一種搖瓶培養基及提高葡萄糖氧化桿菌催化能力的方法
2023-06-14 03:39:36
專利名稱：一種搖瓶培養基及提高葡萄糖氧化桿菌催化能力的方法
技術領域：
本發明屬於微生物工程領域，具體涉及一種搖瓶培養基及提高葡萄糖氧化桿菌 催化能力的方法。
背景技術：
米格列醇(migliton)是拜耳公司在1997年度上市的新型抗糖尿病藥物。它是 從桿菌肉湯培養基中發現的一種新型腸道a-葡萄糖苷酶抑制劑，是1-脫氧野尻黴 素的母體修飾產物，屬於N-取代-1-脫氧野尻黴素類型，結構與葡萄糖相似。儘管 用化學合成的方法能夠製備米格列醇，但化學全合成法製備米格列醇的步驟較多， 米格列醇分子中含有的四個手性中心也給化學合成帶來了很大的困難。目前生產規 模大多採用生物合成來製備米格列醇。米格列醇的生物合成法據文獻報導大致有二 條路線:一是先由野尻黴素或1-脫氧野尻黴素產生菌進行發酵，製備獲得野尻黴素 或1-脫氧野尻黴素，然後再經過化學合成方法獲得米格列醇，這是最原始的途徑; 二是應用氧化葡糖酸菌轉化製備米格列醇關鍵中間體N-取代-1-脫氧野尻黴素，其 主要通過化學合成-生物轉化-化學合成的方法來製備，該工藝路線圖如下
葡萄糖
(I) (II) (III)
上述(I )為1-羥乙胺基-1-脫氧-D-山梨醇，(II)為呋喃型葡萄糖胺，(III) 為米格列醇。
US4266025, EP0477160, USP2001/0019837公布了另外的米格列醇的生產方法， 即化學合成結合生物催化的方法。但由於菌體活力不高，導致生物催化時間過長， 造成生產成本高，生產周期長，給工業化生產帶來很大的障礙。
由於微生物酶的高效專一性，省略了化學合成過程中為達到專一地改造某個目的基團必須進行的加入和脫除保護基團的步驟，大大簡化了製備過程，提高了反應 收率。氧化葡糖酸桿菌用於轉化特定底物製備1-脫氧野尻黴素及其衍生物具有很多 優點l)轉化液經離心除去菌體，無需分離純化出中間體，就可進行下一步合成。 2)無需基團保護，成本大大降低，且避免因去除保護劑而造成的回收率下降。3)中 間體6-(取代胺基)-6-脫氧-a-L-山梨呋喃糖具有較高的溶解度和穩定性，不易被 降解。但對於轉化機理的報導還沒有，可以肯定的是，葡萄糖氧化桿菌中含有參與 該轉化反應的生物酶或酶系，葡萄糖氧化桿菌的催化能力與其含有的生物酶系的數 量和活力有直接關係。
目前，米格列醇雖然已經實現工業化生產。但由於菌種活力低，使利用微生物 將1-羥乙胺基-1-脫氧-D-山梨醇轉化為呋喃型葡萄糖胺時轉化效率低，轉化時間 長，勞動強度大，生產成本高。傳統菌種選育主要採用誘變育種的方法，誘變的方 法歷史悠久，過去一直依賴誘變的方法來提高產量，目前大多數生物發酵工業生產 仍然在使用這些方法。但是這種方法具有相當大的隨機性，而且菌種若長期使用誘 變劑處理，其生活能力會逐漸下降。
目前，還沒有文獻報導通過改進培養基的方式來提高葡萄糖氧化桿菌催化能力 的相關報導。
發明內容
本發明另闢蹊徑，通過優化發酵條件的方式，提出了一種可以增強葡萄糖氧化 桿菌脫氫酶系活力的搖瓶培養基，以及一種提高葡萄糖氧化桿菌催化能力的方法。
本發明人在試驗過程中意外地發現，在已有的搖瓶培養基中加入1-羥乙胺基 -l-脫氧-D-山梨醇，可以提高葡萄糖氧化桿菌脫氫酶系活力，這種偶然發現是我們 意想不到的。為了進一步優化培養基的成分配比，發明人經過大量試驗摸索研究發 現，當l-羥乙胺基-l-脫氧-D-山梨醇的濃度在0.05 0.9g/L時，底物的轉化率得 到了很大提高；優選地，l-羥乙胺基-l-脫氧-D-山梨醇的濃度在0.2 0.7g/L時， 底物的轉化率更高；進一步優選地，當1-羥乙胺基-l-脫氧-D-山梨醇的濃度為 0.4g/L時，底物的轉化率最高。
本發明的搖瓶培養基，其成分含有1-羥乙胺基-l-脫氧-D-山梨醇，除此之外， 還可以含有以下所有成分葡萄糖、山梨醇、酵母膏、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀。同時，發明人對上述組分的配比做了篩選，發現當上述組分的濃度為葡萄糖5g/L， 山梨醇70g/L，酵母膏30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷酸氫二鉀3g/L時，底物轉化率 得到了很大的提高。
無論對本發明的搖瓶培養基做出任何改進，其ra值均控制在7. 0。
另外，本發明的第二個目的是提供一種提高葡萄糖氧化桿菌催化能力的方法。 為了達到這個目的，發明人對發酵工藝作了一定的優化。具體地，所述的提高葡萄 糖氧化桿菌催化能力的方法，包括斜面培養、搖瓶培養及生物轉化過程。
其中，斜面培養採用常規的工藝；搖瓶培養時，培養葡萄糖氧化桿菌的培養基 為上述含有l-羥乙胺基-l-脫氧-D-山梨醇的搖瓶培養基，pH為7. 0，其它步驟採用 常規工藝，1-羥乙胺基-1-脫氧-D-山梨醇的濃度控制在0.05 0.9g/L範圍內，優 選地，1-羥乙胺基-l-脫氧-D-山梨醇的濃度控制在0.2 0.7g/L範圍內，進一步優 選地，1-羥乙胺基-l-脫氧-D-山梨醇的濃度控制在0.4g/L;生物轉化過程中菌體與 l-羥乙胺基-l-脫氧-D-山梨醇的重量比為1: 1，其它採用常規工藝。
本發明提供的技術方案，縮短了米格列醇生產過程的生物催化時間和提高轉化 水平。克服目前現有技術中菌體催化能力差，催化時間長的缺點。由具體實施方式
可以看出，實施例1的搖瓶培養基中沒有添加1一羥乙胺基一1一脫氧一D—山梨醇， 在其它工藝不變的情況下，底物的轉化率只有5 0%;在實施例2 _ 7的搖瓶培養 基中均添加了不同濃度的l一羥乙胺基一1一脫氧一D—山梨醇，在其它工藝不變的 情況下，底物的轉化率均有所提高，達到5 5%以上，最高達到了8 0%。
具體實施方式
實施例1
斜面培養按如下比例配製培養基葡萄糖5g/L，山梨醇50g/L，酵母膏30g/L， 瓊脂20g/L， pH為7.0。配製培養基300毫升，加熱，瓊脂融化後攪拌均勻裝入10 支大試管中，滅菌，做成斜面備用。將冷凍保藏的葡萄糖氧化桿菌菌種用無菌水5 毫升溶解，用接種鏟均勻塗布在10支斜面上，放入生化培養箱中，在溫度2『C， 溼度40_60%條件下，培養72小時。加無菌水製成懸浮液。
搖瓶種子液製備按如下比例配製培養基葡萄糖5g/L，山梨醇70g/L，酵母膏30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷酸氫二鉀3g/L， pH為7. 0。配製培養基500毫升， 裝500mL三角瓶10瓶(每瓶裝液量50mL)，滅菌，備用。將菌種懸浮液2mL接種到 搖瓶中，放入恆溫振蕩培養箱中，在250rpm，溫度28。C，溼度40 — 60%條件下， 培養30小時。
生物轉化將上述培養得到的培養液離心，收集菌體5.0g。稱取5.0gl—羥 乙胺基一1一脫氧一D—山梨醇，以62毫升純化水溶解並調節pH6.0。在搖瓶中，投 入菌體和配製好的底物溶液，放入振蕩恆溫培養箱中，在溫度為20°C， 250rpm的 條件下，催化15小時，採用TLC檢測方法檢測，轉化率約50%。
實施例2
斜面培養按如下比例配製培養基葡萄糖5g/L，山梨醇50g/L，酵母膏30g/L, 瓊脂20g/L， pH為7.0。配製培養基300毫升，加熱瓊脂融化後攪拌均勻裝入10支 大試管中，滅菌，做成斜面備用。將冷凍保藏的葡萄糖氧化桿菌菌種用無菌水5毫 升溶解，用接種鏟均勻塗布在10支斜面上，放入生化培養箱中，在溫度28'C,溼 度40_60%條件下，培養72小時。加無菌水製成懸浮液。
搖瓶種子液製備按如下比例配製培養基1一羥乙胺基一1一脫氧一D—山梨 醇0.05g/L，葡萄糖5g/L，山梨醇70g/L，酵母膏30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷酸 氫二鉀3g/L， pH為7. 0。配製培養基500毫升，裝500mL三角瓶10瓶(每瓶裝液 量50mL)，滅菌，備用。將菌種懸浮液2mL接種到搖瓶中。放入恆溫振蕩培養箱中， 在250rpm，溫度28。C，溼度40 — 60%條件下，培養30小時。
生物轉化將上述培養得到的培養液離心，收集菌體5. 1 g。稱取5. lg l —羥 乙胺基一1一脫氧一D—山梨醇，以64毫升純化水溶解並調節p恥.0。在搖瓶中，投 入菌體和配製好的底物溶液，放入振蕩恆溫培養箱中，在溫度為2(TC， 250rpm的 條件下，催化15小時，採用TLC檢測方法檢測，轉化率約62%。
實施例3
斜面培養按如下比例配製培養基:'葡萄糖5g/L，山梨醇50g/L,酵母膏30g/L， 瓊脂20g/L， PH為7. 0。配製培養基300毫升，加熱瓊脂融化後攪拌均勻裝入10支 大試管中，滅菌，做成斜面備用。將冷凍保藏的葡萄糖氧化桿菌菌種用無菌水5毫升溶解，用接種鏟均勻塗布在10支斜面上，放入生化培養箱中，在溫度28i:，溼 度40—60%條件下，培養72小時。加無菌水製成懸浮液。
搖瓶種子液製備按如下比例配製培養基1一羥乙胺基一1一脫氧一D—山梨
醇0. 2g/L，葡萄糖5g/L，山梨醇70g/L，酵母膏30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷酸氫 二鉀3g/L， pH為7. 0。配製培養基500毫升，裝500mL三角瓶10瓶(每瓶裝液量 50mL)，滅菌，備用。將菌種懸浮液2mL接種到搖瓶中。放入恆溫振蕩培養箱中， 在250rpm，溫度28。C，溼度40 — 60%條件下，培養30小時。
生物轉化將上述培養得到的培養液離心，收集菌體5.0g。稱取5.0g 1_羥 乙胺基一1一脫氧一D—山梨醇，以62毫升純化水溶解並調節p服.0。在搖瓶中，投 入菌體和配製好的底物溶液，放入振蕩恆溫培養箱中，在溫度為2CTC， 250rpm的 條件下，催化15小時，採用TLC檢測方法檢測，轉化率約72%。
實施例4
斜面培養按如下比例配製培養基葡萄糖5g/L，山梨醇50g/L，酵母膏30g/L， 瓊脂20g/L， pH為7.0。配製培養基300毫升，加熱瓊脂融化後攪拌均勻裝入10支 大試管中，滅菌，做成斜面備用。將冷凍保藏的葡萄糖氧化桿菌菌種用無菌水5毫 升溶解，用接種鏟均勻塗布在10支斜面上，放入生化培養箱中，在溫度28。C，溼 度40_60%條件下，培養72小時。加無菌水製成懸浮液。
搖瓶種子液製備按如下比例配製培養基1一羥乙胺基一1一脫氧一D—山梨 醇0.4g/L,葡萄糖5g/L，山梨醇70g/L，酵母膏30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷酸氫 二鉀3g/L， pH為7.0。配製培養基500毫升，裝500mL三角瓶10瓶(每瓶裝液量 50mL)，滅菌，備用。將菌種懸浮液2mL接種到搖瓶中。放入恆溫振蕩培養箱中， 在250rpm，溫度28。C，溼度40—60%條件下，培養30小時。
生物轉化將上述培養得到的培養液離心，收集菌體5.3 g。稱取5.3g l—羥 乙胺基一1一脫氧一D—山梨醇，以66亳升純化水溶解並調節pH至6.0。在搖瓶中， 投入菌體和配製好的底物溶^，放入振蕩恆溫培養箱中，在溫度為20°C， 250rpm 的條件下，催化15小時，採用TLC檢測方法檢測，轉化率約80%。
實施例5斜面培養按如下比例配製培養基葡萄糖5g/L，山梨醇50g/L，酵母膏30g/L， 瓊脂20g/L， pH為7. 0。配製培養基300毫升，加熱瓊脂融化後攪拌均勻裝入10支 大試管中，滅菌，做成斜面備用。將冷凍保藏的葡萄糖氧化桿菌菌種用無菌水5毫 升溶解，用接種鏟均勻塗布在IO支斜面上，放入生化培養箱中，在溫度28。C，溼 度40 — 60%條件下，培養72小時。加無菌水製成懸浮液。
搖瓶種子液製備按如下比例配製培養基1一羥乙胺基一1一脫氧一D—山梨 醇0.7g/L，葡萄糖5g/L，山梨醇70g/L，酵母膏30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷酸氫 二鉀3g/L， pH為7. 0。配製培養基500毫升，裝500mL三角瓶10瓶(每瓶裝液量 50mL)，滅菌，備用。將菌種懸浮液2mL接種到搖瓶中，放入恆溫振蕩培養箱中， 在250rpra，溫度28。C，溼度40_60%條件下，培養30小時。
生物轉化將上述培養得到的培養液離心，收集菌體5.1 g。稱取5.1g 1-羥 乙胺基一1一脫氧一D—山梨醇，以64毫升純化水溶解並調節pH6.0。在搖瓶中，投 入菌體和配製好的底物溶液，放入振蕩恆溫培養箱中，在溫度為20°C， 250rpm的 條件下，催化15小時，採用TLC檢測方法檢測，轉化率約69%。
實施例6
斜面培養按如下比例配製培養基葡萄糖5g/L，山梨醇50g/L，酵母膏30g/L， 瓊脂20g/L， pH為7. 0。配製培養基300毫升，加熱瓊脂融化後攪拌均勻裝入10支 大試管中，滅菌，做成斜面備用。將冷凍保藏的葡萄糖氧化桿菌菌種用無菌水5毫 升溶解，用接種鏟均勻塗布在10支斜面上，放入生化培養箱中，在溫度28'C，溼 度40 — 60%條件下，培養72小時。加無菌水製成懸浮液。
搖瓶種子液製備按如下比例配製培養基1一羥乙胺基一1一脫氧一D—山梨 醇0.9g/L，葡萄糖5g/L，山梨醇70g/L，酵母膏30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷酸氫 二鉀3g/L, pH為7. 0。配製培養基500毫升，裝500mL三角瓶10瓶(每瓶裝液量 50mL)，滅菌，備用。將菌種懸浮液2mL接種到搖瓶中，放入恆溫振蕩培養箱中， 在250rpm，溫度28。C，溼度40—60%條件下，培養30小時。
生物轉化將上述培養得到的培養液離心，收集菌體5. 1 g。稱取5. lg l—羥 乙胺基一1一脫氧一D—山梨醇，以64毫升純化水溶解並調節pH6.0。在搖瓶中，投 入菌體和配製好的底物溶液，放入振蕩恆溫培養箱中，在溫度為20°C， 250rpm的條件下，催化15小時，釆用TLC檢測方法檢測，轉化率約65%。 實施例7
斜面培養按如下比例配製培養基葡萄糖5g/L，山梨醇50g/L，酵母膏30g/L， 瓊脂20g/L， pH為7.0。配製培養基300毫升，加熱瓊脂融化後攪拌均勻裝入10支 大試管中，滅菌，做成斜面備用。將冷凍保藏的葡萄糖氧化桿菌菌種用無菌水5毫 升溶解，用接種鏟均勻塗布在10支斜面上，放入生化培養箱中，在溫度28'C，溼 度40—60%條件下，培養72小時。加無菌水製成懸浮液。
搖瓶種子液製備按如下比例配製培養基1一羥乙胺基一1一脫氧一D—山梨 醇lg/L，葡萄糖5g/L，山梨醇70g/L，酵母膏30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷酸氫二 鉀3g/L， pH為7. 0。配製培養基200毫升，裝500mL三角瓶10瓶(每瓶裝液量 50mL)，滅菌，備用。將菌種懸浮液2mL接種到搖瓶中。放入恆溫振蕩培養箱中， 在250rpm，溫度28。C，溼度40—60%條件下，培養30小時。
生物轉化將上述培養得到的培養液離心，收集菌體5.0g。稱取5.0gl—羥 乙胺基一1一脫氧一D—山梨醇，以62毫升純化水溶解並調節pH至6.0。在搖瓶中， 投入菌體和配製好的底物溶液，放入振.蕩恆溫培養箱中，在溫度為2(TC， 250rpm 的條件下，催化15小時，採用TLC檢測方法檢測，轉化率約55%。
通過具體實施的試驗驗證，確定了搖瓶培養基1一羥乙胺基一1一脫氧一D— 山梨醇0.4g/L，葡萄糖5g/L，山梨醇70g/L，酵母膏30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷 酸氫二鉀3g/L。使用該培養基培養的菌體的催化效率明顯高於不添加l一羥乙胺基 一1一脫氧一D—山梨醇的培養基。
權利要求
1. 一種搖瓶培養基，可以提高葡萄糖氧化桿菌脫氫酶系活力，其特徵在於，含有1-羥乙胺基-1-脫氧-D-山梨醇。
2. 如權利要求1所述的搖瓶培養基，其特徵在於，含有l-羥乙胺基-1-脫氧-D-山梨 醇0. 05 0. 9g/L。
3. 如權利要求2所述的搖瓶培養基，其特徵在於，含有1-羥乙胺基-1-脫氧-D-山梨 醇0. 2 0. 7g/L。
4. 如權利要求3所述的搖瓶培養基，其特徵在於，含有l-羥乙胺基-l-脫氧-D-山梨 醇0.4g/L。
5. 如權利要求1-4任一所述的搖瓶培養基，其特徵在於，含有以下所有成分葡萄糖、 山梨醇、酵母膏、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀。
6. 如權利要求5所述的搖瓶培養基，其特徵在於，含有葡萄糖5g/L，山梨醇70g/L， 酵母膏30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷酸氫二鉀3g/L。
7. 如權利要求l-4任一所述的搖瓶培養基，其特徵在於，其pH值為7.0。
8. —種提高葡萄糖氧化桿菌催化能力的方法，包括斜面培養、搖瓶培養及生物轉化， 其特徵在於，搖瓶培養葡萄糖氧化桿菌的培養基為權利要求l-4任一所述的搖瓶培 養基。
9. 如權利要求8所述的方法，其特徵在於，搖瓶培養葡萄糖氧化桿菌的培養基為權利 要求6所述的搖瓶培養基。
10. 如權利要求8所述的方法，其特徵在於，生物轉化過程中菌體與1-羥乙胺基-l-脫 氧-D-山梨醇的重量比為1:1。
全文摘要
本發明屬於微生物工程領域，具體涉及一種搖瓶培養基及提高葡萄糖氧化桿菌催化能力的方法。通過在已有的搖瓶培養基中加入1-羥乙胺基-1-脫氧-D-山梨醇，並控制其濃度在0.05～0.9g/L時，底物的轉化率得到了很大提高。本發明縮短了米格列醇生產過程的生物催化時間和提高轉化水平。克服目前現有技術中菌體催化能力差，催化時間長的缺點。
文檔編號C12P17/12GK101440387SQ20081018704
公開日2009年5月27日 申請日期2008年12月14日 優先權日2008年12月14日
發明者趙志全 申請人:魯南製藥集團股份有限公司