防治十字花科根腫病的生物製劑及其應用的製作方法
2023-06-14 14:12:16 2
專利名稱：：防治十字花科根腫病的生物製劑及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬微生物
技術領域：
，主要涉及一種防治十字花科作物根腫病的生物製劑及其應用。
背景技術：
：根腫病最早發現於地中海西岸和歐洲南部，目前，在世界各國均有分布，造成至少10%的經濟損失。根腫病亦廣泛分布於我國的浙江、廣東、廣西、湖南、福建、江西、江蘇、安徽、四川、雲南、新疆、西藏、遼寧、山東、上海、北京以及重慶等省(市、自治區)，可以說基本上覆蓋了我國的十字花科植物的主栽區。該病由低等、較原始的真菌---芸苔根腫菌(屍to,^o//wm^m/cae)(或被稱為原生動物)引起，極難防治。該菌為專性寄生，主要危害十字花科植物的根部，能夠產生吲哚乙酸和細胞分裂素等激素類物質，致使植物的根部組織膨大。根腫部一般為紡錘型、手指型和不規則型等。根腫初期表面光滑，後期常發生龜裂，易被其他微生物侵染而腐爛。通常苗期就可受害，嚴重時幼苗枯死。成株期受害，地上部分初期表現生長緩慢、矮小，基部葉片中午萎蔫，早晚恢復；後期基部葉片變黃，且萎蔫症狀不能恢復，嚴重時全株枯死。由該病引起的十字花科作物損失佔世界範圍的十字花科作物總量的10%以上，在發病的區域引起損失一般在20-90%之間，病菌以厚垣孢子在病殘體和土壤中休眠，借流水、土壤移動和秧苗擴散傳播。厚垣孢子在無十字科作物的土壤中仍能存活10年以上，導致種植過十字花科作物的地塊在短期內不能再種植同科作物。根腫病危害嚴重，但對其的防治效果不理想。目前，控制根腫病的措施主要有檢疫、抗病品種、輪作、調節土壤的pH值和土壤化學消毒等。生產上栽培的十字花科作物的抗病性較差，有人鑑定了404份甘藍，未找到抗病品種，有限的抗性基因主要來自歐洲的蕪菁，而且病菌致病性存在分化，即有生理小種分化，致使同一抗病品種在一地抗病，在另一地抗性較差，而且即使抗病品種，其抗性也不像水稻對稻瘟病、小麥對銹病那樣，呈現很高抗性。有報導誘發休眠孢子萌發的措施，減少田間孢子數量，可減輕下一茬目標作物根腫病發生程度。有報導稱咖啡酸和雲實精能促進休眠孢子萌發。種植多葉蘿蔔作為誘餌植物，能誘使休眠孢子萌發，可減少孢子量71-94%，但不能減輕大白菜根腫病發生程度。堆肥可殺死病殘體中的病菌量，當溫度升至54-73°C6-7天，可殺死病菌。輪作是非常有效的防治措施，特別是十字花科作物與非十字花科作物輪作，效果更明顯。然而，根腫病菌還能侵染旱金蓮，木瓜，白木犀草和甜菜等產生內源芥子酸的非十字花科植物，不產生典型的腫瘤，但能形成具有活力的厚垣孢子。這些結果表明輪作適用作物範圍還是有限的，而且在已建成的蔬菜基地，特別是設施農業基地，輪作很難被完全採用。長期以來，調節土壤pH值被認為是最有效的措施之一。利用石灰及其他形式的鈣鹽在一定程度上可以調節土壤pH值，可有效減少休眠孢子的萌發，起到控制該病害的效果。鈣鹽處理既可以調節土壤的pH，又可以增加土壤中可交換Ca2+的濃度從而減輕病害的危害。有人在比較Ca(OH)2、CaC03和KOH對根腫病的防治效果時發現，KOH對根腫病的防治效果不及Ca(0H)2和CaCO:,，這充分說明根腫病的發生與土壤中鈣的含量有著密切關係。但是長期使用石灰對土壤結構、生理生化性狀都會造成不良影響。常用的化學防治主要採用兩種方法，即化學燻蒸和化學藥劑灌根，由於前者要求特殊設備和高投入，後者因施藥麻煩、成本高不能大面積推廣應用，且兩者均對土壤生態系具有破壞作用和殘留問題，致使化學防治亦不能在生產上發揮作用。如溴甲烷和威百畝等高效、廣譜，但長期使用導致土壤退化和有益微生物的消亡；溴甲烷還導致大氣臭氧層的破壞，聯合國1997年規定2005年發達國家全面禁止其使用，至2015年，發展中國家禁用，同時威百畝等廣譜燻蒸劑出於價格高的原因也不易被農民接受，目前也僅在溫室等局部範圍應用，還沒有在大面積的田間使用。在澆灌的農藥中，五氯硝基苯，苯菌靈和百菌清應用較多。據報導，每穴用300mL1000倍液的百菌清淋施，對直播大白菜的根腫病控制效果可以達到86.2%;對於移栽大白菜，控制效果可以達到71.7%，損失率控制在20%以下。然而，由於防治成本過高(每畝需要80元以上)及殘留問題，在十字花科作物中還沒有大量應用。一種德國產的化學肥料Perlka，其主要成分為石灰氮，也常被用來防治根腫病，但低濃度使用，防效不好，如高濃度使用，易產生藥害。生物防治因對環境友好和易於使用而在其他作物病害上己部分地發揮作用。但用於根腫病這類特殊病害防治一直停滯不前。人們首先想到從土壤中分離具有抑菌活性的菌株。如從小麥、油菜、大白菜和象草地裡生長的大白菜根中分離根殖真菌，663份樣本中分離到了322個菌株，其中186個菌株來自小麥地裡的大白菜根。它們分屬18個屬，2個有隔菌群，有色和淡色有隔菌約佔50%。在消毒土壤中，16個菌株可以完全抑制根腫病菌，其中有兩個根內生菌(//他racom',c/"eto^/m)在自然土中也能高效抑制根腫病，用它們來處理種子，植株亦很健康，而且有一個菌株還能促進植株生長。但這些菌株還沒有在大田自然土中有效地應用。有人報導利用P/wmaJCM9972可以抑制根腫病休眠孢子的萌發並有效控制根腫病的發生，其主要抑菌物質為頂環氧菌素(N-[3-氯-5-(三氟甲基)-2-吡啶基]-3-氯-4-(三氟甲基)-2,6-二硝基苯胺)，且250ug.mL-l頂環氧菌素能夠完全抑制休眠孢子的萌發。在田間試驗中，產生幾丁質酶的放線菌泣w/;tom;;c^取AC-3與有機肥按2%的比例混合對根腫病的防治效果明顯好於單用有機肥的效果，且與有機肥混用時根腫病危害程度可以減輕50%。綜上所述，迄今為止，世界上尚未見到利用微生物生防製劑成功用於大田防治十字花科根腫病的報導。
發明內容本發明的目的正是為了克服上述現有技術的不足，提供一種高效、無毒、安全、無殘留，對環境友好，使用簡便的防治十字花科根腫病的生物製劑。本發明採用的細菌是枯草芽孢桿菌(5acz7/^^6"fo)XF-l菌株，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京.中關村；保藏日2008年l月24日，保藏登記入冊的編號CGMCCNO.2357。本發明的生產菌株枯草芽孢桿菌(5a"7/^犯^/to)XF-1，分離自雲南省昆明市官渡區大板橋鎮大白菜根際土，經形態學、培養性狀、常規生理生化和Biolog全自動鑑定系統測定，該菌株為枯草芽孢桿菌的一個新菌株(Sad//^)XF-1。該菌株具有以下特徵(1)在LB培養基上培養初期菌落淡乳白色，膿狀，圓形，邊緣整齊，菌落隆起呈饅頭狀，表面溼潤；培養後期菌落淡黃色，邊緣不整齊，表面乾燥有褶皺；在顯微鏡下觀察菌體短杆狀，大小0.70.8X2.02.4ixm;產生芽孢，芽孢中生，橢圓形，孢囊稍膨大，周生鞭毛、具運動性。(2)該菌株定殖能力強，抑菌能力強，具有殺菌、防病和增產作用。該菌還能在十字花科根際土中定殖。(3)該菌株具有以下生理生化特徵革蘭氏染色陽性，好氧生長；能利用糖原、蔗糖、D-乳糖、D-果糖、D-山梨醇、L-鼠李糖、D-甘露醇、檸檬酸鹽，水解明膠、澱粉、酪素，不能水解纖維素，不能水解酪氨酸，具過氧化氫酶，氧化酶活性，V.P.試驗陽性，5"U下不能生長，10°C-55"C可生長。本發明是這樣實現的枯草芽孢桿菌(^d/to^^'to)XF-l菌株的試管培養，搖床擴大培養，發酵培養製備為生物製劑，然後運用於十字花科作物的根際土壤中，測定其對十字花科根腫病的防治效果和十字花科作物產量。本發明生防菌株枯草芽孢桿菌(&cv7/mXF-1的培養方法(以下為重量百分比)(1)、固體培養接種於固體培養基(1%胰蛋白腖，0.5%酵母膏，l%NaCl，1.5%瓊脂)中，於3(TC培養箱中培養2天。(2)、液體培養把生防菌接種於裝有液體培養基(黃豆粉2.0%，玉米粉1.0%，葡萄糖0.3%，蛋白腖0.3%，CaC030.2%，(NH4)2S040.05%,MgS04.7H200.03%，KH2P040.1%，NaOHO.1°/。，花生油0.2%，消泡劑0.01%,pH6.8-7.0。)有500ml三角瓶中，每瓶裝200ml，在3(TC溫度下，轉速150-200rpm的搖床上培養48h，即可作為製劑。也可將上述培養液接至發酵罐中進行發酵生產，獲得液體製劑。發酵罐中的生產條件罐溫發酵罐中溫度控制在3(TC37。C,通過插入培養基的溫度計測量，以夾層內通入冷卻水或熱水的方法進行調節。罐壓發酵罐的罐壓控制在0.5/平方釐米，通過無菌空氣入口和廢氣排放口進行調節。攪拌發酵罐的攪拌速度為200轉/分鐘。抽樣檢査和培養條件調節每隔2小時自取樣管取樣1次，測定pH值，並塗片以結晶紫染色鏡檢菌體形態、有無雜菌的汙染，觀察菌體是否產生芽孢等，等鏡檢菌體芽孢數佔整個菌體的5%以上時，減少通風量和降低培養溫度至25'C左右，其他條件不變，繼續發酵和抽樣檢查，待芽孢數佔整個菌體的90%以上時，停止發酵和放罐。放罐時，鏡檢計數，並用培養基平板方法進行活菌的計數。培養周期發酵罐的培養周期約為36-48小時。液體發酵製劑經平板計數測定含菌量，含菌量達200億CFU/ml，供田間防治根腫病之用。本發明生物製劑防治十字花科作物根腫病田間防效試驗和增產試驗1.製備生物製劑按前述枯草芽孢桿菌(5a"7/^^^"fc)XF-1菌株培養方法製備試驗用製劑。2.生防菌XF-1液體製劑對十字花科作物大白菜(品種83-4)、白菜(品種上海青)和甘藍型油菜(品種花油3號)的根腫病ffl間防效試驗和增產試驗。2.1供試藥劑及處理A.生防菌XF-1液體製劑100倍稀釋液採用澆根法，在播種時每株大白菜澆100毫升，每株白菜和每株甘藍型油菜各澆50毫升；間隔10天後，再澆l次；再間隔15天澆第三次；甘藍型油菜再間隔20天澆第四次，每株甘藍型油菜再澆50毫升。B.生防菌XF-l液體製劑200倍稀釋液採用澆根法，在播種時每株大白菜澆100毫升，每株白菜和每株甘藍型油菜各澆50毫升；間隔10天後，再澆l次；再間隔15天澆第三次；甘藍型油菜再間隔20天澆第四次，每株甘藍型油菜再澆50C.生防菌XF-l液體製劑500倍稀釋液採用澆根法，在播種時每株大白菜澆100毫升，每株白菜和每株甘藍型油菜各澆50毫升；間隔10天後，再澆l次；再間隔15天澆第三次；甘藍型油菜再間隔20天澆第四次，每株甘藍型油菜再澆50D.對照殺菌劑75%百菌清可溼性粉500倍稀釋液採用澆根法，在播種時每株大白菜澆100毫升，每株白菜和每株甘藍型油菜各澆50毫升；間隔10天後，再澆l次；再間隔15天澆第三次；甘藍型油菜再間隔20天澆第四次，每株甘藍型油菜再澆50毫升。E.空白對照施用清水，採用澆根法，在播種時每株大白菜澆100毫升，每株白菜和每株甘藍型油菜各澆50毫升；間隔10天後，再澆l次；再間隔15天澆第三次；甘藍型油菜再間隔20天澆第四次，每株甘藍型油菜再澆50毫升。2.2試驗方法供試作物有大白菜、白菜和甘藍型油菜，試驗地點在雲南省昆明市盤龍區大板橋鎮復興新村。除施藥設置不同水平外，其他m間管理同常規生產。試驗設5個處理，3次重複，共15個小區。小區面積20平方米，隨機排列。四周高保護行，收穫時每小區分開測產。2.3調査方法在白菜和白菜收穫期調查病情和測定地上部生物學產量。在甘藍型油菜收穫期調查病情和測定經濟學產量(油菜種子)。大白菜、白菜和甘藍型油菜根腫病調査均以根部腫瘤的大小為依據，採用5個級別方法進行調査0級無任何腫瘤；l級主根腫大，其直徑小於二倍莖基；3級主根腫大，其直徑為莖基的2-3倍；5級主根腫大，其直徑為莖基的3-4倍；7級主根腫大，其直徑為莖基的4倍以上。死亡植株按7級計算。E(各級病穗數X相對級數值)病情指數=-----------------------------xioo調査總穗數X7防治效果計算採用與對照相比較，計算公式如下對照病情指數_處理病情指數防治效果(％)=-----------------------------X100對照病情指數3.試驗結果3.1生防菌XF-1液體製劑防治大白菜根腫病的田間藥效和增產試驗效果表1.生防菌XF-1液體製劑防治大白根腫病效果tableseeoriginaldocumentpage9從表1和表2可以看出，生防菌株XF-1液體製劑對大白菜根腫病有很好的防治效果和挽回產量的作用，其中以稀釋100倍的效果最好，在收穫期的防治效果仍達84.8%，灌根200倍和500倍的防治效果分別達79.2%和68.6%,明顯高於常用化學農藥75%百菌清可溼性粉500倍稀釋液的防治效果；生防菌株XF-1液體製劑可增加大白菜產量160.3%-190.8%，明顯高於75%百菌清可溼性粉500倍處理的79.4%，即產量是不用藥劑空白對照的2.6-2.9倍，是75%百菌清可溼性粉500倍處理的1.5-1.6倍。3.2生防菌XF-1液體製劑防治白菜根腫病的田間藥效和增產試驗效果表3.生防菌XF-1液體製劑防治白菜根腫病效果病情指數總株平均病株率平均病指防治效果(%)處理重複I重複II重複III數(株)CK74.172.173.145010073.1稀釋100倍10.211.410.845012.410.883.9稀釋200倍13.314.513.545022.513.879.8稀釋500倍21.624.323.545028.923.167.075%百菌清500倍34.335.637.94505535.949.5表4.生防菌XF-1液體製劑防治白菜根腫病的增產效果處理小區產量(kg)重複I重複IIIII折合畝產j(kg)畝增產(kg)增產率(%)CK稀釋100倍稀釋200倍稀釋500倍75%百菌清500倍24.163.059.449.533.621.163.958.850.633.922.9757.763.12112.01354.3178.759.11970.31212.6160.050.71676.3918.6121.233.31120.0362.347.8從表3和表4可以看出，生防菌株XF-1液體製劑對白菜根腫病有很好的防治效果和挽回產量的作用，其中以稀釋100倍的效果最好，在收穫期的防治效果仍達83.9%，灌根200倍和500倍的防治效果分別達79.8%和67.0%，明顯高於常用化學農藥75%百菌清可溼性粉500倍稀釋液的防治效果；生防菌株XF-1液體製劑可增加大白菜產量121.2%-178.7%，明顯高於75%百菌清可溼性粉500倍處理的47.8%,即產量是不用藥劑空白對照的2.2-2.8倍，是75%百菌清可溼性粉500倍處理的1.5-1.9倍。3.3生防菌XF-1液體製劑防治油菜根腫病的田間藥效和增產試驗效果表5.生防菌XF-l液體製劑防治甘藍型油菜根腫病效果tableseeoriginaldocumentpage11表6.生防菌XF-1液體製劑防治甘藍型油菜根腫病的增產效果tableseeoriginaldocumentpage11從表5和表6可以看出，生防菌株XF-1液體製劑對甘藍型油菜根腫病有很好的防治效果和挽回產量的作用，其中以稀釋IOO倍的效果最好，在收穫期的防治效果仍達84.9%，灌根200倍和500倍的防治效果分別達81.86%和74.3%，明顯高於常用化學農藥75%百菌清可溼性粉500倍稀釋液的防治效果；生防菌株XF-1液體製劑可增加甘藍型油菜產量105.2%-144.7%，明顯高於75%百菌清可溼性粉500倍處理的44.6%，即產量是不用藥劑空白對照的2.1-2.4倍，是75%百菌清可溼性粉500倍處理的1.4-1.7倍。在大白菜、白菜和甘藍型油菜的應用結果表明，以生防菌株XF-1為基礎的生防製劑具有很好的控制根腫病的效果和增產作用，己具備了生產上大量推廣應用的基本條件。本發明的製劑已在雲南省昆明市盤龍區大板橋鎮進行了田間小區防效試驗，證明該生防製劑防治效果顯著、穩定，可以有效地解決長期困擾農民的十字花科根腫病的防治難題，對大白菜、白菜和甘藍型油菜油菜根腫病的防治效果達68.6-84.8%。具體實施例方式本生防製劑可以與其他的殺真菌農藥、植物生長調節劑混合使用，但必須保證所混藥劑對本發明採用的枯草芽孢桿菌(&"7/1^^&//&)XF-l無副作用。本發明的細菌生防製劑一般在作物播種期、播種後10天、播種後25天及此後的每隔15天左右再次施用。方法是將菌液用清水稀釋100-500倍液，澆灌於植株的根部。本發明具有對十字花科根腫病防治效果顯著，適用於十字花科作物的生長前期和中期，其有成本低、使用簡便、有效期較長等特點。下面用實施實例來進一歩詳述本發明，但本發明的內容並不局限於此。實施例一將枯草芽孢桿菌(Ba"7/Mw6"fc)XF-1轉到試管斜面培養基上，試管斜面培養的配方為1%胰蛋白腖，0.5%酵母膏，1%NaCl，1.5%瓊脂，pH7.0。在30。C的培養箱中培養2天，獲得試管種。液體發酵培養基配方黃豆粉2.0%，玉米粉1.0%，葡萄糖0.3%，蛋白腖0.3%，CaC030.2%，(NH4)2S040.05%，MgS04.7H200.03%，KH2P040.1%，NaOH0.1%，花生油0.2%,消泡劑0.01%，pH6.8-7.0;將試管種接種到500ral三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養基中，在30'C下，轉速為150rpm的搖床上培養48h，所得培養液即為本發明的生物製劑。實施例二首先將獲得試管種(同實施例一)，將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養基中，培養基配方為黃豆粉2.0%，玉米粉1.0%，葡萄糖0.3%,蛋白腖0.3%，CaC030.2%，(Iffl4)2S040.05%，MgS04.7H200.03%,KH2P040.1%，NaOH0.1%，花生油0.2%，消泡劑0.01%，pH6.8-7.0。在3(TC下，轉速為180rpm的搖床上培養48h，所得培養液即為本發明的生物製劑。實施例三首先將獲得試管種(同實施例一)，將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養基中，培養基配方為黃豆粉2.0%,玉米粉1.0%，葡萄糖0.3%，蛋白腖0.3%，CaC030.2%，(NH4)2S040.05%，MgS04.7H200.03%,KH2P040.1%，NaOH0.1%,花生油0.2%，消泡劑0.01%，pH6.8-7.0。在3(TC下，轉速為200rpm的搖床上培養48h，所得培養液轉接至發酵罐中進行發酵生產，獲得發酵液即為本發明的生物製劑。發酵罐中的生產條件罐溫發酵罐中溫度控制在3(TC37"C,通過插入培養基的溫度計測量，以夾層內通入冷卻水或熱水的方法進行調節。罐壓發酵罐的罐壓控制在0.5/平方釐米，通過無菌空氣入口和廢氣排放口進行調節。攪拌發酵罐的攪拌速度為200轉/分鐘。抽樣檢査和培養條件調節每隔2小時自取樣管取樣1次，測定pH值，並塗片以結晶紫染色鏡檢菌體形態、有無雜菌的汙染，觀察菌體是否產生芽孢等，等鏡檢菌體芽孢數佔整個菌體的5%以上時，減少通風量和降低培養溫度至25'C左右，其他條件不變，繼續發酵和抽樣檢査，待芽孢數佔整個菌體的90%以上時，停止發酵和放罐。放罐時，鏡檢計數，並用培養基平板方法進行活菌的計數。培養周期發酵罐的培養周期約為36-48小時。權利要求1、一種防治十字花科根腫病的生物製劑，其特徵在於該製劑的生產菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)XF-1，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日2008年1月24日，保藏號CGMCCNO.2357。2、權利要求1所述枯草芽孢桿菌(Sac!7/^幼6"fc)XF-1，菌株的培養方法，其特徵在於所述菌株是經過常規的液體和固體發酵培養獲得的，其液體和固體發酵培養基配方如下(1)液體發酵培養基配方黃豆粉2.0%，玉米粉1.0%,葡萄糖0.3%，蛋白腖O.3%，CaC030.2%，(NH4)2S040.05%，MgS04.7H200.03%，KH2P040.1%，NaOH0.1%，花生油0.2%,消泡劑0.01%,pH6.8-7.0;(2)固體發酵培養基配方1%胰蛋白腖，0.5%酵母膏，l%NaCl，1.5%瓊脂pH6.8—7.0。3、權利要求1所述的枯草芽孢桿菌(&"7/^^^)XF-l菌株在防治十字花科根腫病中的應用。全文摘要本發明涉及一種防治十字花科根腫病的生物製劑及其應用，屬生物農藥
技術領域：
。其生產菌株為解澱粉芽孢桿菌(Bacillussubtilis)XF-1菌株，保藏號CGMCCNO.2357。該菌株有以下特徵(1)在LB培養基上初期菌落淺白色，圓形，表面溼潤；後期菌落淡黃色，邊緣不整，表面幹皺；在顯微鏡下觀察菌體短杆狀，有芽孢，周鞭、能運動，大小0.7～0.8×2.0～2.4μm。(2)革蘭氏陽性，好氧；利用糖原、蔗糖、檸檬酸鹽，水解明膠、澱粉、酪素，不利用纖維素和酪氨酸，過氧化氫酶陽性。(3)有殺菌、防病和增產作用。本發明是這樣實現的解澱粉芽孢桿菌XF-1菌株的試管和搖床培養以及發酵培養液製備為生物製劑，然後施用於十字花科作物根際土壤中，有很好的防治和增產效果，易於工廠生產。文檔編號C12N1/20GK101416641SQ200810058919公開日2009年4月29日申請日期2008年9月12日優先權日2008年9月12日發明者何月秋,熊國如,範成明申請人:雲南農業大學