水稻細胞色素p450基因專用引物輔助鑑別植物培養基質中除草劑的殘留的製作方法
2023-06-13 22:42:31 1
專利名稱：水稻細胞色素p450基因專用引物輔助鑑別植物培養基質中除草劑的殘留的製作方法
技術領域：
本發明涉及水稻細胞色素P450基因專用引物輔助鑑別植物培養基質中除草劑的殘留。
背景技術：
利用生物技術發展生態農藥是現代農業研究的一個重要方向，可以緩解農民負擔、減少生態環境汙染和降低因大量農藥殘留造成的人類健康危害。細胞色素P450酶系是結合在內質網膜上含硫醇血紅素的氧化酶。細胞色素P450超基因家族存在很強的生物多樣性，廣泛參與動植物的各類生命活動，比如生物分子合成、解毒和藥物代謝途徑。利用功能基因組學和生物信息學手段，研究整合生物代謝途徑中的細胞色素P450家族的功能信息，研究預測與降解農藥殘留相關的水稻P450基因，將有利於生產我國自主性的生態農藥。以信號受體和轉錄途徑組分分析為基礎可進行農用化合物設計，結合化學信息學方法，可鑑定用於殺蟲劑和除草劑的潛在化學成分。
發明內容
本發明的目的是提供水稻細胞色素P450基因專用引物輔助鑑別植物培養基質中除草劑的殘留。
本發明所提供的輔助鑑別植物培養基質中除草劑殘留的引物，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成的一對引物。該引物對是根據水稻細胞色素P450基因序列設計的，細胞色素P450基因命名為CYP81A6 ，其NCBI定位號為NP—001051342， NCBI基因號(GENE ID)為0s03g0760200， DBJ號為AK104825， TIGR號為L0C—0s03g55240，全長cDNA序列長度為2199個核苷酸，定位於第三號染色體從31，379,697bp到31， 384， 722bp，該基因編碼的蛋白共有732胺基酸。CYP81A6基因的表達受除草劑的誘導，所述除草劑為二氯喹啉酸、苯達松、甲磺隆、異惡草酮或甲基紫精。
本發明的另一個目的是提供一種輔助鑑別植物培養基質中除草劑殘留的方法。本發明所提供的輔助鑑別植物培養基質中除草劑殘留的方法，是將在不含除草劑的植物培養基質中培養的水稻移栽到待測的植物培養基質中，以所述水稻的總RNA反轉錄獲得的cDNA為模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列為引物，進行實時螢光定量PCR擴增，通過擴增曲線計算待測的植物培養基質的水稻的總RNA中特異性擴增產物的初始拷貝數與不含除草劑的植物培養基質的水稻的總RNA中特異性擴增產物的初始拷貝數的比值，所述比值大於2.0土0.05，待測植物培養基質為有除草劑殘留的候選植物培養基質。
所述的植物培養基質可為任何可培養植物的液體或固體基質，如培養液、土壤、蛭石等。
當所述待測的植物培養基質為液體時，可將在不含除草劑的植物培養基質中培養的水稻移栽到待檢測的植物培養基質中6小時-24小時；當所述待測的植物培養基質為固體時，可將待測的植物培養基質用5ml/100ml 二甲亞碸水溶液浸泡，收集浸出液；將在不含除草劑的植物培養基質中培養的水稻移栽到待測的植物培養基質中6小時-24小時。進行所述移栽的水稻可處於二葉期-四葉期。所述除草劑為二氯喹啉酸、苯達松、甲磺隆、異惡草酮或甲基紫精。
通過本發明提供的輔助鑑定植物培養基質中除草劑殘留的方法，可初步鑑定植物培養基質中是否有除草劑殘留，再結合現有的儀器分析方法可確定植物培養基質中是否有除草劑殘留。
為了方便、快速輔助鑑定植物培養基質中除草劑殘留，本發明還提供了一種專用的螢光定量PCR試劑盒，該螢光定量PCR試劑盒包含一對引物，該引物對由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成。
本發明根據一個對多種除草劑具有明顯應答特徵的水稻細胞色素P450基因的基因序列設計了一對引物，用該引物對可輔助檢測植物培養基質中是否有除草劑殘留。利用本發明的輔助鑑定植物培養基質中除草劑殘留的方法可對植物培養基質進行初步篩査，將篩出的候選植物培養基質再用現有的儀器分析方法進行確定有無除草劑殘留，可大大降低儀器分析的工作強度，使對植物培養基質中除草劑殘留的檢測快速簡便。
圖1為水稻細胞色素P450基因，CYP81A6，在水稻基因組序列上的位置示意圖及基因結構。
圖2為CYP81A6基因在二氯喹啉酸的處理條件下表達變化。圖3為CYP81A6基因在多種除草劑的處理條件下表達變化。
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。下述實施例中的水稻品種來自國家種質資源庫。實施例1、 CYP81A6在基因組序列的定位及引物設計
通過Blast分析，將已命名的水稻細胞色素P450基因和TIGR水稻資料庫中的基因位點對應起來，CYP81A6對應L0C—0s03g55240，位於第三號染色體第31, 379， 697bp到31，384，722bp，具有五個外顯子和四個內含子，該基因的結構如圖l所示。根據CYP81A6的mRNA序列，用primer3工具，在CYP81A6的mRNA序列靠近3'端設計一對特異引物ChemR3-1和ChemR3-2，引物ChemR3-1和ChemR3-2的序列分別為序列表中的序列1和序列2。
實施例2、用引物ChemR3-1和ChemR3-2檢測CYP81A6在除草劑處理下的表達以5ml/100ml 二甲亞碸水溶液為溶劑分別配製濃度為1. 65mM 二氯喹啉酸溶液、濃度為19.98mM苯達松溶液、濃度為1.31raM甲磺隆溶液、濃度為1.75mM異惡草酮溶液和濃度為10yM甲基紫精溶液。
在正常生長條件下(溫度為28。C / 25°C ，相對溼度83%， 12小時晝夜循環)生長的水稻日本晴的幼苗，在兩葉一心期分別用1.65mM二氯喹啉酸溶液、19.98mM苯達松溶液、1. 31mM甲磺隆溶液、1.75mM異惡草酮溶液和10uM甲基紫精溶液噴霧處理，以用5ml/100ml二甲亞碸水溶液噴霧處理作為對照，實驗重複3次，每個重複處理10-20株水稻。
提取1. 65mM 二氯喹啉酸溶液處理3小時、6小時和24小時及二甲亞碸處理3小時、6小時和24小時的水稻日本晴幼苗的總RNA，反轉錄成cDNA;以反轉錄cDNA為模板，ChemR3-1和ChemR3-2為引物通過實時螢光定量PCR技術檢測CYP81A6的表達水平。
取上述5種除草劑處理6小時的水稻日本晴幼苗和對照幼苗分別提取總RNA，反轉錄成cDNA;以反轉錄cDNA為模板，ChemR3-1和ChemR3-2為引物通過實時螢光定量PCR技術檢測CYP81A6的表達水平。
螢光定量PCR反應條件如下
以18S rRNA作為內標，按下列條件進行實時螢光定量PCR反應，反應體系IO w L:10 XPCR Buffer 1 u L， 25mmol/L Mg2+ 1 y L， 10 mmol/L dNTPs 0. 5 u L， 25 u mol/L上下遊引物各O. 25 uL， cDNA模板l u L， Taq酶(Promega) 0.25 n L， 20XSYBR GreenI 0. 5 u L， ddH20 6. 25 u L。
檢測CYP81A6的表達水平實時螢光定量PCR的反應條件95匸變性3 mi n，循環40次9 5 °C變性4 0 s — 6 1 °C退火2 5 s — 7 2 。C延伸l mi n 20 s，融解95。C 0 s(20°C/s)—71°C 15 s(20°C/s—95°C0 s(0.rC/s),冷卻40。C 30 s(20°C/s)。所有螢光定量PCR反應均在LightCycler (Roche)上進行。
實時螢光定量PCR結果表明，1. 65rnM 二氯喹啉酸處理3小時開始CYP81A6的表達水平就已經高於對照，此時1. 65mM 二氯喹啉酸處理組與對照組的CYP81A6的拷貝數
5比值為8. 32; 1. 65mM 二氯喹啉酸處理24小時，CYP81A6的表達水平仍高於對照，此時1. 65mM 二氯喹啉酸處理組與對照組的CYP81A6的拷貝數比值為29. 31。(圖2)
圖2中"1"代表用二甲亞碸處理3小時，"2"代表二氯喹啉酸處理3小時，"3"代表用二甲亞碸處理6小時，"4"代表二氯喹啉酸處理6小時，"5"代表用二甲亞碸處理24小時，"6"代表二氯喹啉酸處理24小時。
雖然不同除草劑的處理CYP81A6的應答不同，但經6小時的二氯喹啉酸、苯達松、甲磺隆、異惡草酮和甲基紫精處理後，CYP81A6的表達水平均明顯高於對照組，此時，二氯喹啉酸處理組與對照組的CYP81A6的拷貝數比值為8. 90;苯達松處理組與對照組的CYP81A6的拷貝數比值為5. 23;甲磺隆處理組與對照組的CYP81A6的拷貝數比值為2.61;異惡草酮處理組與對照組的CYP81A6的拷貝數比值為12.33;甲基紫精處理組與對照組的CYP81A6的拷貝數比值為12.04。其中，異惡草酮和甲基紫精的誘導作用最強，二氯喹啉酸次之，苯達松和甲磺隆較弱(圖3)。
圖3中"1"代表用二氯喹啉酸處理6小時，"2"代表用苯達松處理6小時，"3"代表用甲磺隆處理6小時，"4"代表用異惡草酮處理6小時，"5"代表用甲基紫精處理6小時。序列表
〈110〉 中國農業大學
<120〉水稻細胞色素P450基因專用引物輔助鑑別植物培養基質中除草劑的殘留。
2
<210〉 1
<211〉 21
DNA 〈213>人工序列
<220〉 <223〉
〈400〉 1
gctagcaatc gctctttgag a 21
2 <211〉 22 DNA <213〉人工序列
〈220〉 <223〉
2
gaaattgaaa tacctggcgt gt 22
權利要求
1、一種輔助鑑別植物培養基質中除草劑殘留的引物，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成的一對引物。
2、 根據權利要求l所述的引物，其特徵在於所述除草劑為二氯喹啉酸、苯達 松、甲磺隆、異惡草酮或甲基紫精。
3、 一種輔助鑑別植物培養基質中除草劑殘留的方法，是將在不含除草劑的植物 培養基質中培養的水稻移栽到待測的植物培養基質中，以所述水稻的總RNA反轉錄獲 得的cDNA為模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列為引物， 進行實時螢光定量PCR擴增，通過擴增曲線計算待測的植物培養基質中的水稻的總RNA 中特異性擴增產物的初始拷貝數與不含除草劑的植物培養基質中的水稻的總RNA中特 異性擴增產物的初始拷貝數的比值，所述比值大於2.0士0.05，待測植物培養基質為 有除草劑殘留的候選植物培養基質。
4、 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述待測的植物培養基質為液體， 將在不含除草劑的植物培養基質中培養的水稻移栽到所述待檢測的植物培養基質中6 小時-24小時。
5、 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述待測的植物培養基質為固體 時，將所述待測的植物培養基質用5ml/100ml 二甲亞碸水溶液浸泡，收集浸出液； 將在不含除草劑的植物培養基質中培養的水稻移栽到待測的植物培養基質中6小時 -24小時。
6、 根據權利要求3或4或5所述的方法，其特徵在於所述移栽的水稻處於二 葉期-四葉期。
7、 根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述除草劑為二氯喹啉酸、苯達 松、甲磺隆、異惡草酮或甲基紫精。
8、 一種輔助鑑別植物培養基質中除草劑殘留的螢光定量PCR試劑盒，該試劑盒 包括一對引物，其特徵在於所述引物對是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2 的核苷酸序列組成。
9、 根據權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於所述除草劑為二氯喹啉酸、苯達松、甲磺隆、異惡草酮或甲基紫精。
10、 權利要求1所述的引物在鑑定水稻生長中有無噴施除草劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了水稻細胞色素P450基因專用引物輔助鑑別植物培養基質中除草劑的殘留。該引物是由序列表中序列1和序列2組成的。本發明公開的方法，是將在不含除草劑的植物培養基質中培養的水稻移栽到待測的植物培養基質中，以所述水稻的總RNA反轉錄獲得的cDNA為模板，用上述引物進行實時螢光定量PCR擴增，通過擴增曲線計算待檢測的植物培養基質中的水稻的總RNA中特異性擴增產物的初始拷貝數與不含除草劑的植物培養基質中的水稻的總RNA中特異性擴增產物的初始拷貝數的比值，所述比值大於2.0±0.05，待測植物培養基質為有除草劑殘留的候選植物培養基質。本發明的方法使對植物培養基質中除草劑殘留的檢測快速簡便。
文檔編號C12Q1/68GK101643779SQ20081011802
公開日2010年2月10日 申請日期2008年8月6日 優先權日2008年8月6日
發明者周少霞, 張蓋華, 徐文英, 震 蘇, 超 邸 申請人:中國農業大學