一種基因敲除打靶載體及其應用的製作方法

2023-11-11 18:07:27

專利名稱：一種基因敲除打靶載體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因敲除打靶載體及其應用，具體地說，涉及一種無啟動子的同 時帶有正、負篩選基因的基因敲除打靶載體及其應用。
背景技術：
2000年第一例體細胞基因打靶克隆羊誕生之後，體細胞基因打靶結合核移植技術 被廣泛應用於對大動物基因組進行定點修飾。基因打靶基於的原理是DNA分子間的同源 重組。在大動物體細胞中，同源重組的概率非常低，表現在細胞轉染後經過藥物篩選獲得 的隨機整合的細胞遠遠多於同源重組的細胞，往往需要篩選大量的細胞才能獲得基因打靶 的細胞。儘管之前的研究採用很多篩選方法，比如正負篩選、無啟動子篩選等用來排除隨 機整合的細胞，但這種富集基因打靶事件的效率一般在0.41% -11% (Kuroiwa等，2004 ； Takahagi, 2005 ；Shen，2007)。通常需要從上百個細胞克隆點中篩選出幾個發生了基因打靶 的細胞克隆，極大地增加了後續細胞凍存和鑑定的工作。PRNP基因編碼朊蛋白。結構異常的朊蛋白是狂牛症和羊瘙癢病的致病蛋白。理論 上講，敲除了 PRNP基因的牛羊將不再被狂牛症或瘙癢病傳染。目前，對牛羊的PRNP基因的 敲除已經有3個課題組獲得成功，他們使用的載體及細胞篩選方法富集基因打靶的效率分 別為 10. 3% (55/533，Denning 等，2001)、0· 6% (1/163，Yu 等，2006)、4· 9% (10/204, Zhu, 2008) ,6. 4% (13/203，Kuroiwa, 2004) ,5. 2% (17/327，Kuroiwa，2004)，也就是說，他們需 要從上百個細胞中篩選出幾個發生了 PRNP基因打靶的細胞，很容易丟失陽性細胞。本發明利用構建的無啟動子打靶載體和負篩選基因簡單高效的獲得了 PRNP基因 敲除細胞，富集效率為100% (2/2)和60% (3/5)。本研究的最大優點是細胞篩選方法簡 單，不需大量人力物力，以及極大地方便了後續的細胞凍存和鑑定，大大降低了基因打靶的 成本。

發明內容
本發明的目的在於克服現有的富集基因打靶細胞效率低而存在的缺陷，提供一種 基因敲除打靶載體，所要解決的技術問題是通過基因敲除打靶載體轉染細胞，提高富集基 因打靶細胞效率，從而簡化基因打靶細胞的篩選與鑑定工作，大大降低了基因打靶的成本。本發明的目的及解決其技術問題是採用以下的技術方案來實現的。依據本發明提 供的一種基因敲除打靶載體，其包括正篩選基因，在正篩選基因的兩端具有重組酶識別序 列，所述重組酶識別序列的另一端分別與被敲除基因的5』同源臂和3』同源臂相連，所述兩 同源臂的內部不具有啟動正篩選基因表達的啟動子，在所述同源臂的外側還具有負篩選基 因。本發明的目的及解決其技術問題還可以採用以下的技術措施來進一步實現。前述的基因敲除打靶載體，所述正篩選基因為編碼新黴素磷酸轉移酶(neo)、潮 黴素B磷酸轉移酶(hph)、黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸轉移酶(gpt)、次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(hprt)或嘌呤黴素乙醯轉移酶(puro)的基因。前述的基因敲除打靶載體，所述負篩選基因為胸腺去氧核苷(DTA)，或者編碼次黃 嘌呤磷酸核糖轉移酶(hprt)、黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸轉移酶(gpt)、胸腺嘧啶激酶(tk)、白喉 毒素(DT)或單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)的基因。前述的基因敲除打靶載體，所述重組酶識別序列為Cre酶識別序列或FLP酶識別 序列。前述的基因敲除打靶載體，所述同源臂為牛PRNP基因的序列。前述的基因敲除打靶載體，其為LoxPneo-PRNP KO或LoxPhyg-PRNP KO0所述打靶載體在胞內定點敲除基因中的應用。一種提高基因打靶細胞富集率的方法，使用前述的打靶載體轉染細胞，通過含有 與正篩選基因相應藥物的培養基篩選陽性克隆，使陽性克隆得到富集。一種敲除牛PRNP基因的方法，其包括使用LoxPneo-PRNP KO和LoxPhyg-PRNP KO 之一的打靶載體轉染細胞並用相應的藥物篩選培養基進行篩選，再用另一個打靶載體轉染 細胞並用相應的藥物篩選培養基進行篩選。前述的敲除牛PRNP基因的方法，其使用打靶載體LoxPneo-PRNPKO轉染牛成纖維 細胞，在含有G418的細胞培養基上篩選得到陽性細胞克隆，並對陽性細胞克隆進行鑑定； 用LoxPhyg-PRNP KO轉染PRNP基因一個等位基因發生敲除的牛成纖維細胞，並用含潮黴素 B的細胞培養基篩選陽性細胞克隆，並對陽性細胞克隆進行鑑定。藉由上述技術方案，本發明至少具有下列優點及有益效果(1)本發明首次將無啟動子打靶載體與正、負篩選基因結合使用，因此，能夠極大 地排除隨機整合的細胞，提高打靶細胞富集效率；(2)在構建基因敲除打靶載體時，本發明首次在無啟動子的正篩選基因兩側引入 LoxP序列，以方便後續的標記基因的刪除；(3)經基因敲除打靶載體轉染後的細胞，富集基因打靶細胞效率高，細胞篩選方法 簡單，不需大量人力物力，極大地方便了後續的細胞凍存和鑑定，大大降低了基因打靶的成 本。上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段， 而可依照說明書的內容予以實施，並且為了讓本發明的上述和其他目的、特徵和優點能夠 更明顯易懂，以下特舉較佳實施例，並配合附圖，詳細說明如下。


圖1為本發明較佳實施例PRNP基因無啟動子打靶載體構建流程圖。圖2為本發明較佳實施例pMD19-T-5，同源臂質粒酶切鑑定圖，M，Ikb DNA marker ； 1，質粒對照；2，Not I單酶切，5kb ；3，Not I和BsiW I雙酶切，2. 7kb+2. 3kb ；4，5，同源臂 PCR產物對照，2. 3kb。圖3為本發明較佳實施例pGEM-T-3，同源臂質粒酶切鑑定圖，M，Ikb DNA marker ； 1，質粒對照；2，Nhe I 和 Sal I 雙酶切，7. lkb+3. Okb ；3，Nhe I 單酶切，10. lkb。圖4為本發明較佳實施例LoxPhyg-PRNP KO質粒酶切鑑定圖，1，15kb DNA marker ； 2，Nhe I 單酶切，15，472bp ;3，Sac II 酶切，12. 3kb+3. Ikb ;4，Not I 和 Sal I 雙酶切，10. 9kb+4. 5kb ；5，Not I 和 Nhe I 雙酶切，11. 5kb+3. 9kb ；6，質粒對照；7，Ikb DNA marker 圖5為本發明較佳實施例LoxPneo-PRNP KO質粒酶切鑑定圖，1，15kb DNA marker ； 2，Sac II 單酶切，15，113bp ;3，Not I 和 NheI 雙酶切，11. 5kb+3. 5kb ;4，Not I 和 Sal I 雙酶切，10. 6kb+4. 5kb ;5，Nhe I 和 Sal I 雙酶切，8. lkb+7. Okb ;6，質粒對照；7，Ikb DNA markerο
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例1 PRNP基因無啟動子打靶載體的構建PRNP基因無啟動子打靶載體的構建過程請參閱圖1。在本實施例中，取牛胎兒皮膚組織剪碎成Imm3左右的小塊，DMEM/F12清洗兩遍後 分批植塊於含ImL DMEM/F12+10% FBS的25cm2的培養瓶中，待組織塊貼壁牢固後再補加 DMEM/F12+10% FBS至6mL，於37°C、5% CO2培養箱培養6 7天，每2天換液1次，待細胞 生長匯合後，以0. 25%胰蛋白酶消化傳代2 3次，分批以DMEM/F12+20% FBS+10% DMSO 凍存，獲得牛胎兒成纖維細胞。以牛胎兒成纖維細胞的基因組為模板，分別擴增5』同源臂和3』同源臂。5』 同源臂的引物為，LoxP-5F:5』 -TTGC/GGCCGCTATAACACAG CCAGGCATTC AG-3，， 下劃線部分為Not I限制性內切酶識別位點；LoxP-5R :5，TCT C/GTACG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAGTTAT GATGAC TTATCTGCAA AATAAAG-3，，下劃線部分為 BsiW I 限制 性內切酶識別位點，斜體部分是IoxP序列。5 』同源臂長度為2，323bp，從PRNP基因(Genbank No. AJ298878)的63，256bp到65，578bp處，包含了 PRNP基因第三外顯子上遊2，313bp和第 三外顯子前IObp的序列(即第三外顯子翻譯起始位點ATG上遊的序列)。3，同源臂的引物為，LoxP-3F 5，-ATTG/CTAGCCCTCTTATACATTTTGGCAGTG-3，，下 劃線部分為Nhe I限制性內切酶識別位點；LoxP-3R:5，-TAT G/TCGAC GAAACAGTGGAAAGTG TCAGAC-3』，下劃線部分為Sal I限制性內切酶識別位點。3』同源臂長度為7，074bp，從PRNP 基因的66，020bp到73，093bp處，包含了 PRNP基因第三外顯子內452bp以後直到第三外顯 子下遊3，434bp的序列。因此，經過基因敲除後，PRNP基因的第三外顯子將會被刪除442bp， 此序列恰好是PRNP基因編碼框的前442bp。同源臂的PCR反應體系反應體系為50μ 1反應體系，其中牛胎兒成纖維細胞基因 組 2μ KlOOng/μ 1)，primer(20pmol/μ 1)各 1μ 1，dNTP(10mM)8y 1，5XLA PCR Buffer 5 μ 1，LA Taq 酶(Takara) 0. 5 μ 1，用水補足 50 μ 1 體系。反應條件如下94°C lmin，98°C 10sec68°C 24sec，30 個循環，68°C 10min，4°C保存。將PCR擴增產物與pMD19-T載體(TaKaRa)或pGEM_T載體(Promega)進行連接、 轉化，挑取重組子，進行酶切和測序鑑定，請參閱圖2和圖3。測序結果表明該序列與已知序 列的同源性達到99. 9%，可以作為同源臂使用。在牛中PRNP基因是位於13號染色體的單拷貝基因，因此，為了敲除PRNP基因的 兩個等位基因需要對成纖維細胞進行兩輪打靶，這就需要使用兩種不同的正篩選基因進行 細胞篩選。本發明選擇了新黴素基因和潮黴素B基因作為兩種正篩選基因。本發明利用PCR擴增的方法，分別從打靶載體骨架載體pPGKneoLoxP2PGKDTA (Clontech 公司)和商業化載體pIREShyg3 (Clontech 公司)上擴增出 neo-polyA序列和 hyg-polyA 序列。擴增 neo-polyA序列的 PCR 引物為，LoxP-neoF 5'-TCT C/GTACGCCACCATGGG ATCG GCCATTGAACAAG-3，，下劃線部分為BsiWI限制性內切酶識別位 點，ATG 為 neo 基因翻譯起始位點；LoxP-neoR :5，-TAA G/CTAGC GGACCTAATAACTTCGTATAAT GTATGCTATAC-3，，下劃線部分為Nhe I限制性內切酶識別位點。PCR產物大小為1，216bp， 包括完整的neo-polyA序列及其下遊的IoxP序列。擴增hyg-polyA 序列的 PCR 引物為，LoxP-hygF :5，TCTC/GTACGCCACCATGGA TAGATC CGGAAAGCCTG-3，，下劃線部分為BsiWI限制性內切酶識別位點，ATG為hyg基因翻 譯起始位點LoxP-hygR :5』 -TAAG/CTAGC ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGA AG TTATCTAG AATGCAGTGAAAAAAATG-3，，下劃線部分為Nhe I限制性內切酶識別位點，斜體部分是IoxP序 列。PCR產物大小為l，614bp，包括完整的hyg-polyA序列及通過PCR引物添加的IoxP序 列。擴增neo-polyA序列和hyg-polyA序列的PCR反應體系為50 μ 1反應體系，其中 質粒 1μ KlOOng/μ 1) ,primer (20pmol/μ 1)各 1 μ 1, dNTP (IOmM) 6 μ 1，5XLA PCR Buffer 5 μ 1，LA Taq 酶(Takara) 0. 3 μ 1，用水補足 50 μ 1 體系。反應條件如下94°C 5min，94°C 20sec60°C 30sec 72°C lmin，35 個循環，72°C 7min，4°C保存。將PCR擴增產物與Promega pGEM_T載體進行連接、轉化，挑取在T載體多克隆位 點處連接順序為Not I-Bsiff I-neo/hyg-polyA-Nhel的重組子，進行酶切和測序鑑定。測 序結果表明neo-polyA序列和hyg-polyA序列與載體上的相應序列完全一致，理論上說，打 靶載體發生定點整合後，在PRNP基因啟動子的作用下應該能夠表達出抗性蛋白。連接方向 正確的重組子稱為pGEM-T-Neo/Hyg PA載體。將pGEM-T-Neo/Hyg PA質粒和pMD19_T_5，同源臂質粒小量提取後，經過Not I 和BsiW I酶切，分別回收線性化的pGEM-T-Neo/HygPA載體和5』同源臂，經過連接、轉化 後，挑取有5』同源臂插入的重組子，進行酶切和測序鑑定，連接正確的稱為pGEM-T-Neo/ HygPA-5』 臂。將pGEM-T-Neo/Hyg PA-5，臂載體和打靶載體骨架載體pPGKneoLoxP2PGKDTA小量 提取後，經過Not I和Nhe I酶切，分別回收線性化的打靶載體骨架載體和Not 1_5』同源 臂-neo/hyg PA-NheI序列，經過連接、轉化後，挑取有Not 1-5』同源臂-neo/hyg PA-NheI 序列插入的重組子，進行酶切和測序鑑定，連接正確的稱為LoxPneo/hygPGKDTA-5』臂。將LoxPneo/hygPGKDTA-5 』臂質粒和pGEM_T_3，同源臂質粒小量提取後，經過Nhe I和Sal I酶切，分別回收線性化的LoxPneo/hygPGKDTA-5』臂載體和3』同源臂，經過連接、 轉化後，挑取有3』同源臂插入的重組子，進行酶切和測序鑑定，請參閱圖4和圖5，連接正確 的稱為 LoxPneo/hyg-PRNP K0，大小分別為 15，113bp 和 15，472bp。實施例2牛胎兒成纖維細胞轉染及細胞篩選本發明要對牛PRNP基因的兩個等位基因進行敲除，對第一個等位基因敲除用的 是脂質體細胞轉染方法，對第二個等位基因進行敲除用的是Lonza公司的細胞核電轉染 法。2. 1牛PRNP第一個等位基因的敲除接種牛胎兒成纖維細胞於6孔細胞培養板中，在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養至70-80%匯合度時，按照說明書要求，用Lipofectamine 2000脂質體將經過Not I 線性化的PRNP基因打靶載體LoxPneo-PRNP KO轉入細胞中；細胞轉染48h後，胰酶消化法將細胞從6孔板中消化下來，每IOOmm細胞培養皿接 4X105個細胞，並用G418濃度為600 μ g/mL的細胞培養基篩選細胞7_9d ；用細胞克隆環將具有G418抗性的細胞克隆點挑選出來接種到24孔細胞培養板 中，待細胞培養至80%匯合，胰酶消化後，一部分液氮凍存，另一部分繼續培養至長滿6孔 板的一孔，提取細胞基因組，採用PCR擴增的方法對細胞克隆點進行鑑定。得到的敲除細胞 命名為ko-E細胞。2. 2牛PRNP第二個等位基因的敲除將T75細胞培養瓶中培養至80%匯合的ko-E細胞用胰酶消化法消化下來，每 IX 107個細胞用ImL Lonza細胞核轉液重懸，向細胞重懸液中加入80 μ g Not I線性化的 LoxPhyg-PRNP-KO無啟動子打靶載體，充分混勻後，每個電擊杯中加入100 μ L細胞-載體混 合液，按照NucleofectorTM細胞核電擊儀程序Τ036電擊；電擊結束後，每個電擊杯中的細胞接種至一個60mm細胞培養皿中，用含有10% FBS的DMEM細胞培養基培養48h，胰酶消化法將60mm細胞培養皿中的細胞消化下來，每個 60mm細胞培養皿中的細胞經過稀釋後接種到6個IOOmrn細胞培養皿中，並用潮黴素B終濃 度為150 μ g/mL的細胞培養基篩選細胞7-9d ；用細胞克隆環將具有潮黴素B抗性的細胞克隆點挑選出來接種到24孔細胞培養 板中待細胞培養至80%匯合，胰酶消化後，一部分液氮凍存，另一部分繼續培養至長滿6孔 板的一孔，提取細胞基因組，採用PCR擴增的方法對細胞克隆點進行鑑定。經過PCR鑑定，獲得的2個具有G418抗性的細胞克隆點均為PRNP+/-細胞， LoxPneo-PRNP KO基因打靶載體富集基因打靶的效率為100% ；獲得的5個具有潮黴素B抗 性的細胞克隆點其中有3個為PRNP-/-細胞，LoxPhyg-PRNP KO基因打靶載體富集基因打 靶的效率為60%。本發明與以往研究最大的不同是，通過提高基因打靶載體的富集效率從而簡化了 基因打靶的細胞篩選與鑑定工作。在本發明中，細胞經過打靶載體轉染和藥物篩選後，一個 IOOmrn細胞培養皿中最多可以獲得2個細胞克隆點，很方便就可以把它挑取出來繼續培養， 之後的鑑定工作證明這幾個細胞克隆點往往就是經過基因打靶的細胞，幾乎100%排除了 隨機整合的細胞。此外，本發明構建的無啟動子打靶載體上的真核抗性基因都是被IoxP位 點錨定的，可以通過Cre/loxP系統對其進行刪除，這種策略在以往的無啟動子打靶載體構 建中很少有人報導。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。參考文獻K. J. McCreath, J. Howcroft, K. H. S. Campbell, A. CoIman, Α. Ε. Schnieke & Α. J. Kind, Production ofgene-targeted sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells, Nature,2000,405 (29) :1066-1069C. Denning, S.Burl, A. Ainslie, J.Bracken, et al.Deletion of the α (1,3)galactosyl transferase (GGTAl) geneandthe prion protein (PrP) gene in sheep. Nature biotechnology, 2001,19 :559_562.Guohua Yu, Jianquan Chen, et al. Functional disruption of the prion proteingene in cloned goats. Journal ofgeneral virology,2006,87 :1019-1027.Caihong Zhu, Bei Li, et al. Production of Prnp-/~goats by gene targeting in adult fibroblasts. 2008, Transgenicresearch,Yoshimi Kuroiwa, et al. Sequential targeting of the genes encoding immunoglobulin-μ and prion protein in cattle.Nature genetics,2004,36 (7) 775-780.序列表北京濟普霖生物技術有限公司 一種基因敲除打靶載體及其應用KHP09112684. 18PatentIn version 3. 5132DNA人工序列1ttgcggccgc tataacacag ccaggcattc ag32266DNA人工序列2tctcgtacga taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatgatgact tatctgcaaa 60ataaag66331DNA人工序列3attgctagcc ctcttataca ttttggcagt g31431DNA人工序列4tatgtcgacg aaacagtgga aagtgtcaga c31
36
DNA
人工序列
5
tctcgtacgc caccatggga tcggccattg aacaag36
6
42
DNA
人工序列
6
taagctagcg gacctaataa cttcgtataa tgtatgctat ac42
7
36
DNA
人工序列
7
tctcgtacgc caccatggat agatecggaa agcctg36
8
65
DNA
人工序列
8
taagctagca taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatctagaat gcagtgaaaa60
aaatg65
9
權利要求
一種基因敲除打靶載體，其包括正篩選基因，在正篩選基因的兩端具有重組酶識別序列，所述重組酶識別序列的另一端分別與被敲除基因的5』同源臂和3』同源臂相連，所述兩同源臂的內部不具有啟動正篩選基因表達的啟動子，在所述同源臂的外側還具有負篩選基因。
2.如權利要求1所述的打靶載體，其特徵在於，所述正篩選基因為編碼新黴素磷酸轉 移酶、潮黴素B磷酸轉移酶、黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸轉移酶、次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶或嘌呤 黴素乙醯轉移酶的基因。
3.如權利要求1所述的打靶載體，其特徵在於，所述負篩選基因為胸腺去氧核苷，或者 編碼次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶、黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸轉移酶、胸腺嘧啶激酶、白喉毒素或單 純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶的基因。
4.如權利要求1 3任意一項所述的打靶載體，其特徵在於，所述重組酶識別序列為 Cre酶識別序列或FLP酶識別序列。
5.如權利要求4所述的打靶載體，其特徵在於，所述同源臂為牛PRNP基因的序列。
6.如權利要求5所述的打靶載體，其為LoxPneo-PRNPKO或LoxPhyg-PRNP KO0
7.權利要求1 6任意一項所述打靶載體在細胞內定點敲除基因中的應用。
8.一種提高基因打靶細胞富集效率的方法，其特徵在於，使用權利要求1 6任意一項 所述打靶載體轉染細胞，通過含有與正篩選基因相應藥物的培養基篩選陽性克隆，使陽性 克隆得到富集。
9.一種敲除牛PRNP基因的方法，其包括使用LoxPneo-PRNP KO和LoxPhyg-PRNP KO之 一的打靶載體轉染細胞並用相應的藥物篩選培養基進行篩選，再用另一個打靶載體轉染細 胞並用相應的藥物篩選培養基進行篩選。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，使用打靶載體LoxPneo-PRNPKO轉染牛成 纖維細胞，在含有G418的細胞培養基上篩選得到陽性細胞克隆，並對陽性細胞克隆進行鑑 定；用LoxPhyg-PRNP KO轉染PRNP基因一個等位基因發生敲除的牛成纖維細胞，並用含潮 黴素B的細胞培養基篩選陽性細胞克隆，並對陽性細胞克隆進行鑑定。
全文摘要
本發明涉及一種基因敲除打靶載體，包括正篩選基因，在正篩選基因的兩端具有重組酶識別序列，該重組酶識別序列的另一端分別與被敲除基因的5』同源臂和3』同源臂相連，所述兩同源臂的內部不具有啟動正篩選基因表達的啟動子，在所述同源臂的外側還具有負篩選基因。所述打靶載體轉染細胞，通過含有與正篩選基因相應藥物的培養基篩選陽性克隆，得到的陽性克隆富集效率高，細胞篩選方法簡單，不需大量人力物力，極大地方便了後續的細胞凍存和鑑定，大大降低了基因打靶的成本。
文檔編號C12N15/63GK101955961SQ20091008816
公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月3日 優先權日2009年7月3日
發明者丁方榮, 戴蘊平, 李寧, 李松, 王少華 申請人:北京濟福霖生物技術有限公司