6乙醯胺(SCP-H-1)的製備

獲得石菖蒲提取物的方法如實施例2。取提取物8g上矽膠柱層析，以乙酸乙酯∶甲醇(1∶0～0∶1)梯度洗脫，TLC檢測(展開劑：正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1，顯色劑：茚三酮試劑)，合併相同色譜斑點，得到5個Fr.1～Fr.5流分，Fr.2流分經ODS柱層析，得到水洗脫部分，經薄層製備(展開劑：正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1，顯色劑：碘)得化合物SCP-H-1(純度＞95％；15.2mg)。各製備條件中，百分數為體積百分數，比例均為體積比。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：1.64(3H，s，-CH3)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)δ：25.3(-CH3)，176.3(＞CO)。

實施例7胍基化合物(SCP-H-5和SCP-H-6)的製備

獲得石菖蒲提取物的方法如實施例2。取提取物8g上矽膠柱層析，以乙酸乙酯∶甲醇(1∶0-0∶1)梯度洗脫，TLC檢測(展開劑：正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1，顯色劑：茚三酮試劑)，合併相同色譜斑點，得到5個Fr.1～Fr.5流分。Fr.3流分經活性炭柱層析，10％-30％乙醇洗脫，陽離子交換樹脂5％氨水洗脫部分，經薄層製備(展開劑：正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1，顯色劑：碘)得化合物SCP-H-5(純度＞95％；Rf值0.4；1.2mg；)和SCP-H-6(純度＞95％；Rf值0.7；2.4mg)。各製備條件中，百分數為體積百分數，比例均為體積比。其中，SCP-H-5以鹽的形式存在，例如以鈉、鉀或鎂鹽形式存在，1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：7.46(4H，brs，-NH2)。SCP-H-6，1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：13.96(1H，brs，-COOH)，8.39(2H，brs，-NH2)，8.13(1H，brs，-NH)。13C-NMR(100MHz，DMSO-d6)δ：143.2(＞C＝NH)，150.4(＞C＝O)。

實施例8半胱氨酸(SCP-H-8)的製備

獲得石菖蒲提取物的方法如實施例2。取提取物26.38g上矽膠柱層析，以乙酸乙酯∶甲醇(1∶0-0∶1)梯度洗脫，TLC檢測(展開劑：正丁醇∶乙酸∶ 水＝4∶1∶1，顯色劑：茚三酮試劑)，合併相同色譜斑點，得到5個Fr.1～Fr.5流分。其中Fr.4流分合併經矽膠柱層析，水飽和的正丁醇溶液(正丁醇體積分數為95％)+0.1％甲酸洗脫，TLC檢測(展開劑：正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1，顯色劑：茚三酮試劑)，合併相同色譜斑點，得到4個Fr.4-1～Fr.4-4流分。Fr.4-4經薄層製備(展開劑：正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1，顯色劑：碘)得SCP-H-8(純度＞95％；20.0mg)。各製備條件中，百分數為體積百分數，比例均為體積比。

將SCP-H-8與對照品半胱氨酸經HPLC柱前胺基酸衍生化後進行比較。

色譜條件與系統適用性試驗：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以乙腈-30mmol/1醋酸銨溶液(pH7.5)為流動相；柱溫30℃；流速1.0ml/min；檢測波長分別為275nm；按表1進行梯度洗脫。

表1

對照品溶液的製備：準確稱取半胱氨酸標準品，用0.1mol/L的HC1配製成儲備液(每種胺基酸濃度約為1.5mmol/L)。移取50μL儲備液置於2mL具有磨口塞的試管內，加入鄰硝基苯磺醯氯的乙醇溶液(60mmol/L)150μL、硼砂緩衝液(0.05mmoL/L，pH 9.0)1mL，混勻，塞緊後於25℃水浴中衍生反應10min後立即經0.45μm濾膜過濾，即得。

供試品溶液的製備：準確稱取SCP-H-8，用0.1mol/L的HC1配製成儲備液(濃度約為50mg/L)。移取50μL儲備液置於2mL的具塞磨口試管內，加 入鄰硝基苯磺醯氯的乙醇溶液(60mmol/L)150μL、硼砂緩衝液(0.05mmoL/L，pH 9.0)1mL，混勻，塞緊後於25℃水浴中衍生反應10min後立即經0.45μm濾膜過濾，即得。

測定方法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

SCP-H-8衍生化試劑的液相色譜圖如圖1所示，半胱氨酸衍生化試劑的液相色譜圖如圖2所示。可以看出，圖1和圖2在保留時間6min以及7.3min左右均出現了保留峰，6min左右的保留峰為SCP-H-8(圖1)或半胱氨酸(圖2)衍生化試劑的保留峰，7.3min左右的保留峰為未衍生化的SCP-H-8(圖1)或半胱氨酸(圖2)的保留峰。這一結果表明SCP-H-8為半胱氨酸。

效果實施例1石菖蒲提取物對東莨菪鹼所致小鼠記憶獲得障礙的影響

採用記憶獲得障礙模型分別研究實施例1和實施例2製得的石菖蒲提取物對動物記憶障礙的改善作用。實施例1和實施例2製得的石菖蒲提取物分別簡稱為SCPd-1和SCPd-2。

實驗動物採用小鼠。記憶獲得障礙藥理實驗方法：動物經口灌胃給藥，陰性對照組和模型組小鼠給予飲用水，多奈哌齊組給予多奈哌齊1.6mg/kg，SCPd-1高劑量組和低劑量組石菖蒲提取物分別給予5g生藥/kg和2.5g生藥/kg的石菖蒲提取物SCPd-1，SCPd-2高劑量組、中劑量和低劑量組分別給予7g生藥/kg、5g生藥/kg和2.5g生藥/kg的石菖蒲提取物SCPd-2，連續給藥兩周。除陰性對照組外其他組別的小鼠最後一次給藥後1小時，腹腔注射東莨菪鹼3mg/kg。30min後，將所有組別小鼠放入跳臺儀內適應5min。然後通電，動物受到電擊後的正常反應是跳回平臺以躲避傷害性刺激，多數動物可能再次或多次跳至銅柵上，受到電擊後又迅速跳回平臺，如此訓練5min。24小時後重測，記錄受電擊的動物數，第一次跳下平臺的潛伏期和5min內的錯誤總數。

石菖蒲提取物SCPd-1結果如表2所示，SCPd-2的結果如表3所示.由表2和表3數據可見，石菖蒲提取物SCPd-1和SCPd-2都有明顯的改善小鼠學 習的作用。

表2.SCPd-1對東莨菪鹼所致小鼠記憶獲得障礙的影響(n＝10，)

*P＜0.05，**P＜0.01與模型組相比

表3.SCPd-2對東莨菪鹼所致小鼠記憶獲得障礙的影響(n＝10，)

*P＜0.05，**P＜0.01與模型組相比

效果實施例2石菖蒲提取物對乙醇所致小鼠記憶再現障礙的影響

採用記憶再現障礙模型分別研究實施例1和實施例2製得的石菖蒲提取物對動物記憶障礙的改善作用。實施例1和實施例2製得的石菖蒲提取物分別簡稱為SCPd-1和SCPd-2。

記憶再現障礙藥理實驗方法：動物經口灌胃給藥，陰性對照組和第模型組小鼠給予飲用水，多奈哌齊組給予多奈哌齊1.6mg/kg，SCPd-1高劑量組和低劑量組石菖蒲提取物分別給予5g生藥/kg和2.5g生藥/kg的石菖蒲提取物SCPd-1，SCPd-2高劑量組、中劑量和低劑量組分別給予7g生藥/kg、5g生藥/kg和2.5g生藥/kg的石菖蒲提取物SCPd-2，連續給藥兩周。末次給藥後1小時，所有組別的小鼠分別以避暗法訓練一次。將小鼠放入避暗箱內，背朝洞口放入明室，同時啟動計時器，動物穿過洞口進入暗室受到電擊，計時自動停止。取出小鼠，記錄每鼠從放入明室至進入暗室遇到電擊所需的時間，此即潛伏期。24小時後進行測試，測試前30min，除陰性對照組外其他組別的小鼠口服給予45％的乙醇溶液(0.1mL/10g)。記錄動物由明室進入暗室的潛伏期和5min內的電擊次數(錯誤次數)。

石菖蒲提取物SCPd-1結果如表4所示，SCPd-2的結果如表5所示。由表4和表5數據可見，石菖蒲提取物SCPd-1和SCPd-2都有明顯的改善小鼠記憶的作用。

表4.SCPd-1對乙醇所致小鼠記憶再現障礙的影響(n＝10，)

*P＜0.05，**P＜0.01與模型組相比

表5.SCPd-2對乙醇所致小鼠記憶再現障礙的影響(n＝10，)

*P＜0.05，**P＜0.01與模型組相比

將本發明製備的石菖蒲提取物與授權專利一種石菖蒲提取物、含其藥物組合物及其製備方法和應用(授權公告號：CN101785816B)中製備的石菖蒲提取物進行比較，結果如對比例1和對比例2所示。

對比例1所述授權專利的石菖蒲提取物對東莨菪鹼所致小鼠記憶獲得障礙的影響

所述授權專利效果實施例的實驗方法和步驟參照本發明的效果實施例， 不同之處在於，用石杉鹼甲替換本發明使用的多奈哌齊，並且錯誤次數的統計時間為3min。其實驗結果如表6所示。

表6.SCP-3對東莨菪鹼所致小鼠記憶獲得障礙的影響

##P＜0.01，與空白對照組相比

*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組相比

結合表2、表3和表6中的數據可知，用藥量超過2.5g生藥/kg的SCPd-1、SCPd-2和SCP-3在小鼠記憶獲得障礙的實驗中均有效。特別地，在5min內的錯誤總次數方面，與相應的模型組數據相比可知，本發明的提取物均具有明顯區別，具有顯著的藥效。

對比例2所述授權專利的石菖蒲提取物對乙醇所致小鼠記憶再現障礙的影響

所述授權專利效果實施例的實驗方法和步驟參照本發明的效果實施例，不同之處在於，用石杉鹼甲替換本發明使用的多奈哌齊。其實驗結果如表7所示。

表7.SCP-3對乙醇所致小鼠記憶再現障礙的影響

##P＜0.01，與空白對照組相比

*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組相比

結合表4、表5和表7中數據可知，用藥量超過5g生藥/kg的SCPd-1、SCPd-2和SCP-3在小鼠記憶再現障礙的實驗中均有效。特別地，在5min內的錯誤總次數方面，與相應的模型組數據相比可知，本發明提取物SCPd-2在2.5g生藥/kg時的數據有明顯區別，具有顯著的藥效。