一種篩選抗痴呆藥物的果蠅疾病模型及其構建方法與應用的製作方法
2023-06-14 08:23:06
專利名稱：一種篩選抗痴呆藥物的果蠅疾病模型及其構建方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種篩選藥物的模型及其構建方法與應用，特別涉及一種篩選抗痴呆藥物的果蠅疾病模型及其構建方法與應用。
背景技術：
神經退行性腦疾病是以腦中樞系統發生退化性改變為基礎的重大腦疾病，已成為影響人類健康的重要疾病之一。老年痴呆症(Alzheimer’s disease，AD)是一種神經元退化的疾病。這種神經性功能失調可以是先天遺傳的，也可以是後天誘發的。目前還沒有任何理想的有效藥物問世。由於發病率高，用於照顧老年痴呆病患者的醫療費用在美國及其它發達國家是最大的一筆醫藥保健開銷。同樣，對已進入或即將進入老年社會的國家將是一個嚴重的社會和經濟問題。
到目前為止，諸如AD等神經退行性疾病發生的確切分子機制仍然不清楚，相應的診斷和防治都比較困難。原因之一是人類神經退行性疾病的病因十分複雜；原因之二是因為對疾病患者和脊椎動物模型如鼠模型的遺傳分析較為困難。目前，對AD的研究和藥物研發策略分別在生化模型、細胞模型和轉基因動物模型上進行。轉基因鼠模型雖然在進化地位上與人的親緣關係較近，但卻存在生命周期長、成本代價昂貴等不足，最致命的缺陷是與年齡相關的神經元退化現象不明顯，在進行人腦疾病研究和藥物篩選方面具有一定的缺陷。
果蠅具有遺傳學和發育學的巨大優勢，基因背景清晰，生命周期短，每代只需10天左右，因此藥物篩選工作相對其它動物模型而言具有快捷、準確、經濟、顯著縮短實驗時間的優越性。大量的實驗證實，從果蠅，小鼠到人，在進化上具有嚴格的保守性。加之果蠅基因組計劃的完成也進一步推動了果蠅疾病模型的研究進展。通過在果蠅基因組中進行人類疾病基因的同源檢索，結果發現287個人類疾病基因中大約178個基因在果蠅中是保守的，約佔62％。進一步的歸類工作發現保守基因較多的基因種類為癌基因(65個基因中佔47個，約為72％)和神經性疾病基因(59個基因佔38個，約為64％)。由於與人類疾病發生有關的疾病基因，尤其是癌基因和神經性疾病基因在果蠅基因組中普遍存在保守基因，使我們利用果蠅模型不但可以分析人疾病基因的功能、疾病發生的細胞分子機制，同時利用果蠅生物學上的優勢有利於我們探討人類單基因異常表達(如超表達)和單基因突變所導致的組織學病變的細胞分子機制。此外，果蠅遺傳操作(如突變或轉基因)和轉基因表達(如熱休克或UAS-Gal4系統)也相對較為方便。通過將果蠅體內的同源基因進行突變，或者將人的疾病基因轉入到果蠅體內，並使其表達，就可以在果蠅模型上塑造諸如老年痴呆病等神經退行性疾病，再現人腦疾病關鍵的病理特徵。
果蠅rutabaga基因編碼產生鈣/鈣調素調控的腺苷酸環化酶(AC)，參與組成cAMP信號轉導通路。而這條通路與果蠅的學習記憶功能有關。rutabaga的突變(rut1)能能夠導致產生活性降低腺苷酸環化酶，從而損害果蠅的學習記憶功能。
人tau基因編碼產生一種微管結合蛋白(tau)，它能促成微管蛋白聚集形成微管並起穩定作用。人tau突變體蛋白(R406W tau)所編碼產生的tau蛋白，在其406位上R(精氨酸)被W(色氨酸)所取代，這種突變蛋白部分降低了與微管的結合能力，進而可能會造成對神經元自身主要功能的物理障礙或是對神經元細胞的直接毒性作用。人tau基因的突變能夠引發常染色體顯性遺傳的諸如老年性痴呆病等常見類型的神經退行性疾病。
發明內容
本發明的目的是提供用於針對老年性痴呆疾病藥物篩選的轉基因果蠅模型。
一種篩選抗痴呆藥物的果蠅疾病模型，它具有rutabaga位點的突變(rut1)，同時也表達人tau突變蛋白(R406W tau)。
該模型一方面具有rutabaga的突變(rut1)，影響到該基因編碼鈣/鈣調素調控的腺甘酸環化酶的活性，改變了腦區神經元cAMP信號轉導通路中cAMP的調控，影響到果蠅的學習記憶功能。另一方面還可在果蠅腦區特異性表達人R406W突變tau蛋白。在rut1和突變tau蛋白介導的神經毒性同時存在的情況下出現果蠅蛹階段的致死性，導致不能發育出成蠅。該模型為在rut1存在的條件下，由tau蛋白介導神經毒性的轉基因果蠅疾病模型。
本發明的第二個目的是提供一種構建篩選抗痴呆藥物的果蠅疾病模型的方法。
本發明所提供的構建篩選抗痴呆藥物的果蠅疾病模型的方法，是由雌性rut1；Scabrous-Gal4的處女蠅與雄性UAS-tau R406W果蠅進行雜交，得到具有rutabaga位點的突變(rut1)，同時也表達人tau突變蛋白的子I代果蠅。
Scabrous-Gal4果蠅是將rutabaga等位基因rut1和Gal4啟動子Scabrous-Gal4分別整合在果蠅一號染色體上和二號染色體上，該果蠅的基因型為rut；Scab-Gal4/rut；Scab-Gal4。
以只在二號染色體上整合有Gal4啟動子Scabrous-Gal4的Gal4果蠅作為親本蠅對照，該果蠅的基因型為Scabrous-Gal4/Scabrous-Gal4)。
所述果蠅疾病模型的對照果蠅為scabrous-Gal4的處女蠅或雄蠅分別與UAS-tauWT果蠅的雄蠅或處女蠅雜交後的子I代蠅，其基因型為scabrous-Gal4/+；UAS-tauWT/+。
本發明的第三個目的是提供一種快捷篩選抗痴呆藥物的方法。
一種篩選抗痴呆藥物的方法，是由雌性rut1；Scabrous-Gal4的處女蠅與雄性UAS-tauR406W果蠅進行雜交，得到具有rutabaga位點的突變(rut1)，同時也表達人tau突變蛋白的子I代果蠅；在該子I代果蠅發育期的不同階段，飼餵待篩選藥物，篩選出修復神經元凋亡的藥物及其有效濃度。
篩選中藥物的飼餵方式是將待篩選的藥物參雜在果蠅培養基中。培養基可分為藥種類系列和同種藥的濃度系列本發明果蠅模型的突出特點是出現蛹階段致死性，故可在發育期的不同階段，通過飼餵不同藥物及藥物的不同濃度篩選出修復神經元凋亡的藥物。通過藥物篩選實驗找到有效藥物，抑制腦區神經元的毒性，使子I代果蠅能出成蠅。由此就可以依據凋亡神經元的修復程度作為有效藥物篩選的指標。通過藥物篩選尋找克服果蠅蛹階段的致死性，達到改善和修復腦區神經元的活性作為藥物篩選的有效標準。
用轉基因果蠅模型來研究人腦疾病和開發有效藥物有其它系統不可比擬的優勢。利用本發明的模型及方法，使快捷地對大量化合物和中草藥進行篩選得以實現，可以據此開發出治療老年性痴呆疾病的高效藥物。
圖1為果蠅疾病模型用於藥物篩選時各種處理的外部形態。
圖2為用果蠅疾病模型快捷篩選抗痴呆藥物的技術流程圖。
具體實施例方式
實施例1、篩選修復神經元藥物的果蠅疾病模型的建立將rutabaga等位基因rut1和Gal4啟動子Scabrous-Gal4分別整合在果蠅一號染色體上和二號染色體上，得到Gal4果蠅(基因型為rut；Scab-Gal4/Scab-Gal4)。以僅僅二號染色體上整合有Gal4啟動子Scabrous-Gal4的Gal4果蠅(基因型為Scabrous-Gal4/Scabrous-Gal4)，作為親本果蠅對照。雌性rut1；Scabrous-Gal4的處女蠅與雄性UAS-tau R406W果蠅進行雜交，其子I代果蠅同時表達rut和人R406W tau蛋白，從而建立了與AD相關的果蠅疾病模型(基因型為rut1；scabrous-Gal4/+；UAS-tau R406W/+)。該果蠅疾病模型的對照果蠅為scabrous-Gal4果蠅的處女蠅或雄蠅分別與UAS-tau WT果蠅的雄蠅或處女蠅雜交後的子I代蠅(基因型為scabrous-Gal4/+；UAS-tau WT/+)。該疾病模型特徵是在子I代果蠅的蛹(pupae)階段出現致死性，導致不能發育出成蠅。
實施例2、將果蠅疾病模型用於藥物篩選該疾病模型特徵是在子I代果蠅的蛹(pupae)階段出現致死性，導致不能發育出成蠅。通過藥物篩選實驗找到有效藥物，抑制腦區神經元的毒性，使子I代果蠅能出成蠅。具體的實施方法如圖1所示。在圖中，A-C表示轉基因果蠅處於不同發育階段的蛹每幅圖中上部的為對照用蠅，基因型為Scab-Gal4/+；UAS-tau wt 2/+；下左為轉基因果蠅(不飼餵藥物)，基因型為rut1；Scab-Gal4/+，UAS-tau R406W1/+；下右為轉基因果蠅(飼餵藥物)，基因型為rut1；Scab-Gal4/+，UAS-tau R406W1/+。D表示轉基因果蠅成蠅上部的為對照用蠅，基因型為Scab-Gal4/+；UAS-tauwt 2/+；下部的為轉基因果蠅(飼餵藥物)，基因型為rut1；Scab-Gal4/+，UAS-R406Wtau 1/+。採取的餵藥方式為親本蠅雜交後放在有藥的培養基中(分為藥種類系列和同種藥的濃度系列)。由此就可以依據凋亡神經元的修復程度作為有效藥物篩的指標。其系統和技術的流程如圖2所示。
權利要求
1.一種篩選抗痴呆藥物的果蠅疾病模型，其特徵在於它具有rutabaga位點的突變(rut1)，同時也表達人tau突變蛋白(R406W tau)。
2.根據權利要求1所述的果蠅疾病模型，其特徵在於該果蠅模型出現蛹階段致死性。
3.一種構建篩選抗痴呆藥物的果蠅疾病模型的方法，是由雌性rut1；Scabrous-Gal4的處女蠅與雄性UAS-tau R406W果蠅進行雜交，得到具有rutabaga位點的突變(rut1)，同時也表達人tau突變蛋白的子I代果蠅。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於將rutabaga等位基因rut1和Gal4啟動子Scabrous-Gal4分別整合在果蠅一號染色體上和二號染色體上，得到Scabrous-Gal4果蠅，該果蠅的基因型為rut；Scab-Gal4/rut；Scab-Gal4。
5.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於以只在二號染色體上整合有Gal4啟動子Scabrous-Gal4的Gal4果蠅作為親本蠅對照，該果蠅的基因型為Scabrous-Gal4/Scabrous-Gal4)，。
6.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述果蠅疾病模型的對照果蠅為scabrous-Gal4的處女蠅或雄蠅分別與UAS-tau WT果蠅的雄蠅或處女蠅雜交後的子I代蠅，其基因型為scabrous-Gal4/+；UAS-tau WT/+。
7.一種篩選抗痴呆藥物的方法，是由雌性rut1；Scabrous-Gal4的處女蠅與雄性UAS-tau R406W果蠅進行雜交，得到具有rutabaga位點的突變(rut1)，同時也表達人tau突變蛋白的子I代果蠅；在該子I代果蠅發育期的不同階段，飼餵待篩選藥物，篩選出修復神經元凋亡的藥物及其有效濃度。
8.據權利要求7所述的方法，其特徵在於待篩選的藥物參雜在果蠅培養基中。
全文摘要
本發明提供了一種篩選抗痴呆藥物的果蠅疾病模型及其構建方法與應用，目的是提供用於針對老年性痴呆疾病藥物篩選的轉基因果蠅模型。本發明所提供的篩選抗痴呆藥物的果蠅疾病模型，它具有rutabaga位點的突變(rut
文檔編號C12N15/12GK1521259SQ0310223
公開日2004年8月18日 申請日期2003年1月30日 優先權日2003年1月30日
發明者謝佐平, 鍾毅, 陳健 申請人:清華大學, 北京卓凱生物技術有限公司