化學發光增敏液及其製備方法

2023-06-17 14:25:31

化學發光增敏液及其製備方法
【專利摘要】本發明涉及化學發光免疫分析【技術領域】，具體而言，特別涉及一種化學發光增敏液及其製備方法。該化學發光增敏液，包括0.1-100mmol/L的4-咪唑苯酚、0.05-100mmol/L的過氧化氫、0.05-100mmol/L魯米諾或魯米諾衍生物、0.01-10mol/L的鹼、體積百分數為0.01％-20％有機溶劑、離子強度為0.01-10mol/L、pH值為7-11的緩衝液。通過實驗發現，該增敏液可以顯著的增強反應體系的發光強度、大大的延長其發光持續時間，其最大發光強度(化學發光值)可以達到7.5×107，發光持續時間可以達到25分鐘。
【專利說明】化學發光增敏液及其製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及化學發光免疫分析【技術領域】，具體而言，特別涉及一種化學發光增敏 液及其製備方法。

【背景技術】
[0002] 化學發光是在常溫下，由化學反應產生的光的發射。其發光機理是：反應體系中的 某些物質分子，如反應物、中間體或者螢光物質吸收了反應釋放的能量而由基態躍遷到激 發態，當中間體由激發態回到基態時會釋放等能級的光子，對光子進行測定而實現定量分 析。1977年，Halman等人通過將高特異性的抗原抗體反應與高靈敏度的化學發光反應結合 起來，創建了化學發光免疫分析方法（Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)。
[0003] 化學發光免疫分析方法是將化學發光與免疫反應相結合的產物，因化學發光具有 螢光的特異性，同時不需要激發光，從而避免了螢光分析中激發光雜散光的影響。魯米諾是 化學發光免疫分析中應用廣泛的標記物質，在鹼性溶液中，魯米諾可被許多氧化劑氧化發 光，其中H 202最為常用。在化學發光免疫分析的過程中，因發光反應速度較慢，因此，常需添 加某些酶類或無機催化劑。酶類主要是辣根過氧化物酶（HRP)，無機類包括0 3、齒素及Fe3+、 Cu2+、Co2+或它們的配合物。
[0004] 化學發光酶免疫分析（Chemiluminescent enzyme immunoassay，CLELA)是以酶標 記生物活性物質進行免疫反應，反應的過程中，酶作用於發光底物（如魯米諾），在信號試 劑作用下發光，再利用發光信號測定儀進行發光測定。目前常用的標記酶為辣根過氧化物 酶（HRP)和鹼性磷酸酶（ALP)，兩者有各自的發光底物。
[0005] 相關技術中，辣根過氧化物酶（HRP)最常用發光底物是魯米諾。在化學發光酶免 疫分析（CLEIA)中，使用辣根過氧化物酶標記抗體，進行免疫反應後，利用魯米諾作為發光 底物，在辣根過氧化物酶（HRP)和起動發光試劑（NaOH和H 202)作用下，發光底物（魯米諾） 發光。在反應的過程中，該化學發光反應體系（HRP-H 202-luminol)通常為幾秒內瞬時閃光， 存在發光強度低、持續時間短的缺陷。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的在於提供一種化學發光增敏液，以克服現有技術中的化學發光反應 體系（HRP-H 202_luminol)由於存在的發光強度低、持續時間短的技術問題。本發明的另一 個目的在於提供一種上述化學發光增敏液的製備方法。
[0007] 本發明實施例提供的這種化學發光增敏液，包括：0. l-100mm〇l/L的4-咪唑苯酚、 0. 05-100mmol/L的過氧化氫、0. 05-100mmol/L魯米諾或魯米諾衍生物、0. 01-10mol/L的 鹼、體積百分數為〇. 01% -20%有機溶劑、離子強度為0. 01-10m〇l/L、pH值為7-11的緩衝 液。
[0008] 本發明提供的這種化學增敏液，其由4-咪唑苯酚、過氧化氫，魯米諾或魯米諾衍 生物、鹼、有機溶劑及緩衝液組成。在化學發光酶免疫分析（CLEIA)中，將該增敏液加入到 含有辣根過氧化物酶（HRP)的化學發光體系中後，該增敏液以4-咪唑苯酚為增強劑，其優 先與辣根過氧化物酶作用形成自由基，並且作為電子轉移中間體提高了魯米諾或魯米諾衍 生物自由基的產率，進而實現增敏化學發光反應的效果，通過實驗發現，該增敏液可以顯著 的增強反應體系的發光強度、大大的延長其發光持續時間，其最大發光強度（化學發光值） 可以達到7. 5X 107,發光持續時間可以達到25分鐘。因此，可廣泛用於以化學發光為檢測 手段的化學、生物、免疫等檢測分析產品中，在檢測的過程中，由於發光增強效果顯著，其發 光持續時間長，從而便於重複測量，進而可提高檢測分析的靈敏度和準確性。
[0009] 可選的，所述化學發光增敏液包括：0. l_50mmol/L的4-咪唑苯酚、0. 05_50mmol/ L的過氧化氫、0. 05-50mmol/L魯米諾或魯米諾衍生物、0. 01-5mol/L的鹼、體積百分數為 0. 01% -10%有機溶劑、離子強度為0. 01-5mol/L的緩衝液。
[0010] 可選的，所述魯米諾衍生物為魯米諾鈉鹽、異魯米諾或7-氨基-6-巰基鄰苯二甲 醯肼。
[0011] 可選的，所述鹼為氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鈣。
[0012] 可選的，所述有機溶劑為二甲基甲醯胺、丙酮、甲醇或乙腈；和/或；所述緩衝液為 磷酸鹽緩衝液或Tris-HCl緩衝液。
[0013] 本發明提供的這種化學增敏液的製備方法，包括以下步驟：
[0014] (1)、在鹼溶液中加入魯米諾或魯米諾衍生物，得到既定濃度的魯米諾或魯米諾衍 生物的母液；
[0015] (2)、將4-咪唑苯酚加入到有機溶劑中，得到既定濃度的4-咪唑苯酚母液；
[0016] (3)、按照既定體積比將所述魯米諾或魯米諾衍生物的母液與所述4-咪唑苯酚母 液混合後，在其中依次加入緩衝液和過氧化氫溶液，混勻，得到化學發光增敏液。
[0017] 可選的，在步驟⑴中，具體包括：稱取lllmg魯米諾，加入到0· Imol/LNaOH水溶 液中，並定容至lOOmL，獲得濃度為6. 25mmol/L的魯米諾母液。
[0018] 可選的，在步驟⑵中，具體包括：稱取160mg4-咪唑苯酚，加入到2 % DMF水溶液 中，並定容至100mL，獲得濃度為10mm〇l/L的4-咪唑苯酚母液。
[0019] 可選的，在所述步驟（3)中，所述魯米諾母液和所述4-咪唑苯酚母液的體積比為 1:1。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 為了更清楚地說明本發明【具體實施方式】或現有技術中的技術方案，下面將對具體 實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的 附圖是本發明的一些實施方式，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前 提下，還可以根據這些附圖獲得其它的附圖。
[0021] 圖1為本實施例五提供的化學發光增敏液的製備方法；
[0022] 圖2為本發明實施例提供的化學發光增敏液加入到含有辣根過氧化物酶的免疫 反應體系中後，體系的發光值和發光時間關係圖。
[0023] 圖3為本發明實施例的增敏液中，不同的增強劑在不同辣根過氧化物酶濃度下的 化學發光值穩定的時間圖。

【具體實施方式】
[0024] 為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明的技術方案進行 清楚、完整的描述，基於本發明中的【具體實施方式】，本領域普通技術人員在沒有做出創造性 勞動的前提下所得到的所有其它實施方式，都屬於本發明所保護的範圍。
[0025] 本發明提供的這種化學發光增敏液，其中包括0. l-100mmol/L的4-咪唑苯酚、 0. 05-100mmol/L的過氧化氫、0. 05-100mmol/L魯米諾或魯米諾衍生物、0. 01-10mol/L的 鹼、體積百分數為0.01% -20%有機溶劑、離子強度為0.01-10m〇l/L、pH值為7-11的緩 衝液。另外，為了實現更好的增強效果，優選的，在增敏液中，各組份的含量範圍可適當鎖 銷，如：其可包括〇. l_50mmol/L的4-咪唑苯酌·、0. 05_50mmol/L的過氧化氫、0. 05_50mmol/ 1^魯米諾或魯米諾衍生物、0.01-5111〇1/1的鹼、體積百分數為0.01 (%-10(%有機溶劑、離子 強度為〇. 〇l-5mol/L的緩衝液；另外，優選的，對於各組份，所述魯米諾衍生物為魯米諾鈉 鹽、異魯米諾或7-氨基-6-巰基鄰苯二甲醯肼；所述鹼為氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鈣； 所述有機溶劑為二甲基甲醯胺、丙酮、甲醇或乙腈；和/或所述緩衝液為磷酸鹽緩衝液或 Tris-HCl緩衝液。具體在製備的過程中，本發明的增敏液可以同時具備上述條件，或者只滿 足上述限定條件中的一項或多項。
[0026] 接下來，通過結合上述的內容，本發明對基於以4-咪唑苯酚作為增強劑的化學發 光增敏液提供了以下具體的實施例，請參考以下內容：
[0027] 實施例一
[0028] 本實施例提供的這種化學發光增敏液，其包括：0. lmmol/L的4-咪唑苯酚、 0. 05mmol/L的過氧化氫、0. 05mmol/L魯米諾、0. 01mol/L的氫氧化鈉、體積百分數為0. 01% 二甲基甲醯胺、離子強度為〇. 01m〇l/L、pH值為7-11的磷酸鹽緩衝液。
[0029] 實施例二
[0030] 本實施例提供的這種化學發光增敏液，其包括：10mmol/L的4-咪唑苯酚、lOmmol/ L的過氧化氫、8mmol/L的7-氨基-6-巰基鄰苯二甲醯肼、5mol/L的氫氧化鉀、體積百分數 為10%二甲基甲醯胺、離子強度為5mol/L、pH值為7-11的Tris-HCl緩衝液。
[0031] 實施例三
[0032] 本實施例提供的這種化學發光增敏液，其包括：50mmol/L的4-咪唑苯酚、50_〇1/ L的過氧化氫、50mmol/L的異魯米諾或魯米諾鈉鹽、5mol/L的氫氧化鈣、體積百分數為10% 丙酮、甲醇或乙腈、離子強度為5mol/L、pH值為7-11的Tris-HCl緩衝液。
[0033] 實施例四
[0034] 本實施例提供的這種化學發光增敏液，其包括：100mm〇l/L的4-咪唑苯酚、 1001111]1〇1/1的過氧化氫、1001111]1〇1/1的魯米諾、101]1〇1/1的氫氧化鈉、體積百分數為20 (%丙 酮、甲醇或乙腈、離子強度為10m〇l/L、pH值為7-11的Tris-HCl緩衝液。
[0035] 為了使得本發明上述實施例的化學發光增敏液得到更好的應用，更加有效應用到 化學發光免疫分析的領域中，本發明還在上述實施例的基礎之上提供了實施例五，實施例 五給出了上述實施例的化學發光增敏液的製備方法，現做詳細的闡述和解釋。
[0036] 實施例五
[0037] 本發明實施例提供的化學發光增敏液的製備方法具體包括以下步驟，請參考圖 1 :
[0038] 步驟101 :在鹼溶液中加入魯米諾或魯米諾衍生物，得到既定濃度的魯米諾或魯 米諾衍生物的母液；
[0039] 具體的，在該步驟中，稱取lllmg魯米諾，加入到0. Imol/LNaOH水溶液中，並定容 至100mL，獲得濃度為6. 25mmol/L的魯米諾母液，備用。
[0040] 步驟102 :將4-咪唑苯酚加入到有機溶劑中，得到既定濃度的4-咪唑苯酚母液；
[0041] 具體的，稱取160mg4-咪唑苯酚，加入到2% DMF水溶液中，並定容至100mL，獲得 濃度為10mm〇l/L的4-咪唑苯酚母液，備用。
[0042] 步驟103 :按照既定體積比將所述魯米諾或魯米諾衍生物的母液與所述4-咪唑苯 酚母液混合後，在其中依次加入緩衝液和過氧化氫溶液，混勻，得到化學發光增敏液。
[0043] 在該步驟中，所述魯米諾或魯米諾衍生物的母液與所述4-咪唑苯酚母液的 體積比為1:1。在操作的過程中，分別吸取2mL魯米諾母液和2mL4-咪唑苯酚母液，用 16mL0. 05M，pH值為9的Tris-HCl緩衝液稀釋，並加入10μ L30%的過氧化氫溶液，混勻即 得。
[0044] 其中，緩衝液的配置方法包括：用1Μ鹽酸溶液調整pH值至9.0,後用去離子水定 容至1000mL，獲得濃度為0. 05mol/L、pH值為7. 2的Tris-HCl緩衝液，在具體使用的時候 根據特定的需求調至既定的pH和離子濃度。
[0045] 另外，具體的，在本實施例中，整個配置過程可以按照以下操作進行：稱取lllmg 魯米諾，用〇. Imol/LNaOH水溶液定容至100mL，獲得濃度為6. 25mmol/L的魯米諾母液；稱 取160mg4-咪唑苯酚，用2% DMF水溶液定容至100mL，獲得濃度為10mmol/L的4-咪唑苯 酚母液；稱取三羥甲基氨基甲烷6. 05g，先用900mL去離子水溶解後，用1M鹽酸溶液調整pH 值至9. 0,後用去離子水定容至1000mL，獲得濃度為0. 05mol/L、pH值為7. 2的Tris-HCl 緩衝液；分別吸取2mL魯米諾母液和2mL4-咪唑苯酚母液，用16mL0. 05M，pH值為9. 0的 Tris-HCl緩衝液稀釋，並加入10 μ L30%的過氧化氫溶液，混勻後得到化學發光增敏液。
[0046] 請參考圖2,通過上述方法製成的化學發光增敏液，其將其加入含有辣根過氧化物 酶的免疫反應體系中，可出現化學發光反應，通過化學發光檢測儀檢測發光值與發光時間。
[0047] 檢測結果如圖2所示，從圖2可知，基於增強劑4-咪唑苯酚的化學發光增敏液有 效增強了魯米諾-辣根過氧化物酶-過氧化氫化學發光體系的發光強度（最大發光強度可 以達到7. 5Χ107)，延長了其發光持續時間（可以達到25分鐘）；其具有明顯的發光增強效 果和提高發光時間以及其發光穩定性的效果。
[0048] 另外，本發明還基於對增敏液中的增強劑進行替換，通過考察了在不同濃度的辣 根過氧化物酶（HRP)的條件下，測定其在20分鐘內的發光動力。具體結果請參考表1 : [0049] 表1辣根過氧化物酶濃度和不同增強劑對發光的影響 [0050]

【權利要求】
1. 化學發光增敏液，其特徵在於，所述化學發光增敏液包括： 0. l-100mmol/L 的 4_ 咪唑苯酌·、0. 05-1 OOmmol/T,的過氧化氧、0. 05-1 OOmmol/T,魯米 諾或魯米諾衍生物、〇. 01-10m〇l/L的鹼、體積百分數為0. 01% -20%有機溶劑、離子強度為 0.01-10mol/L、pH 值為 7-11 的緩衝液。
2. 根據權利要求1所述的化學發光增敏液，其特徵在於，所述化學發光增敏液包括： 0. l-50mmol/L 的 4-咪唑苯酌·、0. 05-50mmol/L 的過氧化氧、0. 05-50mmol/L 魯米諾 或魯米諾衍生物、0.01-5111〇1/1的鹼、體積百分數為0.01(%-10(%有機溶劑、離子強度為 0· 01-5mol/L的緩衝液。
3. 根據權利要求1所述的化學發光增敏液，其特徵在於：所述魯米諾衍生物為魯米諾 鈉鹽、異魯米諾或7-氨基-6-巰基鄰苯二甲醯肼。
4. 根據權利要求3所述的化學發光增敏液，其特徵在於，所述鹼為氫氧化鈉、氫氧化鉀 或氫氧化鈣。
5. 根據權利要求1所述的化學發光增敏液，其特徵在於，所述有機溶劑為二甲基甲醯 胺、丙酮、甲醇或乙腈； 和/或； 所述緩衝液為磷酸鹽緩衝液或Tris-HCl緩衝液。
6. -種根據權利要求1所述的化學發光增敏液的製備方法，其特徵在於，包括以下步 驟： (1) 、在鹼溶液中加入魯米諾或魯米諾衍生物，得到既定濃度的魯米諾或魯米諾衍生物 的母液； (2) 、將4-咪唑苯酚加入到有機溶劑中，得到既定濃度的4-咪唑苯酚母液； (3) 、按照既定體積比將所述魯米諾或魯米諾衍生物的母液與所述4-咪唑苯酚母液混 合後，在其中依次加入緩衝液和過氧化氫溶液，混勻，得到化學發光增敏液。
7. 根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，在步驟⑴中，具體包括： 稱取lllmg魯米諾，加入到0. Imol/LNaOH水溶液中，並定容至100mL，獲得濃度為 6. 25mmol/L的魯米諾母液。
8. 根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，在步驟⑵中，具體包括： 稱取160mg4-咪唑苯酚，加入到2% DMF水溶液中，並定容至100mL，獲得濃度為 10mmol/L的4-咪唑苯酌·母液。
9. 根據權利要求8所述的製備方法，其特徵在於，在所述步驟（3)中，所述魯米諾母液 和所述4-咪唑苯酚母液的體積比為1: 1。
【文檔編號】G01N33/532GK104049080SQ201410302775
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月27日 優先權日:2014年6月27日
【發明者】金茂俊, 王靜, 楊麗華, 杜鵬飛, 金芬, 邵華, 佘永新, 王珊珊 申請人:中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所