一種內皮克隆形成細胞的分離方法
2023-06-13 22:41:26
一種內皮克隆形成細胞的分離方法
【專利摘要】本發明公開了一種內皮克隆形成細胞的分離方法，包括如下步驟：（1）酶消化：取臍帶，用鹼性或中性緩衝液衝洗臍帶靜脈至流出的液體透明，在臍帶靜脈中充入膠原酶或者膠原酶與胰酶的混合酶，消化15～60min，收集消化液；（2）機械刮取：將臍帶靜脈剖開，暴露出臍帶靜脈內表面，用細胞刮刮取臍帶靜脈內表面3～10分鐘，用鹼性或中性緩衝液洗滌，收集洗滌液；（3）將步驟（1）的消化液和步驟（2）的洗滌液合併，離心，去上清，即可。本發明內皮克隆形成細胞的分離方法，可以從臍帶靜脈中有效分離內皮克隆形成細胞，臨床應用前景優良。
【專利說明】—種內皮克隆形成細胞的分罔方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及內皮克隆形成細胞的分離方法。
【背景技術】
[0002]內皮祖細胞是內皮細胞的前體細胞，在維持血管內皮環境穩定中扮演著重要的角色。根據內皮祖細胞(EPCs)克隆形態、出現時間先後和細胞增殖潛力，體外培養的外周血MNCs可分化出早期和晚期EPCs。內皮克隆形成細胞是近年來發現的一種晚期EPCs亞群，因具有更強的增殖能力及血管形成能力，是理想的移植種子細胞。內皮克隆形成細胞可以從骨髓、臍帶血、外周血、臍帶等多種組織當中分離獲得。
[0003]臍帶靜脈含有大量的內皮克隆形成細胞，取材容易，操作簡單，是分離內皮克隆形成細胞的良好來源。目前，通常採取酶消化法或機械刮取法，從臍帶靜脈上獲取內皮克隆細胞，接種到適合的培養基中培養。但是，採用機械刮取的方法，內皮克隆形成細胞與膠原組織不能成功分離，分離效率低，而酶消化法的分離也往往不夠徹底，分離效率低。
[0004]建立一種高效的內皮克隆形成細胞分離培養方法，對臨床大規模應用有重要的意義。
【發明內容】
[0005]為了克服現有技術的缺陷，本發明提供了一種新的內皮克隆形成細胞的分離方法。
[0006]本發明內皮克隆形成細胞的分離方法，包括如下步驟:
[0007](I)酶消化:取臍帶靜脈，用鹼性或中性緩衝液灌注衝洗至流出的液體透明，灌入膠原酶或者膠原酶與胰酶的混合酶，封閉兩端，消化15~60min，打開兩端，收集消化液；
[0008](2)機械刮取:將臍帶靜脈剖開，暴露出臍帶靜脈內表面，用細胞刮刮取臍帶靜脈內表面3~10分鐘，再用鹼性或中性緩衝液洗滌，收集洗滌液；
[0009](3)將步驟(1)的消化液和步驟(2)的洗滌液合併，離心，去上清，即可。
[0010]步驟(1)中，所述鹼性或中性緩衝液是PBS緩衝液、DPBS緩衝液或者Hanks緩衝液。
[0011]步驟(1)中，所述膠原酶是II型膠原酶。
[0012]步驟(1)中，所述膠原酶的濃度為0.2%，所述胰酶的濃度為0.5%，膠原酶與胰酶的體積比為1:1。
[0013]步驟(1)中，所述消化的溫度為37°C。
[0014]步驟(1)中，所述消化的時間是15~30min。
[0015]步驟(2 )中，所述刮取的時間是5分鐘。
[0016]步驟(2)中，所述鹼性或中性緩衝液是PBS緩衝液、DPBS緩衝液或者Hanks緩衝液。
[0017]步驟(2)中，所述緩衝液的用量為臍帶靜脈長度的0.5~1.5倍(ml/cm)。優選地，所述緩衝液的用量為臍帶靜脈長度的I倍(ml/cm)。
[0018]本發明內皮克隆形成細胞的分離方法，通過酶消化工藝和機械刮取工藝的特定組合，有效地將內皮克隆形成細胞從臍帶靜脈組織中分離，獲得的細胞數量多，分離效率高，臨床應用前景優良。
[0019]下面通過【具體實施方式】對本發明做進一步詳細說明，但是並不是對本發明的限制，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0020]圖1為PO代細胞形態特徵；
[0021]圖2為內皮克隆形成細胞細胞表面標誌檢測；
[0022]圖3為內皮克隆形成細胞的LDL內吞實驗，圖中的光信號為內皮克隆形成細胞內吞後的LDL在雷射的激發下發出的陽性信號；
[0023]圖4為內皮克隆形成細胞的體外血管形成實驗。
【具體實施方式】:
[0024]實施例1本發明 內皮克隆形成細胞的分離方法
[0025]臍帶取自足月順產或剖腹產的健康產婦，採集後放於含雙抗的PBS溶液中4°C保存，48h內處理。反覆清洗，並用磷酸緩衝液PBS灌注衝洗臍帶靜脈，直至流出液體透明。
[0026]用止血鉗夾住臍帶一端，用移液槍將II型膠原酶(濃度0.2%)加入並充滿臍帶靜脈，用止血鉗夾住臍帶另一端；37°C搖床消化30分鐘；消化完成後，取下止血鉗，收集消化液到50ml離心管中；將臍帶沿臍帶靜脈剖開，暴露出臍帶靜脈內表面，用細胞刮輕刮臍帶靜脈5分鐘；用PBS溶液清洗，所述緩衝液的用量為臍帶靜脈長度的I倍(ml/cm)，收集洗滌液與離心管中。
[0027]將收集細胞的離心管在4°C、500g的條件下，離心5分鐘，即可。
[0028]實施例2本發明內皮克隆形成細胞的分離方法
[0029]臍帶取自足月順產或剖腹產的健康產婦，採集後放於含雙抗的DPBS緩衝液中4°C保存，48h內處理。反覆清洗，並用磷酸緩衝液PBS灌注衝洗臍帶靜脈，直至流出液體透明。
[0030]用止血鉗夾住臍帶一端，用移液槍將II型膠原酶(濃度0.2%)加入並充滿臍帶靜脈，用止血鉗夾住臍帶另一端；37°C搖床消15分鐘；消化完成後，取下止血鉗，收集消化液到50ml離心管中；將臍帶沿臍帶靜脈剖開，暴露出臍帶靜脈內表面，用細胞刮輕刮臍帶靜脈3分鐘；用DPBS緩衝液清洗，所述緩衝液的用量為臍帶靜脈長度的1.5倍(ml/cm)，收集洗滌液與離心管中。
[0031]將收集細胞的離心管在4°C、500g的條件下，離心5分鐘，即可。
[0032]實施例3本發明內皮克隆形成細胞的分離方法
[0033]臍帶取自足月順產或剖腹產的健康產婦，採集後放於含雙抗的Hanks緩衝液中4°C保存，48h內處理。反覆清洗，並用磷酸緩衝液PBS灌注衝洗臍帶靜脈，直至流出液體透明。
[0034]用止血鉗夾住臍帶一端，用移液槍將II型膠原酶(濃度0.2%)與胰酶(濃度為0.5%)按1:1 (v/v)組成的混合酶(雙酶)，加入並充滿臍帶靜脈，用止血鉗夾住臍帶另一端；37°C搖床消60分鐘；消化完成後，取下止血鉗，收集消化液到50ml離心管中；將臍帶沿臍帶靜脈剖開，暴露出臍帶靜脈內表面，用細胞刮輕刮臍帶靜脈10分鐘；用Hanks緩衝液清洗，所述緩衝液的用量為臍帶靜脈長度的0.5倍(ml/cm)，收集洗滌液與離心管中。
[0035]將收集細胞的離心管在4°C、500g的條件下，離心5分鐘，即可。
[0036]實施例4不同內皮克隆形成細胞的分離方法的比較
[0037]1、材料與方法
[0038]臍帶取自足月順產或剖腹產的健康產婦，採集後放於含雙抗的PBS溶液中4°C保存，48h內處理。反覆清洗，並用磷酸緩衝液PBS灌注衝洗臍帶靜脈，直至流出液體透明。分別用不同的方法進行分離。
[0039]A.酶消化法:用止血鉗夾住臍帶一端,用移液槍將II型膠原酶(0.2%)加入並充滿臍帶靜脈，用止血鉗夾住臍帶另一端；37°C搖床消化15分鐘；消化完成後，取下止血鉗，收集消化液到50ml離心管中，再用PBS溶液衝洗靜脈，PBS溶液的用量為臍帶靜脈長度的I倍(ml/cm)，收集洗滌液到離心管。
[0040]B.機械刮取法:將臍帶沿臍帶靜脈剖開，暴露出臍帶靜脈內表面，用細胞刮刮臍帶靜脈5分鐘；用PBS溶液清洗，PBS溶液的用量為臍帶靜脈長度的I倍(ml/cm)，收集洗滌液於離心管中。
[0041]C.本發明方法(酶消化+機械刮取法):用止血鉗夾住臍帶一端，用移液槍將II型膠原酶(0.2%)加入並充滿臍帶靜脈，用止血鉗夾住臍帶另一端；37°C搖床消化30分鐘；消化完成後，取下止血鉗，收集消化液到50ml離心管中；將臍帶沿臍帶靜脈剖開，暴露出臍帶靜脈內表面，用細胞刮刮臍帶靜脈5分鐘；用PBS清洗，PBS溶液的用量為臍帶靜脈長度的I倍(ml/cm)，收集洗滌液與離心管中。
[0042]三種方法處理後，收集細胞的離心管分別4°C，500g,離心5分鐘。分別用EGM2-MV培養基重懸，接種到I型鼠尾膠原鋪板後的35mm培養皿中，按每2cm臍帶接種一個35mm皿的量接種細胞，置於37°C，體積分數5%的CO2飽和溼度培養箱中培養。根據細胞生長情況，每2-3天全量換液一次。生長最快組別的細胞達到90%匯合度時，用0.05%的胰酶/EDTA消化，計數比較各組PO代細胞的數量。
[0043]2、實驗結果
[0044]如圖1所示，本發明方法獲得的細胞形態呈鋪路石狀，折光較好，屬於內皮克隆形成細胞。
[0045]三種方法獲得的內皮克隆形成細胞PO代數量如表1所示:
[0046]表1不同方法獲得的細胞數量比較
【權利要求】
1.一種內皮克隆形成細胞的分離方法，其特徵在於:包括如下步驟: (1)酶消化:取臍帶靜脈，用鹼性或中性緩衝液灌注衝洗至流出的液體透明，灌入膠原酶或者膠原酶與胰酶的混合酶，封閉兩端，消化15~60min，打開兩端，收集消化液； (2)機械刮取:將臍帶靜脈剖開，暴露出臍帶靜脈內表面，用細胞刮刮取臍帶靜脈內表面3~10分鐘，再用鹼性或中性緩衝液洗滌，收集洗滌液； (3)將步驟(1)的消化液和步驟(2)的洗滌液合併，離心，去上清，即可。
2.根據權利要求1所述的分離方法，其特徵在於:步驟(1)中，所述鹼性或中性緩衝液是PBS緩衝液、DPBS緩衝液或者Hanks緩衝液。
3.根據權利要求1所述的分離方法，其特徵在於:步驟(1)中，所述膠原酶是II型膠原酶。
4.根據權利要求1所述的分離方法，其特徵在於:步驟(1)中，所述膠原酶的濃度為0.2%，所述胰酶的濃度為0.5%，膠原酶與胰酶的體積比為1:1。
5.根據權利要求1所述的分離方法，其特徵在於:步驟(1)中，所述消化的溫度為37。。。
6.根據權利要求1所述的分離方法，其特徵在於:步驟(1)中，所述消化的時間是15~30mino
7.根據權利要求1所述的分離方法，其特徵在於:步驟(2)中，所述刮取的時間是5分`鍾。
8.根據權利要求1所述的分離方法，其特徵在於:步驟(2)中，所述鹼性或中性緩衝液是PBS緩衝液、DPBS緩衝液或者Hanks緩衝液。
9.根據權利要求1所述的分離方法，其特徵在於:步驟(2)中，所述緩衝液的用量為臍帶靜脈長度的0.5~1.5倍(ml/cm)。
10.根據權利要求9所述的分離方法，其特徵在於:所述緩衝液的用量為臍帶靜脈長度的 I 倍(ml/cm)。
【文檔編號】C12N5/071GK103525753SQ201310436011
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月23日 優先權日:2013年9月23日
【發明者】賴真陽, 陳強, 李雪蓮, 鍾立武 申請人:四川新生命幹細胞科技股份有限公司