一種自噬抑制劑與拉帕替尼組合物及其用途

2023-06-18 09:54:11

一種自噬抑制劑與拉帕替尼組合物及其用途
【專利摘要】本發明屬醫藥【技術領域】，涉及一種自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物及其用途；該藥物組合物包含細胞自噬抑制劑和拉帕替尼；其中，所述的細胞自噬抑制劑選自3-MA、渥曼青黴素、LY294002、放線菌酮、巴法洛黴素A1、NH4Cl、氯喹和羥基氯喹中的一種或多種。所述藥物組合物，可通過抑制拉帕替尼誘導的腫瘤細胞的自噬、抵消腫瘤由於細胞自噬而引起的對拉帕替尼治療的拮抗作用，顯著增強拉帕替尼對腫瘤的治療效果。本發明的藥物組合物可增強拉帕替尼對腫瘤的殺傷作用，增強拉帕替尼的療效，可用於治療惡性腫瘤。
【專利說明】一種自噬抑制劑與拉帕替尼組合物及其用途

【技術領域】
[0001]本發明屬醫藥【技術領域】，涉及新的治療腫瘤的藥物組合物；具體涉及一種自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物及其用途；該藥物組合物用於治療腫瘤。

【背景技術】
[0002]近年來，隨著腫瘤分子靶向治療的快速發展，分子靶向治療藥物層出不窮；通常分子靶向治療藥物按照藥物分子大小可分為大分子單克隆抗體(單抗)和小分子化合物兩類；其中，單克隆抗體通過識別受體的胞外可辨區，與生長因子競爭結合受體，抑制信號傳導系統的激活，從而抑制癌細胞的增殖和擴散；但其經常會使患者產生耐藥性，由FDA批准的人源性單克隆抗體赫賽汀Trastuzumab (Herceptin)和紫杉醇類藥物的合用已經成為治療乳腺癌的金標準。所述赫賽汀同時也可與其他藥物合用來增加藥效，降低癌症的復發；雖然赫賽汀有很好的治療效果，但臨床實踐顯示，有患者在連續一年用藥後會產生耐藥性[Baselga J, Swain SM.Novel anticancer targets: revisiting ERBB2 anddiscovering ERBB3.Nat Rev Cancer 2009; 9: 463-475.]。有研究指出，由於小分子化合物不會引起免疫反應，且可對其結構進行直接修飾或結構改造，其可直接透過細胞膜而直接作用於表皮生長因子受體的胞內激酶而直接對其所控制的細胞信號通路進行抑制；所述小分子靶向化合物可分為分裂激酶功能域受體酪氨酸激酶亞群抑制劑、表皮生長因子受體酪氨酸激酶家族抑制劑、多靶點激酶抑制劑以及雙靶向酪氨酸激酶抑制劑。
[0003]現有技術公開了拉帕替尼(lapatinib, Tykerb)屬喹唑啉胺類化合物,是口服的小分子EGFR (ErbB-1)/HER-2 (ErbB-2)雙受體酪氨酸激酶抑制劑，其化學名:二對苯基磺酸拉帕替尼單水合物(lapatinib ditosyla temonohydrate)。拉帕替尼於2007年5月由美國FDA批准與卡培他濱聯合治療HER2過度表達的乳腺癌，同時也能聯合葸環類、紫杉醇、曲妥珠單抗(Trastuzumab)等藥物來治療晚期或轉移性乳腺癌患者。拉帕替尼同時還能被用於治療對曲妥珠單抗產生耐藥性的HER2陽性陽性細胞，如SKBR3細胞並誘導其發生細胞凋亡。除了乳腺癌，研究還發現，拉帕替尼同樣對HER2過表達的胃癌也有治療效果[Rusnak Dff, Lackey K, Affleck K, et al.The effects of the novel, reversibleepidermal growth factor receptor/ErbB-2 tyrosine kinase inhibitor, GW2016, onthe growth of human normal and tumor-derived cell lines in vitro and in viv0.Mol Cancer Ther.2001; 1: 85-94.]。拉帕替尼通過抑制細胞內的EGFR和HER2的ATP位點阻止腫瘤細胞磷酸化和激活，阻斷EGFR和HER2受體的下遊信號通路，主要包括了 PI3K/AKT, Ras/MEKK/JNK, Ras/Raf-1/MAPK以及Ras/Rac/Rho通路。上述通路的抑制直接導致月中瘤生長收到抑制，同時促進腫瘤細胞的凋亡[Gilmer TM, Cable L, Alligood K, et al.1mpact of common epidermal growth factor receptor and HER2 variants on receptoractivity and inhibit1n by lapatinib.Cancer Res.2008; 68: 571-579.]。
[0004]然而，在臨床治療中，除要考慮藥物的治療效果外，更重要的還需考慮藥物的安全性。有患者在服用了拉帕替尼後會產生一定的耐受性，臨床結果同時也顯示拉帕替尼引起常見的皮疹、噁心、嘔吐、疲勞和腹瀉等副作用；當患者對拉帕替尼的藥效產生耐藥後，力口大用藥量將進一步加劇其產生的毒副作用，有研究發現拉帕替尼所引起的副作用與拉帕替尼的服用劑量呈線性相關[Burris HA, 3rd, Hurwitz HI, Dees EC, et al.Phase Isafety, pharmacokinetics, and clinical activity study of lapatinib (GW572016),a reversible dual inhibitor of epidermal growth factor receptor tyrosinekinases, in heavily pretreated patients with metastatic carcinomas.J ClinOncol.2005; 23: 5305-5313.]。
[0005]細胞自卩遼(autophagy)又稱II 型程序性死亡(type II programmed cell death),是真核生物體內常見的「自我消化」(cellular degradat1n)的現象；其能分解細胞內受損或多餘的細胞器和蛋白產生核苷酸，胺基酸等小分子物質供細胞合成新的蛋白質，並能維持細胞內微環境的穩定。近年來，隨著分子生物學及基因技術的發展和對細胞自噬的深入認識，發現其與多種疾病，尤其是腫瘤的發展關係密切。根據細胞內底物運送到溶酶體腔內方式的不同，哺乳動物細胞自卩遼可分為三種方式:大自卩遼(macroautophagy)、小自曬(microautophagy)和分子伴侶介導的自卩遼(chaperone-mediated autophagy, CMA)；所述的大自曬(以下簡稱自曬)與腫瘤發展及治療關係最為密切[Sridhar S，BotbolY, Macian F，et al.Autophagy and disease: always two sides to a problem.JPathol.2012;226(2):255-73.]。自噬是胞漿大分子物質和細胞器在雙層膜包囊泡中大量降解的生物學過程，該過程大致能分為4個階段:(I)在飢餓、缺氧、藥物幹擾等某些因素的刺激下，自噬泡的雙層膜結構開始逐漸形成並包圍在被降解物的周圍；(2)自噬泡完全成型並將要被降解的物質完全隔離於細胞質；(3)自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體；(4)自噬溶酶體最終被溶酶體中的水解酶溶解，降解產物可在細胞內再循環利用° [Martinez-Borra J, Lopez-Larrea C.Autophagy and self-defense.AdvExp Med B1l.2012; 738:169-84.] 0自噬能使細胞對外部環境改變及各種刺激產生應激反應。細胞在生長條件下能發生較低水平的自噬，稱基礎自噬；然而，一旦受到外界的刺激，如飢餓、缺氧、高溫、高細胞密度或是生長因子剝奪等，細胞自噬的水平將會迅速上調；如在營養物質缺乏的情況下，細胞自噬能分解體內壞死細胞器產生胺基酸等供細胞合成新的蛋白質，維持細胞的存活[①Piacentini M, D』Eletto M, Falasca L, et al.Transglutaminase 2 at the crossroads between cell death and survival.AdvEnzymol Relat Areas Mol B1l.2011;78:197-246 ;② Cook KL, Shajahan AN, ClarkeR.Autophagy and endocrine resistance in breast cancer.Expert Rev AnticancerTher.2011; 11 (8): 1283-94.Wirawan E, Vanden Berghe T, Lippens S, et al.Autophagy: for better or for worse.Cell Res.2012;22 (I):43-61.]。
[0006]研究發現，自噬能降解摺疊錯誤的蛋白質、損傷的細胞器等，延緩機體衰老的發生。所述集體衰老相關疾病一神經退行性疾病可被歸類為蛋白構象錯誤疾病，通常是由於大量摺疊錯誤的蛋白質在細胞內堆積從而引發細胞毒性而造成的。研究表明，大量衰老性疾病，如神經退行性疾病和惡性腫瘤都與細胞自噬密切相關[①Martinez-Borra J, Lopez-Larrea C.Autophagy and self-defense.Adv Exp Med B1l.2012; 738:169-84.-』② Caballero B, Coto-Montes A.An insight into the role ofautophagy in cell responses in the aging and neurodegenerative brain.HistolHistopathol.2012;27 (3):263-75.!③ Mendelsohn AR, Larrick Jff.Rapamycin asan antiaging therapeutic: targeting mammalian target of rapamycin to treatHutchinson-Gilford progeria and neurodegenerative diseases.Rejuvenat1n Res.2011; 14(4):437-41.]。
[0007]細胞自噬在生物體的發育和分化過程中起了重要作用。據報導，自噬基因缺失或者突變的線蟲生長發育缺陷、衰老加速並縮短壽命；且自噬也參與果蠅變態的發生。自噬在哺乳動物成年個體組織器官發育和分化中也起了重要作用[Mizushima N, Komatsu Μ.Autophagy: renovat1n of cells and tissues.Cell.2011;147 (4):728-41.]。
[0008]此外，作為程序性細胞死亡的一種，細胞自噬能通過多種途徑直接或是間接導致細胞死亡° [Denton D, Nicolson S，Kumar S.Cell death by autophagy: facts andapparent artefacts.Cell Death Differ.2012; 19 (I): 87-95.]。細胞在一些特定的條件下，由於一系列因素的影響導致了各類基因突變從而導致的細胞各類遺傳性狀及功能改變；該類改變可能將具有正常功能和特性的細胞轉變為具有分裂迅速、抗凋亡等惡性特徵的細胞即癌細胞。有研究表明，腫瘤的發生與發展和自噬的關係極為密切。
[0009]通常由於細胞自噬有利於細胞的存活，因此無論在正常細胞或是腫瘤細胞中，自噬都普遍被保留下來，並在一般情況下都維持著基礎自噬。但是，自噬究竟是抑制還是促進腫瘤細胞的發生發展目前尚無定論；自噬初期可作為腫瘤發生的一種抑制因素，一些已知的腫瘤抑制因子，如PTEN、TSCl和TSC2能激活自噬，並對自噬的抑制可使蛋白降解減少，合成代謝增加，最終導致原癌細胞持續增殖。大多數腫瘤細胞(如肝、胰腺、乳腺癌等)儘管癌變前自噬能力各有不同，但在癌變之後其自噬能力均減弱。自噬缺乏可引起自噬底物p62積聚，通過NF-k B信號途徑引起腫瘤形成[Trocoli A, Djavaher1-Mergny M.Thecomplex interplay between autophagy and NF-κ B signaling pathways in cancercells.Am J Cancer Res.2011; I (5):629-49.];然而,在腫瘤生長到一定程度時，尤其是當腫瘤內還沒有形成足夠的血管為其擴增提供營養時，腫瘤細胞也可通過自噬來克服營養缺乏和低氧的環境得以生存。研究還顯示，在缺乏血清或胺基酸的情況下約3 h，HeLa細胞中的自噬部分從4%上升到37%，結果表明，在營養缺乏等條件下自噬也是腫瘤細胞的一種自我保護的機制[Baldwin AS.Regulat1n of cell death and autophagy by IKK andNF-κ B: critical mechanisms in immune funct1n and cancer.Tmmunol Rev.2012;246(1):327-45.]。
[0010]目前，抗腫瘤藥物誘導的腫瘤細胞自噬所體現的作用大致可概括為兩種:大部分情況下是對腫瘤細胞的保護，某些情況下也能對腫瘤細胞進行殺傷。有研究發現，化療藥物5-FU以及單克隆抗體藥物曲妥珠單抗(Trastuzumab)和西妥昔單抗(Cetuximab)均能顯著地誘導細胞自噬，且抑制由這3種藥物產生的細胞自噬能顯著增加腫瘤細胞對治療的敏感性，[① Vazquez-Martin A, Oliveras-Ferraros C，Menendez JA.AutophagyFacilitates the Development of Breast Cancer Resistance to the Ant1-HER2Monoclonal Antibody Trastuzumab.PLoS One.2009; 4(7): e6251.!② Li J, Hou N,Faried A, Tsutsumi S, et al.1nhibit1n of Autophagy by 3-MA Enhances the Effectof 5-FU-1nduced Apoptosis in Colon Cancer Cells.Ann Surg Oncol.2009; 16(3):761 - 771。[0011 ] 迄今為止，尚未發現有關拉帕替尼誘導腫瘤細胞自噬以及細胞自噬抑制劑與拉帕替尼製成複方藥物、組合物進行聯合給藥或是序貫給藥的報導。


【發明內容】

[0012]本發明的目的是提供一種新型的藥物組合物，具體涉及一種自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物；該藥物組合物包含一種或多種細胞自噬抑制劑，其自身無明顯細胞毒性但能通過抑制細胞自噬來增強拉帕替尼的療效，從而降低拉帕替尼在治療腫瘤時的用量，減少其潛在的副作用和降低治療成本。
[0013]本發明基於目前主要用於腫瘤治療的化療藥物大多會產生耐藥性及對患者有較強的副作用；其中，雖然拉帕替尼的抗腫瘤作用得到了廣泛的論證，但其體內親和力較低，起效劑量較大，存在一些潛在的毒副作用；因此，本發明提供一種自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物；該藥物組合物可加強拉帕替尼活性從而降低其用量和毒副作用；該藥物組合物可通過使用一種或者幾種自噬抑制劑與拉帕替尼製成複方藥物或是組合物，進行聯合給藥或是序貫給藥，加強拉帕替尼的抗腫瘤療效。
[0014]本發明還基於細胞自噬與多種疾病，尤其是腫瘤的發展關係密切，本發明的自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物中，細胞自噬抑制劑在拉帕替尼對HER2高表達的乳腺癌的治療過程中對拉帕替尼有抵抗作用，且使用細胞自噬抑制劑能加強拉帕替尼對肺癌、腦瘤、乳腺癌、胃癌、淋巴瘤、白血病、和骨髓瘤的療效，尤其是乳腺癌和胃癌。
[0015]具體而言，本發明的自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物，其特徵在於，包含細胞自噬抑制劑和拉帕替尼；
所述的細胞自卩遼抑制劑選自3-MA (3-Methyladenine)、渥曼青黴素(Wortmannin)、LY294002、放線菌酮、巴法洛黴素 Al (Bafilomycin Al)、NH4C1、氯喹(Chloroquine)和輕基氯喹(hydroxychloroquine)中的一種或多種；優選為 3-MA (3-Methyladenine)、氯喹(Chloroquine)和輕基氯喹(hydroxychloroquine)中的一種或多種；
本發明中，所述的細胞自噬抑制劑與拉帕替尼組成藥物組合物、複方藥物或序貫使用(序貫使用能增強拉帕替尼治療惡性腫瘤的療效)，用於治療惡性腫瘤；
本發明中，所述的腫瘤包括但不限於乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病和骨髓瘤，尤其是乳腺癌和胃癌，其中最優為HER2過度表達或者發生其它病變的乳腺癌和胃癌；
本發明中，所述的自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物，可通過抑制拉帕替尼誘導的腫瘤細胞的自噬而抵消腫瘤由於細胞自噬而引起的對拉帕替尼治療的拮抗作用，從而顯著增強拉帕替尼對腫瘤的治療效果；
本發明所述的藥物組合物中，進一步選自下述的形式進行配製，包括:固體、溶液、分散劑、膠束、乳劑、脂質體、納米微球等。
[0016]本發明進行了細胞實驗，實驗結果顯示，所述藥物組合物中的拉帕替尼能顯著誘導乳腺癌SKBR3和胃癌N87細胞發生細胞自噬，而細胞自噬則會部分抵消拉帕替尼的抗腫瘤效果；自噬在拉帕替尼殺傷腫瘤細胞的過程中起保護作用，抑制自噬能使拉帕替尼作用細胞的活力降低，增加凋亡，促進細胞周期阻滯；通過使用自噬抑制劑抑制細胞自噬能增加乳腺癌SKBR3和胃癌N87細胞對拉帕替尼的敏感性，從而增強拉帕替尼的療效； 本發明中，採用一種或多種自噬抑制劑與拉帕替尼製成複方藥物、藥物組合物或聯合給藥或序貫給藥，用於治療惡性腫瘤，可增強拉帕替尼對腫瘤的殺傷作用，增強拉帕替尼的療效。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1顯示了拉帕替尼抑制SKBR3和N87細胞增殖，其中，
A:拉帕替尼抑制SKBR3增殖；
B:拉帕替尼抑制N87增殖。
[0018]圖2顯示了拉帕替尼誘導乳腺癌SKBR3細胞、胃癌N87細胞發生細胞自噬，其中， A:加藥組細胞中發出的螢光為明顯的點狀，而DMSO對照組的螢光卻呈彌散狀，無明顯的點狀出現；
B:與對照組相比，給予拉帕替尼的SKBR3和N87細胞的LC3 II的表達水平增強。
[0019]圖3顯示了抑制自噬能增強拉帕替尼誘導的SKBR3和N87細胞死亡，其中，
A:拉帕替尼能顯著降低SKBR3細胞的細胞活力，與拉帕替尼單獨使用組相比，拉帕替尼與自噬抑制劑3-MA或CQ聯合應用組的SKBR3細胞的細胞活力有顯著性下降；
B:拉帕替尼能顯著降低N87細胞的細胞活力，與拉帕替尼單獨使用組相比，拉帕替尼與自噬抑制劑3-MA或CQ聯合應用組的N87細胞的細胞活力有顯著性下降。
[0020]圖4顯示了細胞自噬在拉帕替尼所誘導的細胞凋亡過程中的作用，其中，* P <0.05，#P < 0.01，
A:拉帕替尼能抑制SKBR3細胞中HER2受體蛋白的磷酸化；
B:與單用拉帕替尼的對照組相比，拉帕替尼與20 μ M CQ或者2 mM 3-MA聯用後，均顯著增加cleaved_Caspase3的表達；
C:SKBR3的凋亡率從45.50%上升至72.48%，N87細胞的凋亡率從27.30%升至42.66%ο
[0021]圖5顯示了細胞自噬在拉帕替尼所誘導的細胞周期阻滯過程中的作用。

【具體實施方式】
[0022]實施例1:配製自噬抑制劑藥物
(1)配製氯喹:取適量氯喹溶於純水配成lOmmol/L的儲存液，用0.1 μ M的濾器過濾除菌後保存於4°C，體外實驗用PRM1-1640培養基稀釋500-1000倍用於抑制細胞自噬；
(2)配製氯化銨:取適量氯化銨溶於水配成0.4mol/L的儲存液，用0.1 μ M的濾器過濾除菌後保存於4°C ;體外實驗時稀釋50-80倍用於抑制細胞自噬；
(3)配製羥基氯喹:取適量羥基氯喹溶於純水配成lOmmol/L的儲存液，用0.1 μ M的濾器過濾除菌後保存於4°C，體外實驗室稀釋500-1000倍用於抑制細胞自噬；
(4)配製3-MA:取適量3-MA乾粉配製成0.2mol/L的儲存液，用0.1 μ M的濾器過濾除菌後保存於_20°C ;體外實驗時稀釋50-200倍用於抑制細胞自噬；
(5)配製LY294002:取適量LY294002乾粉配製成0.2mol/L的儲存液，用0.1 μ M的濾器過濾除菌後保存於-20°C ;體外實驗時稀釋50-100倍用於抑制細胞自噬；
(6)配製巴伐洛黴素Al:取適量巴伐洛黴素Al乾粉配製成0.5 μ g/mL的儲存液，用0.1 μ M的濾器過濾除菌後保存於-20°c，體外實驗時稀釋1000倍用於抑制細胞自噬；
(7)自噬抑制劑與拉帕替尼聯合應用於體內或體外抗腫瘤時，自噬抑制劑3-MA的使用濃度範圍為0-1 mol/L,自噬抑制劑CQ的使用濃度範圍為0-50 mol/L，羥基氯喹的使用濃度範圍為0-50 mol/L, LY294002的使用濃度範圍為Ο-lmol/L，巴伐洛黴素Al的使用濃度範圍為 0-10mol/L。
[0023]實施例2:細胞培養
乳腺癌SKBR3細胞和胃癌N87細胞使用含有10% FBS和1%青黴素-鏈黴素的PRM1-1640培養基培養；細胞生長至對數生長期時，將細胞消化後以l*105cellS/mL的濃度轉入細胞培養板內培養，培養12 h後各組細胞分別給予相應濃度的拉帕替尼；聯合給藥時，給藥前I h加入20 μ M CQ或者2 mM 3-MA抑制SKBR3和N87細胞的細胞自噬；連續培養24 h、48 h或72 h後進行下一步處理。
[0024]實施例3:拉帕替尼能抑制SKBR3和N87細胞的增殖
將適當濃度的SKBR3和N87細胞種在96孔培養板內，加入拉帕替尼使拉帕替尼的終濃度為0-1.6 μ M，培養48 h，向每孔加入10 μ LMTT液，在培養箱內放置4 h,之後用DMSO溶液溶解，570nm下測量光密度值(0.D.)，結果如圖1的A、B所示，拉帕替尼對SKBR3和N87細胞有良好的藥效並且拉帕替尼對SKBR3和N87細胞的殺傷作用具有良好的劑量依賴性。
[0025]實施例4:拉帕替尼能誘導乳腺癌SKBR3細胞、胃癌N87細胞發生細胞自噬乳腺癌SKBR3細胞、胃癌N87細胞用LC3-EGFP質粒轉染後，再用0.1 μ M拉帕替尼處理48 h，隨後在雷射共聚焦顯微鏡下觀察綠色螢光斑點，結果如圖2A所示，加藥組細胞中發出的螢光為明顯的點狀，而DMSO對照組的螢光卻呈彌散狀，無明顯的點狀出現。
[0026]將收集到的SKBR3和N87細胞用PBS洗I次，用RIPA試劑盒裂解細胞，並定量後按照每個泳道20 μ g進行蛋白電泳後轉膜至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉I h，分別加入LC3 II和β-actin抗體，於4°C孵育12 h。TBST洗膜後加入二抗室溫孵育1.5 h，用ECL顯色液顯色；SKBR3和N87細胞經過拉帕替尼處理不同時間或不同濃度處理後，通過WesternBlot的檢測，結果如圖2B所示，與對照組相比，給予拉帕替尼的SKBR3和N87細胞的LC3 II的表達水平增強。
[0027]實施例5:抑制自噬能增強拉帕替尼誘導的SKBR3和N87細胞死亡
SKBR3和N87細胞分別給予0.1 μ M的拉帕替尼，並在給藥前I h加入2mmol/L的3-MA和20 μ mol/L的CQ抑制細胞自噬；連續培養48 h後經過MTT法測定各組的細胞活力，結果如圖3A、B所示，拉帕替尼能顯著降低SKBR3和N87細胞的細胞活力，與拉帕替尼單獨使用組相比，拉帕替尼與自噬抑制劑3-MA或CQ聯合應用組的SKBR3和N87細胞的細胞活力有顯著性下降；表明自噬抑制劑和拉帕替尼的聯合給藥能更有效地抑制SKBR3和N87細胞的生長，且只加抑制劑3-MA和CQ組的細胞活力與對照組相比，無顯著差異；抑制劑本身對細胞無明顯細胞毒性，自噬抑制劑和拉帕替尼的聯合給藥所降低的SKBR3和N87細胞的細胞活性並非是抑制劑和藥物的協同作用所致，而是因抑制自噬後增加SKBR3和N87細胞對拉帕替尼的藥物敏感性；結果表明，抑制自噬能增加拉帕替尼對SKBR3和N87細胞的殺傷作用。
[0028]實施例6:細胞自噬在拉帕替尼所誘導的細胞凋亡過程中的作用
(I)拉帕替尼和自噬抑制劑聯用對凋亡相關蛋白表達水平的影響
選對數生長期的細胞，以10X 15個細胞/孔的密度接種於細胞6孔板內培養過夜，待細胞貼壁充分後，加入0.ΙμΜ的拉帕替尼(SKBR3細胞)再繼續培養48 h ;然後採用RIPA裂解液裂解細胞並提取細胞全蛋白組，然後進行Western-blot。
[0029]結果如圖4A所示，拉帕替尼能抑制SKBR3細胞中HER2受體蛋白的磷酸化；拉帕替尼促進PARP的剪切，且呈明顯的量效關係；拉帕替尼下調抑凋亡基因Bcl-2表達，且呈明顯的量效關係；隨拉帕替尼濃度增加，SKBR3細胞中LC3-1I的表達量增多；
(2)拉帕替尼和自曬抑制劑聯用對Caspase-3表達水平的影響
與單用拉帕替尼的對照組相比，拉帕替尼與20 μ M CQ或者2 mM 3-MA聯用後，均顯著增加cleaved-Caspasd的表達(如圖4B所示)，表明使用自噬抑制劑CQ或是3-MA抑制細胞自噬能增強拉帕替尼誘導的SKBR3和N87細胞的凋亡；
(3)流式細胞法檢測結果
①DMSO對照組中，SKBR3和N87細胞的凋亡較少；②加入0.1 μΜ的拉帕替尼後，SKBR3的凋亡率為45.50%,而Ν87細胞的凋亡率也為27.30% 0.1 μ M拉帕替尼與20μ M的CQ聯用後，與單用拉帕替尼相比，SKBR3的凋亡率上升了將近一倍，為87.61%，Ν87細胞的凋亡率也為從原先的27.30%上升到了 52.26% ;④加入2 mM的3-MA後，SKBR3和N87細胞的凋亡率分別為12.05%和12.90% ;⑤加入0.1 μ M的拉帕替尼的同時再加入2mM的3-MA後，SKBR3的凋亡率從原先的45.50%上升至72.48%，N87細胞的凋亡率也為從原先的27.30%上升到了 42.66% (如圖4C所示)；
實驗結果表明，抑制細胞自噬能增強拉帕替尼誘導乳腺癌SKBR3和胃癌N87細胞犯人凋亡。
[0030]實施例7:細胞自噬在拉帕替尼所誘導的細胞周期阻滯過程中的作用
①對照組54.27%的SKBR3細胞處於Gl期，31.67%的細胞處於分裂期加入了 0.1μ M的拉帕替尼後，72.60% SKBR3細胞的細胞周期處於Gl期(P < 0.05)，而處在細胞分裂期的細胞比例降低至16.63% ;③加入20 μ M的CQ後，有55.00% SKBR3細胞的細胞周期處於細胞間期中的Gl期(P < 0.05)，處在細胞分裂期的細胞比例為28.00%，通過t檢驗統計檢測出其與DMSO處理組相比無顯著性差異；④加入0.1 μ M的拉帕替尼的同時，再加入20 μ M的CQ，發現有81.13%SKBR3細胞的細胞周期處於間期中的Gl期，而處在細胞分裂期細胞的比例下降到6.53%，通過t檢驗統計檢測出其與拉帕替尼單獨處理組相比有顯著性的差異(P 0.05);⑥加入0.1 μΜ的拉帕替尼的同時再加入2 mM的3-MA後，結果顯示，大約有78.43% SKBR3細胞的細胞周期處於細胞間期中的Gl期，而處在細胞分裂期的細胞比例下降到6.64%，通過t檢驗統計檢測出其與拉帕替尼單獨處理組相比有顯著性的差異(P < 0.05)(如圖5所示)；
結果表明，拉帕替尼與自噬抑制劑聯用對胃癌N87細胞周期的影響和乳腺癌SKBR3的影響類似；自噬抑制劑CQ或3-MA抑制細胞自噬能增強拉帕替尼所誘導的SKBR3和N87細胞周期的阻滯現象。
[0031]實施例8:配製自噬抑制劑和拉帕替尼藥物組合物 (O氯喹和拉帕替尼藥物組合物的配製
主藥拉帕替尼250g ，自噬抑制劑氯喹200g，澱粉為填充劑，兼做內加崩解劑40g，10%澱粉漿為黏合劑24g，外加崩解劑幹澱粉23g ，硬脂酸鎂為潤滑劑3g，製成1000片，每片含拉帕替尼0.25g ；
(2)巴伐洛黴素Al和拉帕替尼藥物組合物的配製
拉帕替尼250g ，巴伐洛黴素Al 180g ，澱粉40g，10%澱粉漿25g ，外加崩解劑幹澱粉20g，潤滑劑硬脂酸鎂4g，製成1000片，每片含拉帕替尼0.25g。
【權利要求】
1.一種自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物，其特徵在於，包含細胞自噬抑制劑和拉帕替尼； 所述的細胞自噬抑制劑選自3-MA、渥曼青黴素、LY294002、放線菌酮、巴法洛黴素Al、NH4C1、氯喹和羥基氯喹中的一種或多種。
2.按權利要求1所述的自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物，其特徵在於，所述的細胞自噬抑制劑選自3-MA、氯喹和羥基氯喹中的一種或多種。
3.按權利要求1所述的自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物，其特徵在於，所述的細胞自噬抑制劑與拉帕替尼製成複方藥物。
4.按權利要求3所述的自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物，其特徵在於，所述複方藥物製成:固體、溶液、分散劑、膠束、乳劑、脂質體或納米微球劑型。
5.按權利要求3所述的自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物，其特徵在於，所述的複方藥物中，自噬抑制劑與拉帕替尼序貫使用。
6.權利要求1所述的自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物在製備治療腫瘤藥物中的用途。
7.按權利要求6所述的用途，其特徵在於，所述的腫瘤選自乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。
8.按權利要求6所述的用途，其特徵在於，所述的腫瘤選自HER2過度表達或者發生其它病變的乳腺癌或胃癌。
9.按權利要求6所述的用途，其特徵在於，所述的自噬抑制劑抑制拉帕替尼誘導的腫瘤細胞的自噬、抵消腫瘤由於細胞自噬而引起的對拉帕替尼治療的拮抗作用。
【文檔編號】A61K33/02GK104324035SQ201310310119
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年7月23日 優先權日:2013年7月23日
【發明者】鞠佃文, 王曉丹, 王子玉, 曾賢, 李玉彬, 範佳君, 王紹飛 申請人:復旦大學