一種大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛的方法
2023-06-14 03:16:56
一種大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛的方法
【專利摘要】本發明涉及一種大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛的方法，選用常規鐵皮石斛組培過程中產生的特定原球莖，將其在無菌條件下轉入含秋水仙素的培養基中進行四倍體誘變處理，然後轉入原球莖誘導分化培養基中培養出再生植株，按常規方式進行栽培管理，對再生植株的根尖染色體進行檢測，篩選出純合四倍體植株，並對純合四倍體植株進行性狀篩選，切取性狀優良的四倍體植株的莖段轉接入原球莖誘導培養基中，續代後將原球莖進行誘導分化出再生純合四倍體無毒植株。本發明培育方法簡便易行，不受季節氣候影響，縮短了常規育種的時間，一次性即可獲得數萬株優質同源純合四倍體石斛種苗，可大大提高鐵皮石斛的產量和品質。
【專利說明】—種大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種鐵皮石斛新品種培育方法，尤其是一種大量繁育同源四倍體鐵皮石斛的方法，屬於生物技術育種領域。
【背景技術】
[0002]鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是傳統名貴珍稀中藥材,具有益胃生津、滋陰清熱、增強免疫力、消除腫瘤、抑制癌症等獨特的功效。1000多年前的《道藏》將鐵皮石斛列為「中華九大仙草之首」，其在民間也素有「救命仙草」之稱，國際藥用植物界將之譽為「藥界大熊貓」。雖其功效獨特但目前野生資源已瀕臨枯竭，加之人工種植投入高，且現有二倍體石斛種質難以保證、生長緩慢，成活率低下，造成人工種植鐵皮石斛的產量低，品質參次不齊，農戶種植積極性低下，國內市場供需矛盾日益突出，而現代多倍體育種技術為繁育出高產、抗逆性強，藥用成份高的優質鐵皮石斛提供了可能，通過多倍體育種技術可大大提升鐵皮石斛的種植積極性，促進我國石斛產業的發展。
[0003]經對現有技術文獻檢索發現鐵皮石斛四倍體研究鮮有報導，僅發現專利200710061225.8報導了鐵皮石斛四倍體的培育方法，雖此法誘變率較高但存在一定的缺陷:a、以石斛種子為出發點，受季節氣候影響有一定的局限性。b、育種周期長，從授粉、播種、誘變、種植、培育、育種到產業化應用需五年以上的時間。C、四倍體植株中嵌合四倍體的頻率較高，種質難以保證d、一次僅可獲得百株四倍體植株，僅適用於實驗室研究階段，難以滿足實際產業化生產需求，需進一步改進。
【發明內容】
[0004]針對傳統方法的不 足，本發明提供了一種大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛的方法，本方法簡單有效易行，縮短了傳統四倍體育種時間，大大提高傳統四倍體育種的純合性
和培育產量。
[0005]為實現以上目的，本發明提供了如下技術方案:一種大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛的方法，其特徵在於包括以下步驟:選用石斛組培續代1~4代過程中產生的黃綠色且沒有莖尖分化的原球莖，用秋水仙素進行四倍體誘變，處理後轉入原球莖分化培養基中培養出再生植株，按常規方式進行栽培管理，對再生植株的根尖染色體進行檢測，篩選出純合四倍體植株，切取具有優良性狀的純合四倍體植株的莖段，轉接入原球莖誘導培養基中，續代三次後將原球莖進行誘導分化出再生四倍體植株。
[0006]優選，所述的四倍體誘變處理為，在含0.0r0.06wt%秋水仙鹼的1/3~1/2MS (MS基本培養基的中大量元素濃度減為1/3~1/2)液體培養基中誘變處理6(T72h，優選是含
0.05wt%秋水仙鹼的1/3~1/2MS液體培養基。
[0007]優選，所述的原球莖分化培養基為:萘乙酸(NAA) 0.5^1.5mg/L+花寶I號
0.4~1.0g/L+蔗糖2-4wt%+香蕉10~15wt%的1/3~1/2MS固體培養基。
[0008]作為改進，所述的切取具有優良性狀的純合四倍體植株莖段，其切方法為從相連的兩個莖節節點處斜切莖段，將帶有兩個斜切口的莖段水平接種於原球莖誘導培養基，每個母瓶中接種一個莖段。
[0009]優選，所述的原球莖誘導培養基的組成為1/31/2MS+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA) 0.2~0.5mg/L+NAA0.3~0.6mg/L+ 活性炭 0.5~1.5g/L
[0010]與現有技術相比，本發明的優點在於:採用石斛組培過程中產生的原球莖為材料進行四倍體誘變，不受季節氣候的影響，對根尖染色體鏡檢後用流式細胞儀篩選出純合四倍體植株，將性狀優良的四倍體植株的莖段轉接愈傷組織誘導培養基中，經續代、分化一次性即可獲得數萬株優質純合同源四倍體鐵皮石斛種苗，本方法簡單有效易行，縮短了傳統四倍體育種時間，大大提高傳統四倍體育種的純合性,可以大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛，提高了鐵皮石斛的品質和產量。 【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1是黃綠色原球莖照片；
[0012]圖2是四倍體植株照片；
[0013]圖3是二倍體2n=38染色體的照片；
[0014]圖4是四倍體染色體2n=76的照片；
【具體實施方式】
[0015]以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0016]一種大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛的方法，包括以下步驟:
[0017]I)選取原球莖:選取在石斛組培續代1~4代過程中產生的原球莖，要求選取黃綠色且沒有原球莖尖分化的原球莖。
[0018]2)四倍體誘變處理:無菌條件下將選取的原球莖轉入含有0.05%秋水仙鹼的1/3~1/2MS液體培養基中進行誘變處理60~72h。
[0019]3)原球莖的分化誘導:將誘變處理過的原球莖用無菌水衝洗3飛次，轉接於含ΝΑΑ0.5~L 5mg/L+花寶I號0.5~0.8g/L+蔗糖2~4wt%+香蕉10~15wt%的1/3~1/2MS固體培養基中，在光照強度1500LUX，光照時間12h/d，溫度23~27°C的條件下培養，中間續代一次，待植株長至3飛cm移栽進行正常管理栽培。
[0020]4)四倍體的鑑定與篩選:對再生植株進行編號標記後，對標記植株根尖的染色體進行鏡檢，染色體鏡檢結果為2n=76的植株是誘變成功的四倍體植株，進而用流式細胞儀從中篩選出純合四倍體株系。
[0021]5)四倍體植株原球莖的誘導:在無菌條件下切取性狀優良的純合四倍體植株的莖段，切取莖段要求從相連的兩個莖節節點處斜切莖段，將帶有兩個斜切口的莖段水平接種於原球莖誘導培養基中(1/3~1/2MS+6-BA0.2~0.5mg/L+NAA0.3~0.5mg/L+活性炭
0.5~1.5g/L。)，每個母瓶中接種一個莖段。
[0022]6)原球莖的分化誘導:誘導出的原球莖基於步驟3所述的分化培養基中進行誘導分化，半年後可一次性獲得數萬株優質四倍體鐵皮石斛無毒種苗。
[0023]實施例:
[0024]選取選取在石斛組培續代第I代過程中產生的黃綠色且沒有莖尖分化的原球莖，無菌條件下將選取的原球莖轉入含有0.05%秋水仙鹼的1/3~1/2MS液體培養基中進行誘變處理60h。在超淨工作檯上將誘變處理過的原球莖用無菌水衝洗3次，轉接於含NAA1.0mg/L+花寶I號0.6g/L+蔗糖3wt%+香蕉12wt%的1/3~1/2MS固體培養基中，在光照強度1500Lux，光照時間12h/d，溫度24±1°C的條件下培養，30d後續代一次，待植株長至3cm後煉苗7天，編號後移栽入種植基地進行正常管理栽培。
[0025]半年後選取長勢好、莖粗大的植株的根尖進行鏡檢，染色體鏡檢結果為2n=76的植株是誘變成功的四倍體植株，用流式細胞儀從四倍體植株中篩選出純合四倍體株系。
[0026]a、在無菌條件下切取編號為L-99的純合四倍體植株的莖段(切取莖段時從相連的兩個莖節節點處斜切，下同)，將切取的4段莖段接種於含6-BA0.2mg/L+NAA0.3mg/L+活性炭0.5g/L的1/3~1/2MS固體培養基中，在光照強度1500Lux，光照時間12h/d，溫度24± 1°C的條件下培養35d後誘導出原球莖，將原球莖續代2次後轉入原球莖分化培養基，7個月後一次性獲得2.8萬株優質四倍體鐵皮石斛無毒種苗。
[0027]b、在無菌條件下切取編號為L-121的純合四倍體植株的莖段，將切取的5段莖段接種於含6-BA0.4mg/L+NAA0.4m g/L+活性炭1.0g/L的1/3~1/2MS固體培養基中，在光照強度1500LUX，光照時間12h/d，溫度25±1°C的條件下培養35d後誘導出原球莖，將原球莖續代3次後轉入原球莖分化培養基，7個月後一次性獲得9.5萬株優質四倍體鐵皮石斛無毒種苗。
[0028]C、在無菌條件下切取編號為L-326的純合四倍體植株的莖段，將切取的5段莖段接種於含6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭1.5g/L的1/3~1/2MS固體培養基中，在光照強度1500LUX，光照時間12h/d，溫度25±2°C的條件下培養30d後誘導出原球莖，將原球莖續代4次後轉入分化培養基7個月後一次性獲得30萬株優質四倍體鐵皮石斛無毒種苗。
[0029]花寶I號是美國花寶公司，作用是促進蘭科植物生根壯苗，在市場可以購買獲得，http://baike.baidu.com/view/1194364.htm。
【權利要求】
1.一種大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛的方法，其特徵在於包括以下步驟:選用石斛組培續代1~4代過程中產生的黃綠色且沒有莖尖分化的原球莖，用秋水仙素進行四倍體誘變，處理後轉入原球莖分化培養基中培養出再生植株，按常規方式進行栽培管理，對再生植株的根尖染色體進行檢測，篩選出純合四倍體植株，切取具有優良性狀的純合四倍體植株的莖段，轉接入原球莖誘導培養基中，續代三次後將原球莖進行誘導分化出再生四倍體植株。
2.根據權利要求1所述的一種大量繁育同源四倍體鐵皮石斛的方法，其特徵在於所述的四倍體誘變處理為，在含0.04、.06 (wt) %秋水仙鹼的1/3~1/2MS液體培養基中誘變處理.60~72h。
3.根據權利要求1所述的一種大量繁育同源四倍體鐵皮石斛的方法，其特徵在於所述的原球莖分化培養基為:NAA0.5^1.5mg/L+花寶I號0.5^0.8g/L+蔗糖2-4 (wt) %+香蕉.10~15(wt)%的1/3~1/2MS固體培養基。
4.根據權利要求1所述的一種大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛的方法，其特徵在於所述的切取具有優良性狀的純合四倍體植株莖段，其切方法為從相連的兩個莖節節點處斜切莖段，將帶有兩個斜切口的莖段水平接種於原球莖誘導培養基，每個母瓶中接種一個莖段。
5.根據權利要求1所述的一種大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛的方法，其特徵在於原球莖誘導培養基的組成為1/3~1/2MS+6-BA0.2~0.5mg/L+NAA0.3~0.6mg/L+活性炭.0.5~1.5g/L。
【文檔編號】A01H4/00GK103535274SQ201210244240
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年7月13日 優先權日:2012年7月13日
【發明者】李振達, 何心展, 馬春光, 付文飛 申請人:寧波洛祥藥業有限公司