lspD抑制劑篩選模型及IspD抑制劑杜米芬的新用途的製作方法

2023-06-14 08:29:56

專利名稱：lspD抑制劑篩選模型及IspD抑制劑杜米芬的新用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及化學藥物和藥物篩選領域，具體地，本發明涉及一種結核桿菌酶IspD 抑制劑的篩選模型，以及IspD抑制劑杜米芬用於製備抗結核治療藥物的用途。
背景技術：
結核病(Tuberculosis，以下簡稱為「TB」)是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)感染引起的慢性傳染性疾病，嚴重危害著人類生命健康。現在全球三分之一的人口已經感染了結核分枝桿菌，並且每年新增結核病病例927萬例，死亡300萬，成為與 AIDS、瘧疾並稱的三大傳染病。我國是全球22個結核高負擔國家之一，有5. 5億人口感染了 TB，患者人數高達550萬，居世界第二位，每天新增結核病患者4000多例。結核分枝桿菌，屬於分枝桿菌屬，為結核病的病原菌。結核分枝桿菌的耐藥已成為當前結核病治療中所面臨的最嚴重的問題之一，單藥耐藥、多藥耐藥甚至嚴重耐藥(極端耐藥)的結核分枝桿菌不斷出現和傳播，使傳統的抗TB藥物失去了原有的療效。在過去的三、四十年中，未能開發出真正有效的新型抗TB藥物。而且卡介苗的保護率在發達國家也已經低於50%，在中國則更低。為了應對結核病威脅，迫切需要研製新的抗TB藥物。一直以來，細胞壁是篩選抗細菌藥物的首選靶點。結核桿菌的細胞壁對於其生長繁殖至關重要，在細胞壁各成分的合成與組裝過程中有眾多的酶系參與，潛在著多個抗結核藥物的新靶點。而且其中多數的酶是人體內所不存在的，因此靶向細胞壁的藥物具有較好的選擇毒性。近幾年的研究結果表明在某些細菌、原蟲和植物體內存在一條2-甲基-赤蘚糖醇磷酸(methylerythritol phosphate, MEP)途徑用於合成類異戊二烯的前體物質異戊醯焦磷酸(isopentenyl diphosphate, IPP)或二甲烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate, DMAPP)。該途徑完全不同於哺乳動物和植物胞漿中的甲羥戊酸(MVA)途徑。 MEP途徑合成的類異戊二烯及其衍生物在生物代謝和細胞壁合成中至關重要，因此MEP途徑已成為藥靶研究的熱點。將大腸埃希菌或腸沙門菌MEP途徑的某一基因突變或缺失，可引起致死性突變，證實MEP途徑對細菌的生存是必需的。由於MEP途徑在病原體廣泛存在， 而不存在於人、動物和植物胞漿中，使得催化該途徑的酶成為潛在的、同時又具有選擇性的分子靶位。MEP 途徑共包含 8 個酶參與其中，分別為 DXS, IspC, IspD, IspE, IspF, IspG, IspH, Idi0 其中 ispD(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphateCytidyltransferase,2~C~ 甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胞嘧啶轉移酶)為這一途徑中的關鍵基因，負責將MEP和CTP (三磷酸胞苷)催化反應生成CDP-ME(如

圖1所示)。Dean Crick對該基因進行了溫度敏感性突變，證明確實該基因突變結核桿菌無法存活(Hyungjin Eoh, Amanda C. Brown, Lori Buetow,et al. Brennan, and Dean C. Crick. Characterization of the Mycobacterium t uberculosis4-Diphosphocytidyl-2-C-Methyl-d-Erythritol Synthase :Potential for Drug Development. J Bacteriol. 2007,189(24) :8922-8927)。但目前尚沒有 IspD 抑制劑的報導，通過篩選結核桿菌的IspD抑制劑有可能發現全新作用機制的抗結核藥物。杜米芬(Domiphen Bromide, DMB)系陽離子型表面活性廣譜殺菌劑。其適用於口腔、咽喉感染的輔助治療和皮膚、器械消毒等。目前尚沒有杜米芬作為抗結核藥物的報導。

發明內容
為了篩選IspD抑制劑，本發明以IspD為靶標，利用其酶學活性建立IspD抑制劑篩選模型，並評價篩選產物的抗結核活性，最終發現杜米芬具有抗結核桿菌活性。具體地，本發明的一個方面涉及一種篩選IspD抑制劑的組合試劑，其包括MEP、CTP、IspD 和待篩選化合物；還包括酶反應緩衝液和離子試劑，其中所述離子試劑包括MgCl2、NaF及 DTT ( 二硫蘇糖醇)；此外還包括測定MEP、CTP和IspD反應所生成的PPi的試劑，所述試劑優選為β-巰基乙醇和鉬酸銨。其中所述IspD是從能夠產生IspD的生物中提取獲得或者根據上述生物的基因組序列利用分子生物學方法獲得。優選地，IspD是從結核分枝桿菌中提取獲得或者根據結核分枝桿菌基因組序列利用分子生物學方法獲得。在本發明的一個實施方案中，以結核桿菌H37Rv基因組為模版，分別以5』_GTTCAT CCATATGGTCAGGGAAGCGGGCGAAGTAGTTGCG-3』 (SEQ IDNO 1)和 5』-GTCTTATCTCGAGCCCGCGCAC TATAGCTTGGGCCAGC-3』 (SEQID NO 2)為引物，通過PCR擴增得到ispD基因序列，克隆並轉化，得到可高效表達結核桿菌IspD蛋白的大腸桿菌B121 (DE3)，IPTG誘導蛋白表達，取表達產物純化，用於篩選。本發明的另一方面涉及篩選IspD抑制劑的方法。該方法的基本原理為IspD催化結核桿菌細胞壁合成前體CDP-ME的合成(圖1)， 反應過程中，在生成Imol的產物⑶P-ME的同時釋放出Imol的焦磷酸(PPi)，PPi生成量直接反映出該酶促反應進行的情況，因而可間接地反映IspD的活性。PPi生成量的測定可採用放射性方法，將CTP最後一個單磷酸進行放射性標記，通過反應生成的PPi的放射性強度檢測反應進程，但該方法有放射性汙染，不適於大規模使用；也可採用無機磷酸酶將PPi分解為單磷酸，然後利用顯色反應檢測，此方法的缺點是該過程中引入了另外的酶，需要反向篩選排除假陽性，增加了篩選步驟。在本發明中，PPi的測定優選採用吸光度法，反應依據為在酸性條件下，焦磷酸根與鉬酸銨在巰基乙醇存在時形成藍色產物，該藍色產物的吸收值與本底(黃色)吸收值的差值在一定範圍內與產物生成量呈線性關係，此法可簡便可信的檢測PPi的生成量( Kuang, NicolasSalem, Fangjing Wang, et al. A Colorimetric Assay Method toMeasure Acetyl-CoA Synthetase Activity !Application toffoodchuck Model of Hepatitis Virusinduced HepatocelIularCarcinoma. J Biochem Biophys Methods. 2007,70(4) 649-655.)。該方法包括以下步驟a.將CTP、MEP、IspD、待篩選化合物、酶反應緩衝液和離子試劑混合，組成反應體系，孵育，同時設立陽性對照和陰性對照組；b.進一步加入β -巰基乙醇和鉬酸銨，孵育，檢測反應體系的光吸收值，得出IspD酶活性；c.根據光吸收值計算待篩選化合物對IspD活性的抑制率，進而得到對IspD活性有抑制作用的陽性化合物。其中各化合物的反應終濃度分別為MEP 100 μ M-lmM, CTP 100 μ M-lmM, IspD 3. 85pm0l-385pm0l，待篩選化合物1-100 μ g/ml ；在本發明的一個實施方案中，各化合物的反應終濃度分別為MEP 250 μ Μ, CTP 500 μ Μ, IspD 38. 5pmol，待篩選化合物10 μ g/ml。其中所述酶反應緩衝液的成份為50mM pH8. 0的Tris_HCl，其中所述離子試劑的成份為溶於酶反應緩衝液中的IOmM的MgCl2、20mM NaF及ImM DTT。其中β-巰基乙醇濃度為1Μ，其用量為0. 1個反應體系體積；其中鉬酸胺濃度為 2. 5%，溶解於2. 5Μ的H2SO4中，其用量為0. 4個反應體系體積。在本發明的一個實施方案中，反應體系總體積為100μ 1，其中CTP和MEP的終濃度分別為500 μ M和250 μ Μ，離子試劑10 μ 1，IspD38. 5pmol，待篩選化合物10 μ g/ml。將上述體系在37°C孵育40min，加入10 μ 1顏色試劑A (1Μ β -巰基乙醇)和40 μ 1顏色試劑 B (2. 5%鉬酸銨溶解至2. 5Μ H2S04)後，37°C繼續孵育lOmin，酶標儀在590nm波長下檢測反應體系的光吸收值。其中所述陽性對照組是指反應體系中加入失活的IspD，不加待篩選化合物；其中所述陰性對照組是指反應體系中不加入待篩選化合物。其中所述根據光吸收值計算抑制率的方法如式(I)所示
權利要求
1.用於2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胞嘧啶轉移酶抑制劑篩選的試劑組，包括2-甲基-赤蘚糖醇磷酸、三磷酸胞苷和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胞嘧啶轉移酶。
2.根據權利要求1所述的試劑組，還包括酶反應緩衝液和離子試劑，其中所述離子試劑包括 MgCl2、NaF 及 DTT。
3.根據權利要求1所述的試劑組，還包括測定2-甲基-赤蘚糖醇磷酸、三磷酸胞苷和 2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胞嘧啶轉移酶反應所生成的焦磷酸的試劑，所述試劑優選為β-巰基乙醇和鉬酸銨。
4.根據權利要求1所述的試劑組，其中所述2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胞嘧啶轉移酶是從能夠產生2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胞嘧啶轉移酶的生物中提取獲得的或者根據前述生物的基因組序列利用分子生物學方法獲得的。
5.使用權利要求1-4所述的試劑組篩選2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胞嘧啶轉移酶抑制劑的方法，包括以下步驟a.將三磷酸胞苷、2-甲基-赤蘚糖醇磷酸、2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胞嘧啶轉移酶、待篩選化合物、酶反應緩衝液和離子試劑混合，組成反應體系，孵育，同時設立陽性對照和陰性對照組；b.測定a反應中所生成的焦磷酸的量，得出2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胞嘧啶轉移酶活性；優選為加入巰基乙醇和鉬酸銨，孵育，檢測反應體系的光吸收值，得出 2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胞嘧啶轉移酶活性；c.根據光吸收值計算待篩選化合物對2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胞嘧啶轉移酶活性的抑制率，進而得到對2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胞嘧啶轉移酶活性有抑制作用的陽性化合物。
6.根據權利要求5所述的方法，其中各化合物的反應終濃度分別為2-甲基-赤蘚糖醇磷酸100 μ M-ImM,三磷酸胞苷100 μ M-lmM, 2-C-甲基-D-赤蘚糖醇_4_磷酸胞嘧啶轉移酶 3. 85-385pmol，待篩選化合物1-100 μ g/ml ；優選的濃度為2-甲基-赤蘚糖醇磷酸250 μ Μ, 三磷酸胞苷500 μ Μ, 2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胞嘧啶轉移酶38. 5pmol，待篩選化合物 10 μ g/ml。
7.根據權利要求5所述的方法，其中所述陽性對照組是指反應體系中加入失活的 2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胞嘧啶轉移酶，不加待篩選化合物；其中所述陰性對照組是指反應體系中不加入待篩選化合物。
8.根據權利要求5所述的方法，其中所述根據光吸收值計算抑制率的方法如式(I)所示
9.杜米芬在體內/體外抑制分枝桿菌的用途，所述分枝桿菌優選為結核分枝桿菌，最優選為結核分枝桿菌H37Rv。
10.杜米芬用於製備抗結核藥物的用途。
11.2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胞嘧啶轉移酶在製備用於篩選結核抑制劑的組合物中的用途。
全文摘要
本發明涉及用於IspD抑制劑篩選的試劑組，包括MEP、CTP和IspD，還包括酶反應緩衝液、離子試劑以及用於測定PPi的試劑。本發明還涉及篩選IspD抑制劑的方法。通過此方法從3000多個化合物中篩選出具有抗結核活性的杜米芬。本發明還涉及杜米芬在體內/體外抑制結核分枝桿菌的用途以及杜米芬用於製備抗結核藥物的用途。
文檔編號G01N21/31GK102277411SQ20101019692
公開日2011年12月14日 申請日期2010年6月10日 優先權日2010年6月10日
發明者關豔, 劉憶霜, 楊延輝, 熊小椒, 甘茂羅, 肖春玲, 郝雪秦, 高鵬 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所