一種高含量三葉豆苷的製備方法
2023-06-14 12:07:16 1
專利名稱：一種高含量三葉豆苷的製備方法
技術領域：
本發明屬於天然植物有效成分提取技術領域，特別是涉及一種以羅布麻葉為原料製備三葉豆苷的方法。
背景技術：
羅布麻葉為夾竹桃科植物羅布麻Apocynum venetum L.的乾燥葉,夏季採收,除去雜質，乾燥。羅布麻葉性涼，味甘、苦，歸肝經。據藥典記載，其有平肝安神，清熱利水的作用， 可用於肝陽眩暈，心悸失眠，浮腫尿少；高血壓，神經衰弱，腎炎浮腫等症。現代藥理研究結果表明，羅布麻葉提取物具有調節血壓、降低血脂的作用，其黃酮有效部位對大鼠早期實驗性動脈粥樣硬化有抑制作用。三葉醜苷(Trifolin)是羅布麻葉的黃酮類成分，分子式C21H2(l0n,分子量 448. 39，黃色針狀結晶(甲醇)，易溶於甲醇、乙醇、乙酸乙酯及鹼性水溶液，難溶於中性、酸性水溶液。三葉豆苷具有降低血清膽固醇和升高血清高密度蛋白的效果，專利「三葉豆苷的用途」(專利號201010223716. X)，該專利採用三葉豆苷作為唯一活性成分用於治療高血脂疾病，取得了顯著效果，該發明研究明確了三葉豆苷用於高血脂疾病的優勢，且其在應用於急性高血脂疾病具有同樣顯著的效果。近年來，隨著人們的生活水平不斷提高，飲食結構及生活方式的變化，人們的血脂水平總體在逐年升高。據統計，我國20世紀90年代初期比80年代的人群血脂水平明顯增加，估計約有30% 40%的人患有不同程度的高血脂。三葉豆苷以其良好的降低血清膽固醇和升高血清高密度蛋白的效果，而具有廣闊的研究前景。目前羅布麻葉有效成分的研究主要停留在羅布麻葉總黃酮的提取分離上，單一黃酮類成分的提取分離較少，大多是對羅布麻葉中黃酮類成分進行化學結構鑑定的微量分析。程秀麗等公開的「羅布麻葉中黃酮類化合物研究」，該文獻採用水提，大孔樹脂、聚醯胺樹脂、凝膠樹脂反覆上柱分離純化得到三葉豆苷，該法製得三葉豆苷量少，損失大。 如張語遲等採用70%乙醇回流提取，大孔樹脂分離純化得總黃酮苷，再採用HPLC-MS進行結構鑑定。現有專利「羅布麻屬植物羅布麻葉總黃酮提取物、其製備及應用」(專利號 200510123187. 5)，該專利採用乙醇回流提取，濃縮，沸水溶解除雜，上聚醯胺樹脂柱，通過不同濃度乙醇洗脫得到羅布麻葉總黃酮，該方法未得到單一三葉豆苷成分。
發明內容
本發明的目的是為了解決上述現有技術所存在的問題，提供一種高含量三葉豆苷的製備方法。該工藝採用膜濃縮結合酸鹼除雜的方法得到羅布麻葉總黃酮，再通過加壓矽膠柱層析得到高純度的三葉豆苷。本發明是通過以下技術方案實現的一種高含量三葉豆苷的製備方法，其特徵在於包含以下步驟
I)提取將羅布麻葉藥材粉碎，加入3 12倍量30 60%低碳醇提取2 4次， 過濾，得提取液；2)膜濃縮將上述提取液加入超濾膜系統超濾，透過液加鹼調至pH8 9. 5，再經納濾膜濃縮，得濃縮液；3)酸鹼除雜將上述濃縮液用酸調節至pH4 6沉澱，用pH8 10的鹼液溶解， 再加酸調節至pH4 6,濾出沉澱加水洗漆,得沉澱物；4)柱層析將上述沉澱物用乙醇溶解，加入活性碳水浴保溫50 80°C脫色，過濾， 濾液採用ODS中壓柱層析，以甲醇-水或乙腈-水混合溶劑系統洗脫，採用薄層監測，收集高濃度流分，合併，回收溶劑至小體積，放置結晶即得產品。所述步驟I)中低碳醇選用甲醇或乙醇，提取方法可採用回流提取，冷浸提取，超聲提取中的一種。所述步驟2)中的超濾膜是截留分子量4000 10000的管式複合膜，納濾膜的截留分子量是100 200。所述步驟2)、3)中的酸可選用鹽酸、硫酸、甲酸、醋酸等有機酸或無機酸中的一種，鹼可以選用氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉中的一種。所述步驟4)中的活性炭加入量為沉澱物的2 8%,水浴保溫20 50min。所述步驟4)中的ODS中壓柱為娃膠為200 400目，徑高比為I : (8 15)。所述步驟4)中的洗脫液是甲醇-水或乙腈-水(2 7 3 6)混合溶劑系統， 用量是6 15BV。綜上所述，本發明具有以下優點I.膜濃縮採用膜濃縮，有效降低能耗；2.酸鹼除雜通過三葉豆苷在酸鹼溶液中溶解度的差異得到羅布麻葉總黃酮，操作簡單，產品損失少；3.柱層析採用ODS加壓柱層析，ODS矽膠具有疏水性，對極性產品的分離效果較好採用加壓的方式保證了洗脫劑的流速，加強了分離效果。下面將結合具體實施方式
進一步說明本發明，但本發明要求保護的範圍並不局限於下列實施方式。
具體實施例方式下述實施實例中三葉豆苷有效成分的監測採用薄層監測法(參照魏錦萍等「大葉白麻葉化學成分的研究」文獻)，具體方法如下展開劑乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(6 3 3 I)薄層板矽膠或者矽膠HF254顯色劑=AlCl3乙醇溶液將樣品以及對照品的供試液進行層析展開，通過AlCl3乙醇溶液顯色或者直接置 254nm螢光燈下觀察與對照品色譜相應的位置上有相同顏色的單一斑點。實施例I :將羅布麻葉藥材粉碎，稱取lKg，加入12L40%乙醇冷浸16h，過濾，濾渣按上述條件再提取一次，過濾，合併濾液，加入截留分子量6000的管式複合超濾膜系統超濾，透過液加氫氧化鈉溶液調節至PH9，加入截留分子量100的納濾膜中濃縮，得濃縮液，向濃縮液中加入鹽酸調節至PH4，過濾，沉澱再用pHIO的氫氧化鈉溶液溶解，過濾，棄去不溶物，濾液加鹽酸調節至PH4，過濾，濾餅加450ml水洗漆，得羅布麻葉總黃酮21g。將總黃酮用乙醇溶解，加入Ig活性炭水浴60°C保溫脫色20min，過濾得脫色液，取500g300目的ODS矽膠，裝柱(徑高比I : 8)，脫色液過色譜柱加壓層析，用8BV的甲醇-水(2 : 3)溶劑系統洗脫， 採用薄層監測，收集高濃度流分，合併，回收試劑至小體積，放置結晶得三葉豆苷O. 96g，含量 98. 7%o實施例2 將羅布麻葉藥材粉碎，稱取lKg，加入3L30%甲醇超聲提取lh，過濾，濾渣按上述條件再提取兩次，過濾，合併濾液，加入截留分子量4000的管式複合超濾膜系統超濾，透過液加氫氧化鉀溶液調節至PH8，加入截留分子量200的納濾膜濃縮，得濃縮液，向濃縮液中加入硫酸調節至PH6，過濾，沉澱再用pH8的氫氧化鉀溶液溶解，過濾，棄去不溶物，濾液加硫酸調節至PH4，過濾，濾餅加500ml水洗滌，得羅布麻葉總黃酮19g。將總黃酮用乙醇溶解， 加入O. 5g活性炭水浴50°C保溫脫色30min，過濾得脫色液，取400g400目的ODS矽膠，裝柱 (徑高比I : 10)，脫色液過色譜柱加壓層析，用IOBV乙腈-水(5 6)溶劑系統洗脫，採用薄層監測，收集高濃度流分，合併，回收試劑至小體積，放置結晶得三葉豆苷I. 19g，含量 98. 1%。實施例3 將羅布麻葉藥材粉碎，稱取lKg，加入8L50%乙醇回流提取2h，過濾，濾渣按上述條件再提取一次，過濾，合併濾液，加入截留分子量10000的管式複合超濾膜系統超濾，透過液加碳酸鈉溶液調節至PH9. 5，加入截留分子量100的納濾膜濃縮，得濃縮液，向濃縮液中加入醋酸調節至PH5，過濾，沉澱再用pHIO的碳酸鈉溶液溶解，過濾，棄去不溶物，濾液加醋酸調節至PH5，過濾，濾餅加550ml水洗滌，得羅布麻葉總黃酮22. 3g。將總黃酮用乙醇溶解，加入I. 5g活性炭水浴70°C保溫脫色40min，過濾得脫色液，取550g200目的ODS矽膠， 裝柱(徑高比I : 12)，脫色液過色譜柱加壓層析，用12BV甲醇水(3 5)溶劑系統洗脫， 採用薄層監測，收集高濃度流分，合併，回收試劑至小體積，放置結晶得三葉豆苷I. Hg，含量 98. 3%o實施例4 將羅布麻葉藥材粉碎，稱取5Kg，加入18L30%乙醇回流提取I. 5h，過濾，濾渣按上述條件再提取一次，過濾，合併濾液，加入截留分子量8000的管式複合超濾膜系統超濾，透過液加氫氧化鈉溶液調節至PH8. 5，加入截留分子量200的納濾膜濃縮，得濃縮液，向濃縮液中加入鹽酸調節至PH5. 5，過濾，沉澱再用pH9的氫氧化鈉溶液溶解，過濾，棄去不溶物， 濾液加鹽酸調節至PH5，過濾，濾餅加3L水洗滌，得羅布麻葉總黃酮118g。將總黃酮用乙醇溶解，加入2. 5g活性炭水浴65°C保溫脫色50min，過濾得脫色液，取2. 8Kg400目的ODS矽膠，裝柱(徑高比I : 8)，脫色液過色譜柱加壓層析，用IOBV乙腈-水(5 4)溶劑系統洗脫，採用薄層監測，收集高濃度流分，合併，回收試劑至小體積，放置結晶得三葉豆苷5. 68g， 含量97. 9%o實施例5 將羅布麻葉藥材粉碎，稱取10Kg，加入50L60%乙醇冷浸20h，過濾，濾渣按上述條件再提取一次，過濾，合併濾液，加入截留分子量10000的管式複合超濾膜系統超濾，透過液加氫氧化鉀溶液調節至PH9. 5，加入截留分子量200的納濾膜濃縮，得濃縮液，向濃縮液中加入硫酸調節至PH4，過濾，沉澱再用pH9. 5的氫氧化鉀溶液溶解，過濾，棄去不溶物,濾液加硫酸調節至PH4. 5，過濾，濾餅加3L水洗滌，得羅布麻葉總黃酮190g。將總黃酮用乙醇溶解，加入Ilg活性炭水浴55°C保溫脫色40min，過濾得脫色液，取4Kg300目的ODS矽膠， 裝柱(徑高比I : 10)，脫色液過色譜柱加壓層析，用6BV甲醇-水(7 5)溶劑系統洗脫， 採用薄層監測，收集高濃度流分，合併，回收試劑至小體積，放置結晶得三葉豆苷10. lg，含量 98. 2%。
權利要求
1.一種高含量三葉豆苷的製備方法，其特徵在於包含以下步驟1)提取將羅布麻葉藥材粉碎，加入3 12倍量30 60%低碳醇提取2 4次，過濾，得提取液；2)膜濃縮將上述提取液加入超濾膜系統超濾，透過液加鹼調至pH8 9.5，再經納濾膜濃縮，得濃縮液；酸鹼除雜將上述濃縮液用酸調節至PH4 6沉澱，用pH8 10的鹼液溶解，再加酸調節至pH4 6,濾出沉澱加水洗漆,得沉澱物3)柱層析將上述沉澱物用乙醇溶解，加入活性碳水浴保溫50 80°C脫色，過濾，濾液採用ODS中壓柱層析，以甲醇-水或乙腈-水混合溶劑系統洗脫，採用薄層監測，收集高濃度流分，合併，回收溶劑至小體積，放置結晶即得產品。
2.如權利要求I所述的一種高含量三葉豆苷的製備方法，其特徵在於所述步驟I)中低碳醇洗用甲醇或乙醇，提取方法可採用回流提取、冷浸提取、超聲提取中的一種。
3.如權利要求I所述的一種高含量三葉豆苷的製備方法，其特徵在於所述步驟2)中的超濾膜是截留分子量400 10000的管式複合膜，納濾膜的截留分子量是100 200。
4.如權利要求I所述的一種高含量三葉豆苷的製備方法，其特徵在於所述步驟2)和3)中的酸可選用鹽酸、硫酸、甲酸、醋酸等有機酸或無機酸中的一種，鹼可以選用氫氧化鈉、 氫氧化鉀、碳酸鈉中的一種。
5.如權利要求I所述的一種高含量三葉豆苷的製備方法，其特徵在於所述步驟4)中的活性炭加入量為沉澱物的2 8%，水浴保溫20 50min。
6.如權利要求I所述的一種高含量三葉豆苷的製備方法，其特徵在於所述步驟4)中的 ODS中壓柱為矽膠為200 400目，徑高比為I : (8 15)。
7.如權利要求I所述的一種高含量三葉豆苷的製備方法，其特徵在幹所述步驟4)中的洗脫液是甲醇-水或乙腈-水(2 7 3 6)混合溶劑系統，用量是6 15BV。
全文摘要
一種高含量三葉豆苷的製備方法，其特徵在於將羅布麻葉用30～60％低碳醇提取，提取液經超濾膜系統超濾，透過液調鹼，再用納濾膜濃縮，濃縮液調酸沉澱，濾出沉澱物用鹼性乙醇溶液溶解，再次調酸沉澱，濾出沉澱物水洗，用乙醇溶解，加入活性炭脫色，脫色液注入ODS色譜柱層析，用混合溶劑系統洗脫，採用薄層監測，收集高濃度流分，合併，回收溶劑至小體積，靜置結晶即得產品。該製備方法操作簡單，製得產品含量高，矽膠柱可再生利用，適合小規模製備。
文檔編號C07H17/07GK102603831SQ201110026199
公開日2012年7月25日 申請日期2011年1月25日 優先權日2011年1月25日
發明者劉東鋒, 李法慶 申請人:蘇州寶澤堂醫藥科技有限公司