用於治療組織炎症的新多肽的製作方法
2023-06-13 22:23:11 1
專利名稱：用於治療組織炎症的新多肽的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫藥生物技術領域。本發明涉及多肽固相化學合成、多肽大規模純化及凍幹、理化性質測定、治療應用等技術。
背景技術：
炎症是致炎因子 對機體的損害作用所誘發的以防禦為主的綜合性反應，是生理學和免疫學事件的一個完整的過程。炎症的特徵是毛細管的擴張、白細胞的浸泡、發紅、發熱、疼痛和腫脹。多形核中性白細胞和嗜酸性細胞是主要的炎症介質和釋放生長因子、細胞因子、前列腺素、白三烯和加劇組織損傷的蛋白酶的名單中的物質。以血管系統改變為中心的一系列局部反應，有利於清除消滅致病因子，液體的滲出可稀釋毒素，吞噬搬運壞死組織以利於再生和修復，使致病因子局限在炎症部位而不致蔓延全身。因此，炎症是機體的防禦性反應，通常對機體是有利的，如果沒有炎症反應，人們將不能長期生存於這個充滿致炎因子的自然環境中。但是炎症對機體也有潛在的很大危害性，嚴重的過敏反應可危及病人的生命；心包腔內纖維索性滲出物機化可形成縮窄性心包炎，進而影響心功能；發生於腦實質或腦膜的炎症可引起顱內壓升高，甚至形成腦疝致使生命中樞受壓而造成病人死亡；此外聲帶急性炎症水腫可導致窒息，等等。因此在一定情況下應採取措施控制炎症反應。英國Scripps研究院的Tamas Bartfai在一篇評論中解釋說,在發生周圍炎症之後，研究人員發現原炎性細胞素的IL-1 β腦脊髓液濃度可增高10000倍，主要是向大腦發出有關局部炎症信息的IL-1 β在腦脊髓液中的水平增高。鞘內給予可抑制IL-1 β產生或阻斷神經元的IL-1 β受體的藥物能明顯地減少痛覺過敏。當採用系統性給藥方式投用相同藥物時，其抑制作用較差低濃度時是有效的。目前用於治療炎症的抗炎藥如免疫抑制劑、非甾類抗炎藥、環氧合酶(C0X-2)抑制劑和蛋白酶抑制劑。但這些抗炎藥中許多具有副作用。如非留體消炎藥副作用，主要在胃腸道方面如胃腸道出血、胃潰瘍等。蛋白酶抑制劑不良反應表現為，一些接受抗HIV治療的患者在服用蛋白酶抑制劑後出現了脂肪的異常分布。因此，需要新的抗炎藥的開發以減少或消除其帶來的副作用。
發明內容
本發明的目是公布一種新的具有組織保護活性的多肽。該多肽含有8-15個胺基酸殘基、分子量為900-1600道爾頓，實驗結果表明具有多種組織保護活性。本發明多肽作為治療組織炎症的主要成分具有新的醫藥用途。本發明公布了採用本發明多肽與一種或多種藥物載體組合製備各種藥物機型的方法以及本發明多肽對於各種組織炎症具有良好的保護，治療和治癒作用。本發明多肽可通過多肽的固相化學合成獲得。本發明公布了其序列、化學合成方法、純化以及理化性能。
本發明多肽以多種方式給予很低劑量(通常為毫克或納克/公斤體重)時即對幾乎所有的器官和組織顯示出保護作用。多項動物實驗表明，本發明的多肽可以削弱由化學誘導引起的肝、肺、結腸和胃等組織的損傷，抑制炎性反應，減少消化道潰瘍，減少肝臟和膽道的損傷，還具有抗焦慮和抗抑鬱作用。可以促進血管生成、促進創傷癒合等，可以逆轉由神經毒素MPTP誘導的帕金森症模型中的異常。另外，對於胃黏膜具有顯著的保護作用，還可以緩解炎症反應。本發明 公布的多肽序列具有以下結構通式:XaaZaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro AlaAsp ZaaAla Xaa Xaa Xaa或者:[Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala]其中Xaa是中性脂肪族胺基酸殘基，特別是Ala、bAla、Leu、lie、Gly、Val.Nle或Nva,Yaa是鹼性胺基酸殘基,特別是Lys、Arg、Orn或His,Zaa是酸性胺基酸殘基,特別是Glu、Asp、Aad或Apm。本發明多肽的胺基酸序列的具體組合記錄於序列表中。本發明的多肽合成後，可以做成游離態形式，也可以做成陽離子鹽，如:TFA鹽(三氟乙酸鹽)，HCl鹽(鹽酸鹽)，醋酸鹽形式。本發明的多肽，選擇和一種或多種藥物載體組合，製成多種藥物劑型，用於治療。這些藥物劑型涵蓋:注射溶液、片劑、霜劑、膠囊、軟膏、洗劑、舌含片等劑型局部或全身給藥。劑量優選在10_5 10_2mg/kg體重的範圍內，以0.1%-0.5%的較高濃度全身或局部給藥。對於具體治療的最佳劑量的確定是本領域技術人員熟知的。具體實施方法實施例1:多肽的化學合成及純化:以SEQ ID No所示的胺基酸序列為例化學合成多肽。採用Fmoc固相法合成:採用固相合成儀器，選用0.5克的val-2氯三苯甲基樹脂為起始樹脂，合成反應管中依次加入:Fmoc-leu, Fmoc-gly, Fmoc-ala, Fmoc-Asp (otbu)fmoc-asp (otbu), Fmoc-ala,Fmoc-pro, Fmoc-lys (boc)，FMoc-gly, FMoc-pro, Fmoc-pro, FMoc-pro, Fmoc-Glu(otbu),Fmoc-gly.
試劑瓶中加入DIC/DMF溶液和H0BT/DMF溶液和DMF溶液。啟動合成儀器連接電腦，輸入合成程序，開始合成。合成的後處理:把樹脂從合成反應柱中取出，放入一底部有燒結玻璃濾片的玻璃容器中，分別依次用DMF ( 二甲基甲醯胺)，DCM( 二氯甲烷)，MeOH(甲醇)，DCM, Me0H5_10倍的樹脂體積衝洗樹脂。衝洗後的樹脂冷凍乾燥。樹脂衝洗完畢，另取一帶玻璃塞的試管，配置20毫升裂解試劑，配置方式如下:(1):加17.5毫升TFA (三氟乙酸)於試管中(TFA有強腐蝕性和揮發性，應在通風廚中操作)
(2):加 EDC0.5 毫升(3):加 thioanisole I 毫升(4):加 anisole0.4 毫升以上試劑 都加入後，輕微震蕩混勻，加入放入樹脂的玻璃容器中。反應2.5小時。待反應完畢，用真空抽濾的辦法分離樹脂和裂解試劑。把裂解試劑放入一球形燒瓶中，用旋轉蒸發的辦法減壓蒸去液體物質，只留下固體。另取100毫升的冷乙醚加入球形燒瓶中，此時有大量的白色沉澱物質，為粗多肽。離心分離乙醚和多肽。丟棄上清乙醚，多肽繼續用冷乙醚洗滌，離心，得到多肽粗品。多肽粗品用凍幹機凍幹，用於下一步純化。合成產物的純化:多肽粗品I克，溶於5毫升的純水中，過濾，上製備級高效液相色譜。色譜配40*250mm的C18反相柱。流動相:A相0.1 %的TFA+水B 相 0.1 % 的 TFA+ 乙腈。採用程序:B在40分鐘內從5%上升到55%，收集主峰，得到溶於流動相的多肽純
品O上述溶液狀態的多肽，採用低溫旋轉蒸發方式初步濃縮，然後用凍幹機冷凍乾燥。得到純品。純品的質譜
圖1及HPLC圖2見說明書附圖。實施例2:穩定性試驗將本發明多肽於40°C保溫76天和120天測試其穩定性。穩定性試驗採用HPLC方法進行測定。水溶液中多肽的濃度為0.2% (w/v):柱，Kromasill00，5u，250x 4.6mm ;流動相，0.1 %三氟乙酸的水/乙睛溶液(O至50vol.%)，在25分鐘內梯度洗脫，流速lml/min ；檢測:UV，218nm。為了進行比較，使用游離的多肽及其單乙酸鹽。表I
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權利要求
1.一種多肽，其特徵是，所述多肽的胺基酸序列選自SEQ ID No所示的胺基酸序列的多肽。
2.權利要求1記載的多肽，其特徵是，含有8-15個胺基酸殘基、分子量為900-1600道爾頓並且具有多種組織保護活性。所述多肽具有結構通式:Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa YaaPro Ala Asp Zaa Ala Xaa XaaXaa或者:[ZaaProProProXaaYaaProAla], 其中乂8&是中性脂肪族胺基酸殘基，特別是41&4麼1&、1^11、116、617、￥&1、犯6或化&， Yaa是鹼性胺基酸殘基,特別是Lys、Arg、Orn或His, Zaa是酸性胺基酸殘基,特別是Glu、Asp、Aad或Apm。
3.一種藥物製劑，其特徵是，權利要求1或2記載的多肽，選擇與一種或多種藥物載體組合，製成多種藥物劑型。這些藥物劑型涵蓋:注射溶液、片劑、霜劑、膠囊、軟膏、洗劑、舌含片等劑型局部或全身給藥。
4.權利要求1、2或3記載的多肽 或藥物製劑用於組織炎症的治療。
全文摘要
一種用於治療組織炎症的多肽，公布了多肽的序列，結構以及製備方法。作為一種醫藥組合物，具有良好的組織，器官保護作用，可用於抗炎製劑。
文檔編號C07K7/06GK103087151SQ201110280490
公開日2013年5月8日 申請日期2011年11月1日 優先權日2011年11月1日
發明者不公告發明人 申請人:趙婷