草甘膦降解菌及其在處理重金屬‑草甘膦複合汙染中應用的製作方法

2023-06-14 15:27:16

本發明屬於微生物領域，尤其涉及一株具有重金屬抗性的草甘膦降解菌膠紅酵母菌(rhodotorulamucilaginosa)及其在重金屬汙染環境下對草甘膦的降解。

背景技術：

草甘膦(n-膦酸甲基-甘氨酸)是一種內吸傳導型廣譜除草劑，因其高效、作用效果顯著在農業上被廣泛應用。但近年來的研究表明，長期施用草甘膦會對非靶標生物和環境造成不可估計的影響，尤其是對水生生物和土壤微生物等具有非常嚴重的毒害作用。此外，隨著現代工農業的發展，進入環境中的重金屬日益增多，汙水灌溉、含重金屬農藥和化肥施用等的頻繁使用，更加惡化了環境。這些生產方式可能導致重金屬-草甘膦的複合汙染，對生態系統的結構和功能產生影響。

農藥殘留的傳統處理方法主要採取化學法或焚燒、掩埋的方法。這些方法的缺點很明顯，即副作用大、易造成二次汙染、成本較高、作用慢等。生物修復主要是利用微生物及其產品來降解汙染物，它具有無毒、無殘留、成本較低等優點。到目前為止，大多數報導草甘膦降解菌對有毒重金屬元素並不具有很好的抗性，不能在重金屬存在的環境中對草甘膦進行有效降解，限制了微生物修復技術的實際應用範圍。重金屬-草甘膦複合汙染形式非常普遍地存在於環境中，微生物降解法的關鍵是篩選並分離出高效、安全、環境適應性強的草甘膦降解菌株。因此，篩選具有重金屬抗性的高效草甘膦降解菌，利用這些菌株具有利用草甘膦作為碳源和氮源的能力，以及對重金屬具有抗性的能力，可在快速將草甘膦分解同化的同時吸附重金屬，達到降解環境中草甘膦的目的。

技術實現要素：

針對現有技術無法有效處理重金屬-草甘膦複合汙染的上述問題，本發明旨在提供一種具有重金屬抗性的高效降解草甘膦廢水的膠紅酵母菌，利用這種膠紅酵母降解水體中草甘膦汙染物的方法，解決重金屬汙染環境下草甘膦的微生物降解問題。該方法利用可以在較高濃度重金屬條件下生長的膠紅酵母降解水中的草甘膦，是一種操作簡單、成本低廉的降解水體中草甘膦的方法。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一株膠紅酵母菌(rhodotorulamucilaginosa)op11，其保藏編號為cgmccno.13540。

上述膠紅酵母菌在處理重金屬-草甘膦複合汙染中的應用。

一種重金屬-草甘膦廢水的處理方法，將權利要求1所述的膠紅酵母菌懸浮於含重金屬-草甘膦複合汙染物的廢水中培養。

上述技術方案，進一步地，所述草甘膦的濃度為500mm。

上述技術方案，進一步地，所述重金屬為銅、鎘、鎳或鉻，所述銅的濃度為250mg/kg，鎘的濃度為5mg/kg，鎳的濃度為100mg/kg，鉻的濃度為250mg/kg。

上述技術方案，進一步地，所述膠紅酵母菌的接種量為2-5％。

上述技術方案，進一步地，所述廢水的ph範圍為4.0-9.0。

上述技術方案，進一步地，所述培養的ph範圍為5.0-7.0。

上述技術方案，進一步地，所述培養的溫度為28-35℃。

上述技術方案，進一步地，所述培養時間60-90h。

本發明分離篩選的膠紅酵母菌具有以下優勢：

1.本發明的膠紅酵母菌(rhodotorulamucilaginosa)op11能夠降解草甘膦以其作為唯一碳源生長，培養60h左右達到最大od值。菌株抗草甘膦濃度在500mmol/l以上。在草甘膦濃度為100和250mm的基礎鹽培養基中，培養60h後菌株op11對草甘膦的降解率達到最大，分別為81.9％和79.3％。在草甘膦濃度為500mm時，菌株op11在培養72h時對草甘膦的降解率達到最大，為53.1％。

2.本發明的菌株op11在以草甘膦為唯一碳源的培養基中生長的ph範圍較寬，在ph4.0到ph9.0之間範圍內生長良好，對草甘膦均有較好的降解作用。菌株op11在ph6.0草甘膦的降解率達到最大值，為83.5％。

3.本發明的菌株op11在重金屬cu2+濃度為0-250mg/kg範圍內，均能保持對草甘膦均有較好的降解作用。在重金屬cu2+濃度為0、5、50、100和250mg/kg時，培養60h後，菌株op11對草甘膦的降解率分別為：80.1％、79.7％、72.6％、67.9％和53.1％。

4.本發明的菌株op11在重金屬cd2+濃度為0-5mg/kg範圍內，均能保持對草甘膦均有較好的降解作用。在重金屬cd2+濃度為0、0.25、1、2.5和5mg/kg時，培養60h後，菌株op11對草甘膦的降解率分別為：80.2％、82.6％、70.6％、61.5％和45.8％。

5.本發明的菌株op11在重金屬ni2+濃度為0-100mg/kg範圍內，均能保持對草甘膦均有較好的降解作用。在重金屬cd2+濃度為0、2.5、10、50和100mg/kg時，培養60h後，菌株op11對草甘膦的降解率分別為：81.3％、81.6％、79.6％、60.5％和52.8％。

6.本發明的菌株op11在重金屬cr6+濃度為0-500mg/kg範圍內，均能保持對草甘膦均有較好的降解作用。在重金屬cd2+濃度為0、5、50、100和250mg/kg時，培養60h後，菌株op11對草甘膦的降解率分別為：79.6％、81.2％、76.9％、61.6％和47.8％。

附圖說明

圖1為本發明膠紅酵母op11平板圖；

圖2為本發明膠紅酵母op11鏡檢圖；

圖3為菌株its區域的pcr擴增產物電泳圖(從上到下依次是1000bp、750bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)；

圖4為菌株op11對草甘膦濃度的耐受性；

圖5為菌株op11對不同濃度草甘膦的降解；

圖6為ph對菌株op11降解草甘膦的影響。

生物材料樣品保藏信息：

膠紅酵母(rhodotorulamucilaginosa)op11，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期：2017年1月6日，保藏編號為cgmccno.13540。

具體實施方式

下面結合具體實施例及附圖對本發明做進一步詳細說明。

以下實施例用的材料如下：

富集培養基(g/l)：葡萄糖50g，酵母膏0.5g，(nh4)2s1g，kh2po42.5g，na2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.5g，feso4·7h2o0.02g。

無機鹽培養基(g/l)：mgso4·7h2o0.5g，kcl0.5g，k2hpo41.31g，nano33.0g，feso4·7h2o0.02g。

麥芽汁培養基(g/l)：麥芽汁20g，蛋白腖1g，葡萄糖20g，ph自然。固體培養基加入2.0％的瓊脂。

重金屬cu2+、cd2+、ni2+、cr6+溶液：所用藥品分別為cucl2·2h2o、cdcl2·2.5h2o、nicl2·6h2o、cr2k2o7，天津市申泰化學試劑有限公司生產，分析純，純度≧99％。

實施例1膠紅酵母op11的篩選

(一)菌株的分離及純化

1、菌株的富集：採集長期施用草甘膦的農田土壤樣品2.5g，置於含有60ml富集培養基的搖瓶中，加入由無菌水配置的100mm草甘膦30ml和5mmcucl2溶液10ml，置於搖床中，30℃，180rpm，恆溫振蕩培養4d。

2、菌株的馴化：在無菌條件下按10％的接種量將菌液加入以草甘膦為唯一碳源的無機鹽基礎液體培養基中，草甘膦和cu2+的濃度分別由100mm、250mm增加到500mm，由5mm、10mm增加到15mm。培養液總體積為100ml，置於搖床中，30℃，180rpm，恆溫振蕩培養，4d為一個馴化周期，進行三個周期的馴化。

3、菌株的純化：

經過三個周期的馴化，無菌條件下取100μl培養液在含有草甘膦作為唯一碳源的無機鹽平板上塗布，30℃恆溫培養，挑取單菌落，反覆劃線分離純化，得到單一菌落，如圖1所示。將得到的菌株接種於麥芽汁培養基平板上，4℃保存。

(二)菌株的鑑定

1、形態特徵與基本生理生化特性

菌株op11在固體培養基上菌落形態如圖1所示，菌落呈橙紅色，圓形凸起，邊緣整齊，質地粘稠，有光澤。細胞為橢圓形或卵形，單一、成對、短鏈排列或形成小叢集，如圖2所示。。菌株op11能以多種碳源生長，如葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、d-木糖等，對乙醇和滲透壓有一定的耐受性，其碳、氮源同化試驗結果見表1。

表1菌株膠紅酵母op11的碳、氮源同化

註：+：陽性反應；－：陰性反應；v：可變反應。

2、分子遺傳學分類鑑定

提取到該菌株的dna後進行真菌18srdnaits序列pcr擴增，圖3為菌株its區域的pcr擴增產物電泳圖(從上到下依次是1000bp、750bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，將測序結果在ncbi上進行blast比對分析，發現其與膠紅酵母(rhodotorulamucilaginosah8-4，登錄號為kt976599.1)的dna序列同源性為100％。結合傳統的形態特徵和生理生化鑑定結果，鑑定菌株為膠紅酵母(rhodotorulamucilaginosa)。膠紅酵母op11的its區域基因序列如sequencelisting所示。

實施例2菌株op11對草甘膦的耐受性及降解性

無菌條件下，將純化好的菌株op11在含200mm草甘膦的基礎鹽培養基中預培養24h(od≈1.0)，培養液按照體積分數為5％的接種量接種至基礎鹽培養基中，分別添加不同濃度(100、250和500mm)的草甘膦作為碳源，30℃，180rpm，振蕩培養4d。每隔6h取樣測定菌體生長量和對草甘膦的降解率。使用紫外分光光度計測定菌體在波長600mn處的od值，繪製生長曲線。採用亞硝基化紫外分光光度法測定上清液中草甘膦的濃度。

降解率的計算方法：降解率(％)＝(1-c1/c0)×100。c1：降解菌處理草甘膦殘留濃度，c0：對照處理草甘膦殘留濃度。

由圖4可以看出，在草甘膦濃度為100、250和500mm的基礎鹽培養基中，菌株op11能夠降解草甘膦並以其為唯一碳源生長，第2d有肉眼可見生長。在草甘膦濃度為100和250mm的基礎鹽培養基中，菌株op11培養48h達到最大od值，同時細胞在草甘膦濃度為250mm時生長最快。在草甘膦濃度為500mm時，菌株op11生長相對較慢，培養54h達到最大od值。綜合觀察結果，菌株op11對草甘膦的抗性在500mm以上。

由圖5可以看出，在草甘膦濃度為100、250和500mm的基礎鹽培養基中，隨著培養時間的增加，菌株op11對草甘膦的降解率均表現出逐漸增加的趨勢。在草甘膦濃度為100和250mm的基礎鹽培養基中，培養60h後菌株op11對草甘膦的降解率達到最大，分別為81.9％和79.3％，之後降解率趨於穩定。在草甘膦濃度為500mm時，菌株op11在培養72h時對草甘膦的降解率達到最大，為53.1％。

實施例3不同ph下菌株op11對草甘膦的降解

無菌條件下，將純化好的菌株op11在含200mm草甘膦的基礎鹽培養基中預培養24h(od≈1.0)，培養液按照體積分數為5％的接種量接種至ph分別為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0以250mm草甘膦為唯一碳源的無機鹽培養基中，30℃，180rpm，恆溫振蕩培養60h後測定草甘膦的降解率。草甘膦降解率的測定同實施案例2。

由圖6可以看出，菌株op11在以草甘膦為唯一碳源的培養基中生長的ph範圍較寬，在ph4.0到ph9.0之間範圍內生長良好，對草甘膦均有較好的降解作用。菌株op11對草甘膦降解的最適ph範圍為ph5.0-7.0，在ph6.0草甘膦的降解率達到最大值，為83.5％。

實施例4含銅溶液中菌株op11對草甘膦的降解

無菌條件下，將純化好的菌株op11在含200mm草甘膦的基礎鹽培養基中預培養24h(od≈1.0)，培養液按照體積分數為5％的接種量分別接種至含0、5、50、100和250mg/kgcu2+的以250mm草甘膦為唯一碳源的無機鹽培養基中，30℃，180rpm，恆溫振蕩培養60h後測定草甘膦的降解率。草甘膦降解率的測定同實施案例2。60h後，菌株op11對含0、5、50、100和250mg/kgcu2+的草甘膦溶液降解率分別為：80.1％、79.7％、72.6％、67.9％和53.1％。

實施例5含鎘溶液中菌株op11對草甘膦的降解

無菌條件下，將純化好的菌株op11在含200mm草甘膦的基礎鹽培養基中預培養24h(od≈1.0)，培養液按照體積分數為5％的接種量分別接種至含0、0.25、1、2.5和5mg/kgcd2+的以250mm草甘膦為唯一碳源的無機鹽培養基中，30℃，180rpm，恆溫振蕩培養60h後測定草甘膦的降解率。草甘膦降解率的測定同實施案例2。60h後，菌株op11對含0、0.25、1、2.5和5mg/kgcd2+的草甘膦溶液降解率分別為：80.2％、82.6％、70.6％、61.5％和45.8％。

實施例6含鎳溶液中菌株op11對草甘膦的降解

無菌條件下，將純化好的菌株op11在含200mm草甘膦的基礎鹽培養基中預培養24h(od≈1.0)，培養液按照體積分數為5％的接種量分別接種至含0、2.5、10、50和100mg/kgni2+的以250mm草甘膦為唯一碳源的無機鹽培養基中，30℃，180rpm，恆溫振蕩培養60h後測定草甘膦的降解率。草甘膦降解率的測定同實施案例2。菌株op11對含0、2.5、10、50、和100mg/kgni2+的草甘膦溶液降解率分別為：81.3％、81.6％、79.6％、60.5％和52.8％。

實施例7含鉻溶液中菌株op11對草甘膦的降解

無菌條件下，將純化好的菌株op11在含200mm草甘膦的基礎鹽培養基中預培養24h(od≈1.0)，培養液按照體積分數為5％的接種量分別接種至含0、5、50、100和250mg/kgcr6+的以250mm草甘膦為唯一碳源的無機鹽培養基中，30℃，180rpm，恆溫振蕩培養60h後測定草甘膦的降解率。草甘膦降解率的測定同實施案例2。菌株op11對含0、5、50、100、和250mg/kgcr6+的草甘膦溶液降解率分別為：79.6％、81.2％、76.9％、61.6％和47.8％。

上述實施例2-7表明本發明的菌株op11具有利用草甘膦作為碳、氮源的能力，以及對重金屬具有抗性的能力，可在快速將草甘膦分解同化的同時吸附重金屬，達到降解環境中草甘膦的目的。

sequencelisting

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