一株喜溫酸硫杆狀菌的應用的製作方法
2023-06-14 15:31:01 1
本發明屬於微生物治理重金屬汙染技術領域,具體涉及一株生長迅速、對土壤鎘生物轉化效率高的喜溫酸硫杆狀菌新菌株的應用。
背景技術：
土壤是生態環境的重要組成部分，在各類環境要素中，例如水汙染、大氣汙染嚴重的地區，隨著水流、降雨、大氣流動等自然現象，汙染物最終進入土壤，逐漸轉化為土壤汙染，使土壤成為汙染物的最終受體。重金屬在土壤中的吸附和聚集等作用，逐漸導致土壤中重金屬含量嚴重超標，土壤內源汙染嚴重。當前，土壤汙染導致的不良影響備受關注，成為了環境治理的熱點，採用微生物修復土壤中cr、cd、pb等重金屬不但具有耗能少，操作簡單等優點，同時也是一種環境友好型的可持續發展的治理手段。
acidithiobacilluscaldus是一種無機化能自養型的杆狀微生物，屬於革蘭氏陰性菌。主要與硫化礦系的生物浸出息息相關，其對礦石微生物浸出的機制為直接作用，喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldus)吸附在礦物表面，通過蛋白分泌物或其他代謝產物直接將硫化礦氧化分解，使硫化礦的晶格破壞，分解成為金屬離子和硫單質，喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldus)再進一步將硫單質氧化生成硫酸。
acidithiobacilluscaldus將硫單質氧化成硫酸，有助於還原土壤中的重金屬，促進重金屬的溶解，同時產生的硫酸降低土壤的ph，使土壤中陽離子交換能力減弱，進而使金屬和土壤成分靜電吸引力減弱，降低土壤對金屬的吸附能力，使其溶解在溶液中，有助於土壤重金屬汙染的治理。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種喜溫酸硫杆狀菌新菌株在土壤中鎘的生物轉化上的應用。該菌株生長迅速、產酸能力強，並能對土壤中鐵錳結合態鎘變成小分子可溶性鎘進行高效的生物轉化，為微生物在環境治理和生物冶金等方面的高效開發利用提供技術指導。
一株喜溫酸硫杆狀菌的應用，利用該菌株dx-csu將土壤中的鎘去除，該菌株命名為acidithiobacilluscaldus，保藏編號為cgmccno.14008。具體是利用該菌株將土壤中鐵錳結合態鎘轉變成小分子可溶性鎘。
作為進一步的改進，將9k培養基培養的菌濃為1×108～1×109cell/ml的菌液以固液質量體積比為1g:10ml添加至鎘汙染土壤的錐形瓶中，培養6d以上。
本發明所提供的喜溫酸硫杆狀菌是喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldus)dx-csu，保藏編號為cgmccno.14008。
所述的acidithiobacilluscaldusdx-csu的篩選方法如下：：
(1)將德興採集的礦樣加入內裝100ml無菌水和玻璃珠的三角瓶中；
(2)將步驟(1)的三角瓶放置恆溫搖床中培養；
(3)從步驟(2)中取懸濁液加入9ml無菌水中，依次稀釋10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10倍；
(4)取步驟(3)懸濁液1ml加入100ml滅菌的改良的9k培養基中，置於45℃恆溫箱中培養0.5d、1d和3d；
(5)將步驟(4)每個濃度重複3次；
(6)將(3)至(5)步驟重複4-5次。
acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株16srrna基因序列測序結果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株的16srrna基因序列見序列表，根據測序結果與genbank中喜溫酸硫杆狀菌16srrna基因序列進行同源性比較，結果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu屬於喜溫酸硫杆狀菌。
acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株全基因組基因序列測序結果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株的全基因序列與genbank中喜溫酸硫杆狀菌全基因序列進行同源性比較，結果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu是一個新的菌株。
本發明的喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)的培養基，其為改良的9k培養基，包含：k2hpo40.5g/l；ca(no3)2·4h2o0.01g/l；kcl,0.1g/l；mgso4·7h2o0.5g/l；(nh4)2so43.0g/l，1000ml蒸餾水；用稀h2so4調ph值至2.5，加入0.2％的硫粉作為能源物質。
本發明的喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)的培養方法，採用上述的培養基，接種的喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)濃度為1.0×106個/毫升，初始ph值為2.5，培養溫度為45℃，搖床轉速170rpm。
本發明提供的一株喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)生長迅速、產酸能力強，對土壤鎘生物轉化效率高，有助於解決環境中重金屬汙染問題，以及生物冶金技術中低品位礦石的金屬生物浸出。
本發明喜溫酸硫杆狀菌株dx-csu命名為喜溫酸硫杆狀菌acidithiobacilluscaldus，保藏編號為cgmccno.14008，於2017年4月10日保藏於中國微生物菌種保藏管理文員會普通微生物中心(cgmcc)。地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。
附圖說明
圖1為四株不同種的喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldus)培養基溶液ph隨時間變化；
圖2為四株不同種的喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldus)培養基溶液eh隨時間變化；
圖3為四株不同種的喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldus)培養基中菌濃度隨時間變化；
圖4為acidithiobacilluscaldusdx-csu作用下土壤溶液中鐵錳結合態鎘的變化；
圖5a為基於喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldus)不同菌株的全基因組構建的系統發育樹；
b為acidithiobacilluscaldusdx-csu全基因組草圖。
具體實施方式
以下結合實施例只在進一步說明本發明，而非限制本發明。
實施例1、喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)的分離
喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)的分離從德興地礦石採集礦樣10g，加入內裝100ml無菌水和玻璃珠的三角瓶中，於170r/min搖床上振蕩20min，取1ml加入9ml無菌水中，依次稀釋10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10倍，分別取以上懸濁液1ml加入100ml滅菌的9k培養基中，每個濃度重複3次，置於45℃恆溫箱中培養0.5d、1d和3d，重複4-5次上述步驟對細菌進行分離和純化。
實施例2、喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)的鑑定
(1)acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株16srrna基因序列測序結果顯示acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株的16srrna基因序列見序列表，根據測序結果與genbank中喜溫酸硫杆狀菌16srrna基因序列進行同源性比較，結果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu屬於喜溫酸硫杆狀菌。
(2)acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株全基因組基因序列測序結果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株的全基因的測序結果與genbank中喜溫酸硫杆狀菌全基因序列進行同源性比較，結果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu是一個新的菌株。
實施例3、喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldus)的生理性質
比較了本實驗室篩選的四株不同種的喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldus)培養基溶液ph和eh隨時間變化；其結果表明本發明的喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)ph明顯低於其他三種，同時結果表明本發明的喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)eh明顯高於其他三種，說明本發明菌株產酸能力強。見說明書附圖1，2。
比較了四株不同種的喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldus)培養基中菌濃度隨時間變化；其結果表明本發明的喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)生長速度明顯快於其他三種。見說明書附圖3。
實施例4、喜溫酸硫杆狀菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)在cd汙染土壤中生物去除效率實驗
(1)採集鎘汙染土壤作為供試土壤，混合均勻後，選取部分測量該土壤中原始鐵錳結合態鎘的濃度。
(2)9k培養基121℃滅菌30min，將菌液(菌濃為1×108～1×109cell/ml)以固液質量體積比為1g:10ml添加至含供試土壤的錐形瓶中，培養6d，分別於培養的2d，4d，5d，6d測量土壤中鐵錳結合態，結果表明，acidithiobacilluscaldusdx-csu能有效降低土壤中鐵錳結合態鎘含量,生物去除率可達到49.5％，明顯高於其餘三株菌。見說明書附圖4。
sequencelisting
中南大學
湖南省農業生物技術研究中心
一株喜溫酸硫杆狀菌的應用
無
1
patentinversion3.3
1
1402
dna
acidithiobacilluscaldusdx-csu16srrna序列表
1
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