雷丸菌液體深層發酵生產雷丸菌絲的工藝的製作方法

2023-06-18 06:33:41 2

專利名稱：雷丸菌液體深層發酵生產雷丸菌絲的工藝的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物工程技術領域，涉及一種雷丸菌(Laccocephalum mylittae，formerly called Polyporus mylittae)液體深層發酵生產雷丸菌絲的工藝。
背景技術：
雷丸分布於我國浙江、安徽、福建、河南、河北、江蘇、廣西、雲南、貴州、湖南、四川、甘肅、陝西等地，其菌核生長於發黃且開花的老竹根上或老竹兜下面，有時生於棕櫚、桐樹上或某些朽樹上。殺蟲消積除熱的功效。大量研究表明，雷丸是一具有多重作用的藥用真菌。雷丸蛋白酶有多種驅蟲作用，對絛蟲、蛔蟲、陰道毛滴蟲、蟯蟲、鉤蟲等多種寄生蟲病均有顯著療效；雷丸多糖可調節機體免疫功能，有的還有一定抗癌性；雷丸凝集素具凝血活性。
由於野生資源的匱乏和生長環境的惡化，許多名貴藥用真菌瀕臨滅絕，如何挽救這些寶貴的藥用資源、滿足藥物開發需要顯得尤為重要，利用微生物技術分離篩選出活性菌株，採用現代發酵技術進行大規模的藥材生產很有必要。加上雷丸生長於竹根下，採集十分困難，故發酵培養雷丸菌藥物有廣泛的應用前景，其工業化生產不受季節限制，並可縮短生產周期，產品的數量及質量也易於保證和控制。
上個世紀中後期發展起來的現代發酵技術已成功應用於多種藥用真菌的大規模生產，其中以液體發酵技術最為成熟。本發明是適合於雷丸菌工業化生產的發酵培養工藝，該發明將液體發酵技術應用到雷丸菌菌絲的大規模生產在國內尚屬首例，研究結果表明該方案是可行的。

發明內容
本發明的目的是提供一種雷丸菌液體深層發酵生產雷丸菌絲的工藝。
工藝的步驟如下1)固體斜面培養將雷丸菌(Laccocephalum mylittae，formerly called Polyporus mylittae)接種到配製的斜面培養基上，溫度20～30℃，培養160～240小時，得到高活性的固體斜面雷丸菌種；2)搖床種子培養將上述高活性的固體斜面雷丸菌種接種於裝有液體種子培養基的搖瓶中，在20～30℃培養，轉速150～200rpm，培養62～96小時，得到雷丸菌液體種子；3)雷丸菌液體深層通氣發酵培養將上述雷丸菌液體種子接種至裝有發酵培養基的發酵罐中，以體積比計接種量為5～15％，罐溫20～30℃、罐壓0.4～1.0kg/cm，攪拌速率100～250rpm，通氣量1∶0.3～1∶1.2，發酵時間100～200小時，得到雷丸菌絲。
所述的斜面培養基以每1000毫升計，馬鈴薯100～300克、葡萄糖或蔗糖10～30克、KH2PO42～5克、MgSO4·7H2O 1～3克、維生素B1微量和瓊脂15～25克。具體製備方法為取新鮮去皮馬鈴薯100～300克，切成0.5立方釐米左右的立方塊，立即用水衝洗，用1000毫升蒸餾水煮沸20min，紗布過濾，取濾液加15～25克瓊脂、10～30克葡萄糖或蔗糖、KH2PO42～5克、MgSO4·7H2O 1～3克、維生素B1微量加熱溶解，加水定容至1000毫升，滅菌後即為斜面培養基。
種子培養基以每1000毫升計，葡萄糖10～60克、蔗糖10～60克、玉米漿40～200毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO41～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、維生素B10.01～0.05克，pH4.0～7.0。具體製備方法為取葡萄糖10～60克、蔗糖10～60克、玉米漿40～200毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO41～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、維生素B10.01～0.05克，將各組分混合溶解，加水定容至1000毫升，調pH至4.0～7.0，滅菌後即為種子培養基。
發酵培養基以每1000毫升計，葡萄糖20～80克、蔗糖20～80克、玉米漿50～100毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO41～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、維生素B10.01～0.05克，培養基的pH值為4.0～7.0。具體製備方法為取葡萄糖20～80克、蔗糖20～80克、玉米漿50～100毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO4～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、維生素B10.01～0.05克，將上述成分混合加水至1000毫升，另外加0.6毫升泡敵做消泡劑，調pH到4.0～7.0，滅菌後即為發酵培養基。
本發明的有益效果(1)本發明中種子培養基提供了菌絲短期內快速生長所需的營養物質，培養72小時左右即可進行深層發酵；(2)本發明中液體深層通氣發酵培養基，營養成分配比合理，能夠保證雷丸菌的生長需要，培養基材料豐富，整個分批發酵過程中只需一次配料、一次滅菌即可，具有省時、省工，又減少了由於中途加料造成染菌的機會；
(3)採用本發明中的液體深層通氣發酵工藝進行分批發酵，每升發酵液可得到10～15克的幹菌絲；(4)本發明是適合於雷丸菌大規模生產的發酵培養工藝，對於該菌以後的工業化生產有很大的指導意義。
具體實施例方式
雷丸菌(Laccocephalum mylittae，formerly called Polyporus mylittae)購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號為CGMCC No.AS 5.158，屬於擔子菌綱，多孔菌目，多孔菌科，多孔菌屬。
所述的生產雷丸菌絲的工藝是從野生雷丸菌核上分離純化得到的純菌株，依次經固體斜面培養、搖床種子培養和發酵培養完成。
菌株的18S核糖體DNA(18S rDNA)部分序列(NCBI登錄號AY944218)如下TTTTTCCTTGGCCGGAAGGTCTGGGTAATCTTGTGAAACTCTGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATACCTAGTAAGCGTGAGTCATCAGCTCGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTTGGGATTGGCTTCGGGGAGCCGGCAACGGCACCCTGTTGCTGAGAACTTGGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA。
本發明的放罐標準是發酵液變得粘稠，鏡檢發現菌絲開始老化。
下面結合具體實施例來進一步詳細描述本發明。
實施例11)固體斜面培養將雷丸菌接種到配製的斜面培養基上，溫度20℃，培養160小時，得到高活性的固體斜面雷丸菌種；所述的斜面培養基以每1000毫升計，馬鈴薯100克、葡萄糖10克、KH2PO42克、MgSO4·7H2O 1克、維生素B1微量和瓊脂15克。
2)搖床種子培養將上述高活性的固體斜面雷丸菌種接種於裝有液體種子培養基的搖瓶中，在20℃培養，轉速150rpm，培養62小時，得到雷丸菌液體種子；所述的種子培養基以每1000毫升計，葡萄糖10克、蔗糖10克、玉米漿40毫升、酵母粉10克、KH2PO41克、MgSO4·7H2O 0.2克、維生素B10.01克，pH4.0。
3)雷丸菌液體深層通氣發酵培養將上述雷丸菌液體種子接種至裝有發酵培養基的發酵罐中，以體積比計接種量為5％，罐溫20℃、罐壓0.4kg/cm，攪拌速率100rpm，通氣量1∶0.3，發酵時間100小時，得到雷丸菌絲。所述的發酵培養基，以每1000毫升計發酵培養基的主要成份為葡萄糖20克、蔗糖20克、玉米漿50毫升、酵母粉10克、KH2PO41克、MgSO4·7H2O 0.2克、維生素B10.01克，培養基的pH值為4.0。
實施例21)固體斜面培養將雷丸菌接種到配製的斜面培養基上，溫度30℃，培養240小時，得到高活性的固體斜面雷丸菌種；所述的斜面培養基以每1000毫升計，馬鈴薯300克、蔗糖30克、KH2PO45克、MgSO4·7H2O 3克、維生素B1微量和瓊脂25克。
2)搖床種子培養將上述高活性的固體斜面雷丸菌種接種於裝有液體種子培養基的搖瓶中，在30℃培養，轉速200rpm，培養96小時，得到雷丸菌液體種子；所述的種子培養基以每1000毫升計，葡萄糖60克、蔗糖60克、蛋白水解液240毫升、酵母膏60克、KH2PO43克、MgSO4·7H2O 1克、維生素B10.05克，pH7.0。
3)雷丸菌液體深層通氣發酵培養將上述雷丸菌液體種子接種至裝有發酵培養基的發酵罐中，以體積比計接種量為15％，罐溫30℃、罐壓1.0kg/cm，攪拌速率250rpm，通氣量1∶1.2，發酵時間200小時，得到雷丸菌絲。所述的發酵培養基以每1000毫升計，葡萄糖80克、蔗糖80克、蛋白水解液240毫升、酵母膏60克、KH2PO43克、MgSO4·7H2O1克、維生素B10.05克，培養基的pH值為7.0。
蛋白水解液的製備取新鮮原料黃豆粉、蝦粉、蠶蛹粉等，於600C烘箱中乾燥6個小時，然後放於800C烘箱中乾燥17個小時，稱取乾粉100克，加入生石灰6克，水640毫升，在0.15Mpa下加壓水解2個小時，過濾，取濾液即得。
實施例31)固體斜面培養將雷丸菌接種到配製的斜面培養基上，溫度27℃，培養200小時，得到高活性的固體斜面雷丸菌種；所述的斜面培養基以每1000毫升計，馬鈴薯200克、葡萄糖20克、KH2PO43克、MgSO4·7H2O 2克、維生素B1微量和瓊脂20克。
2)搖床種子培養將上述高活性的固體斜面雷丸菌種接種於裝有液體種子培養基的搖瓶中，在27℃培養，轉速180rpm，培養72小時，得到雷丸菌液體種子；所述的種子培養基以每1000毫升計，葡萄糖20克、蔗糖20克、玉米漿60毫升、酵母粉20克、KH2PO41.5克、MgSO4·7H2O 0.5克、維生素B10.02克，pH6.5。
3)雷丸菌液體深層通氣發酵培養將上述雷丸菌液體種子接種至裝有發酵培養基的發酵罐中，以體積比計接種量為14％，罐溫27℃、罐壓0.8kg/cm，攪拌速率200rpm，通氣量1∶1.0，發酵時間150小時，得到雷丸菌絲。所述的發酵培養基以每1000毫升計，葡萄糖40克、蔗糖40克、玉米漿60毫升、酵母粉20克、KH2PO42克、MgSO4·7H2O0.7克、維生素B10.02克，培養基的pH值為6.5。
實施例41)固體斜面培養將雷丸菌接種到配製的斜面培養基上，溫度26℃，培養220小時，得到高活性的固體斜面雷丸菌種；所述的斜面培養基以每1000毫升計，馬鈴薯250克、蔗糖25克、KH2PO44克、MgSO4·7H2O 2.5克、維生素B1微量和瓊脂22克。
2)搖床種子培養將上述高活性的固體斜面雷丸菌種接種於裝有液體種子培養基的搖瓶中，在26℃培養，轉速160rpm，培養80小時，得到雷丸菌液體種子；所述的種子培養基以每1000毫升計，葡萄糖30克、蔗糖30克、蛋白水解液100毫升、酵母膏30克、KH2PO42克、MgSO4·7H2O 0.5克、維生素B10.03克，pH6.0。
3)雷丸菌液體深層通氣發酵培養將上述雷丸菌液體種子接種至裝有發酵培養基的發酵罐中，以體積比計接種量為10％，罐溫26℃、罐壓0.6kg/cm，攪拌速率180rpm，通氣量1∶0.8，發酵時間160小時，得到雷丸菌絲。所述的發酵培養基以每1000毫升計，葡萄糖60克、蔗糖60克、蛋白水解液100毫升、酵母膏30克、KH2PO42.5克、MgSO4·7H2O0.8克、維生素B10.03克，培養基的pH值為6.0。
蛋白水解液的製備取新鮮原料黃豆粉、蝦粉、蠶蛹粉等，於600C烘箱中乾燥6個小時，然後放於800C烘箱中乾燥17個小時，稱取乾粉100克，加入6mol/l的鹽酸600毫升，在沸水浴中水解30分鐘，過濾後收集濾液。
實施例51)固體斜面培養將雷丸菌接種到配製的斜面培養基上，溫度28℃，培養180小時，得到高活性的固體斜面雷丸菌種；所述的斜面培養基以每1000毫升計，馬鈴薯150克、葡萄糖15克、KH2PO43.6克、MgSO4·7H2O 1.2克、維生素B1微量和瓊脂18克。
2)搖床種子培養將上述高活性的固體斜面雷丸菌種接種於裝有液體種子培養基的搖瓶中，在28℃培養，轉速170rpm，培養90小時，得到雷丸菌液體種子；所述的種子培養基以每1000毫升計，葡萄糖40克、蔗糖40克、玉米漿100毫升、酵母粉40克、KH2PO42.5克、MgSO4·7H2O 0.8克、維生素B10.04克，pH5.5。
3)雷丸菌液體深層通氣發酵培養將上述雷丸菌液體種子接種至裝有發酵培養基的發酵罐中，以體積比計接種量為12％，罐溫28℃、罐壓0.5kg/cm，攪拌速率220rpm，通氣量1∶0.6，發酵時間120小時，得到雷丸菌絲。所述的發酵培養基以每1000毫升計，葡萄糖50克、蔗糖50克、玉米漿90毫升、酵母粉、KH2PO42.2克、MgSO4·7H2O 0.6克、維生素B10.04克，培養基的pH值為5.5。
最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例。顯然，本發明不限於以上實施例，還可以有許多變形。
本發明可用其他的不違背本發明的精神和主要特徵的具體形式來概述。因此，無論從哪一點來看，本發明的上述實施方案都只能認為是對本發明的說明而不能限制本發明，權利要求書指出了本發明的範圍，而上述的說明並未指出本發明的範圍，因此，在與本發明的權利要求書相當的含義和範圍內的任何改變，都應認為是包括在權利要求書的範圍內。
權利要求
1.一種雷丸菌液體深層發酵生產雷丸菌絲的工藝，其特徵在於，工藝的步驟如下1)固體斜面培養將雷丸菌(Laccocephalum mylittae，formerly called Polyporus mylittae)接種到配製的斜面培養基上，溫度20～30℃，培養160～240小時，得到高活性的固體斜面雷丸菌種；2)搖床種子培養將上述高活性的固體斜面雷丸菌種接種於裝有液體種子培養基的搖瓶中，在20～30℃培養，轉速150～200rpm，培養62～96小時，得到雷丸菌液體種子；3)雷丸菌液體深層通氣發酵培養將上述雷丸菌液體種子接種至裝有發酵培養基的發酵罐中，以體積比計接種量為5～15％，罐溫20～30℃、罐壓0.4～1.0kg/cm，攪拌速率100～250rpm，通氣量1∶0.3～1∶1.2，發酵時間100～200小時，得到雷丸菌絲。
2.根據權利要求1所述的一種雷丸菌液體深層發酵生產雷丸菌絲的工藝，其特徵在於，所述的斜面培養基以每1000毫升計，馬鈴薯100～300克、葡萄糖或蔗糖10～30克、KH2PO42～5克、MgSO4·7H2O 1～3克、維生素B1微量和瓊脂15～25克。
3.根據權利要求1所述的一種雷丸菌液體深層發酵生產雷丸菌絲的工藝，其特徵在於，所述的種子培養基以每1000毫升計，葡萄糖10～60克、蔗糖10～60克、玉米漿40～200毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO41～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、維生素B10.01～0.05克，pH4.0～7.0。
4.根據權利要求1所述的一種雷丸菌液體深層發酵生產雷丸菌絲的工藝，其特徵在於，所述的發酵培養基以每1000毫升計，葡萄糖20～80克、蔗糖20～80克、玉米漿50～100毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO41～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、維生素B10.01～0.05克，培養基的pH值為4.0～7.0。
全文摘要
本發明公開了一種雷丸菌液體深層發酵生產雷丸菌絲的工藝，其特徵在於，工藝的步驟如下固體斜面培養將雷丸菌接種到配製的斜面培養基上培養，得到高活性的固體斜面雷丸菌種；搖床種子培養將上述高活性的固體斜面雷丸菌種接種於裝有液體種子培養基的搖瓶中培養，得到雷丸菌液體種子；雷丸菌液體深層通氣發酵培養將上述雷丸菌液體種子接種至裝有發酵培養基的發酵罐中發酵，得到雷丸菌絲。本發明的培養基營養成分配比合理，能夠保證雷丸菌的生長需要，整個分批發酵過程中只需一次配料、一次滅菌即可，省時、省工，又減少了由於中途加料造成染菌的機會；適合於雷丸菌大規模生產的發酵培養工藝，對於該菌以後的工業化生產有很大的指導意義。
文檔編號C12N1/14GK1869196SQ200610051608
公開日2006年11月29日 申請日期2006年5月24日 優先權日2006年5月24日
發明者李永泉, 周立華 申請人:浙江大學