具有高產α-環糊精能力的環糊精葡萄糖基轉移酶的突變體及突變方法
2023-10-05 18:42:24 2
專利名稱：具有高產α-環糊精能力的環糊精葡萄糖基轉移酶的突變體及突變方法
技術領域：
具有高產a-環糊精能力的環糊精葡萄糖基轉移酶的突變體及突變方法，本 發明屬於基因工程和酶工程領域。具體地說本發明是利用蛋白質工程的定點突 變方法改善環糊精葡萄糖基轉移酶(CGT酶)的產物特異性的技術。
背景技術：
環糊精是由六個以上葡萄糖連結而成的具有環狀疏水圓錐形結構的低聚糖 非還原性化合物系列，其中最常用的是a-、 (3-、 Y-環糊精，它們分別由6、 7、 8 個葡萄糖單元構成。目前，環糊精的工業化生產均採用酶法合成，即在CGT酶
催化作用下，通過環化反應轉化澱粉及相關基質合成環糊精。由於環糊精能與 許多客體分子形成包合物，從而改變客體分子的物理和化學性質如溶解度、穩 定性等，因此在食品、醫藥、農業等領域具有廣泛的應用。
CGT酶是一個多功能型的酶，它能催化四種不同的反應三種轉糖基化反 應(歧化反應、環化反應和偶合反應)和水解反應。CGT酶通過環化反應能利用 澱粉生產環糊精，這是其工業應用的基礎。用CGT酶生產環糊精一個主耍的不 利條件是所有己知的野生型CGT酶生產的是a-、 p-、 Y-環糊精的混合物。這不 僅給產物的分離純化帶來很大不便，而且提高了生產成本。目前，兩種工藝可 以用於從環糊精混合物中純化單一的環糊精(3-環糊精的選擇性結晶(P-環糊精 溶解度相對低)和有機溶劑選擇性絡合。a-環糊精一般用癸醇，但這個化合物 很難從水溶液中去除，因為其沸點高達229"C; —般用環十二酮對Y-環糊精進行 絡合和選擇性沉澱，但是這個溶劑對於商業使用來講太貴，而且，有機溶劑使 用的不利因素還包括它們的毒性和可燃性以及需要溶劑回收工藝，因此，目前 a-、 Y-環糊精的利用很大程度上受到限制。即使是P-環糊精的生產工藝也不是很 理想，因為對於大多數應用來講，目前工藝使P-環糊精的生產成本還是太高。因 此，如果所得到CGT酶所生產的環糊精中某一種特定的環糊精比例大大增高， 那麼就可以避免上述成本太高和有機溶劑汙染等問題。
本發明所使用的來源於Peam'6ac/〃M macerara JFB 05-01(CCTCC NO: M 208063)的CGT酶雖然在酶轉化反應初期主要生產a-環糊精，但後期a-環糊精 的含量偏低，在未使用有機溶劑的情況下，反應混合液中(3-環糊精的含量甚至高 於ot-環糊精，因此，進一步提高該酶的產a-環糊精能力對工業上a-環糊精的生 產是相對有利的。 發明內容本發明的一個目的是提供提高P ma^ra/w JFB 05-01 CGT酶產a-環糊精能
力的突變方案。
本發明的另一個目的是提出具有更高a-環糊精生產能力的突變體酶 D372K， Y89D， Y89R及D372K/Y89R，及其構建方法。
本發明的技術方案
來源於軟化類芽孢桿菌(Pe"m'6"c/〃ws wacera似)JFB 05-01的環糊精葡萄 糖基轉移酶，簡稱CGT酶，的三種單突變體酶D372K， Y89D及Y89R:將CGT 酶基因中第372位的天冬氨酸Asp突變成了賴氨酸Lys，命名為D372K;將CGT 酶基因中第89位的酪氨酸Tyr分別突變成了天冬氨酸Asp或精氨酸Arg，分別 命名為Y89D及Y89R;它們相比於野生型CGT酶具有更高的產a-環糊精能力。
三種單突變體酶D372K， Y89D及Y89R的製備方法，根據i3 w"ceram JFB 05-01 CGT酶基因序列，分別設計併合成引入D372K， Y89D或Y89R突變的引 物，對CGT酶基因進行定點突變，測定DNA序列，分別鑑別出第372位Asp 密碼子變成Lys密碼子，第89位Tyr密碼子分別變成Asp或Arg密碼子的突變 體，並進行大腸桿菌表達。
Z3 macerara JFB 05-01 CGT酶的一種雙突變體酶D372K7Y89R:將單突變體 酶D372K基因中第89位的酪氨酸Tyr突變成了精氨酸Arg，命名為 D372K/Y89R，其相比於野生型CGT酶具有更高的產a-環糊精能力。
一種雙突變體酶D372K/Y89R的製備方法，以單突變體酶D372K基因為模 板，設計併合成引入Arg密碼子於89位的定點突變引物，對D372K基因進行 定點突變，測定序列，鑑別出89位的Tyr突變成Arg的突變體，並進行大腸杆 菌表達。
所述的突變體酶D372K， Y89D， Y89R及D372K/Y89R的製備 (1)定點突變
單突變體酶D372K， Y89D和Y89R的定點突變利用快速PCR技術，以
表達載體c^/pET-20b(+)為模板，
引入D372K密碼子的定點突變引物為
正向引物5'- GACCGGCGATGGCAAACCCAACAACC -3，(下劃線為突變鹼基) 反向引物5，- GGTTGTTGGGTTTGCCATCGCCGGTC -3 ，(下劃線為突變鹼基)
引入Y89D密碼子的定點突變引物為
正向引物5，- CTCCGTCATCAAGGATTCCGGCGTTA -3，(下劃線為突變鹼基) 反向引物5，- TAACGCCGGAATCCTTGATGACGGAG -3，(下劃線為突變鹼基)
引入Y89R密碼子的定點突變引物為
正向引物5，- CTCCGTCATCAAGCGTTCCGGCGTTA -3，(下劃線為突變石鹹基) 反向引物5，- TAACGCCGGAACGCTTGATGACGGAG -3 ，(下劃線為突變鹼基)雙突變體酶D372K/Y89的定點突變利用快速PCR技術，以單突變體酶 D372K基因為模板， 弓I入Y89R密碼子的定點突變引物為
正向引物5，- CTCCGTCATCAAGCGTTCCGGCGTTA -3'(下劃線為突變鹼基)
反向引物5，- TAACGCCGGAACGCTTGATGACGGAG -3，(下戈U線為突變鹼基)
PCR反應體系均為10x￡x ra《buffer 5 ^L， 2.5 mM dNTPs 5 ^L，正向引 物(10 pM) l(iL，反向引物(10 ^M) lpL，模板DNA 1 ^L，五jc r"《HS (5 U/pL) 0.25 ^L，加入雙蒸水至50iuL。
PCR擴增條件均為94。C預變性4min;隨後進行35個循環(94。C 30 s， 55°C 30 s， 72。C6min);最後72。C保溫10 min。
PCR產物經Dp" I(購自加拿大Fermentas公司)消化，轉化大腸桿菌JM 109 感受態細胞，感受態細胞在LB固體培養基(含100pg/mL氨苄青黴素)培養過夜 後，挑單克隆於LB液體培養基(含100 ng/mL氨苄青黴素)中培養，後提取質粒， 將突變質粒轉化表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，所有突變質粒均測 序正確。
(2)突變體的表達與純化
挑取轉入表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆於LB液體培養基(含100 ^g/mL氨苄青黴素)生長8~10 h，按4%接種量將種子發酵液接到TB液體培養基 (含100嗎/mL氨苄青黴素)；大腸桿菌在30 r搖床培養至OD6M=0.6，加入 O.OlmM終濃度的IPTG誘導胞外表達，並在25。C搖床繼續培養發酵90小時後， 將發酵液於4 °C、 10000 rpm離心20 min除菌體，收集上清液並純化，分別得 到突變體酶D372K， Y89D， Y89R及D372K/Y89R製品。
軟化類芽f包桿菌(屍eam7)ac/〃w macerara) JFB 05-01(CCTCC NO: M 208063)，已在中國專利CN101294149A公開，
公開日2008年10月29日。
本發明的有益效果本發明構建了 4個有意義的突變體，均實現了a-環糊 精產物特異性的提高，比野生型CGT酶更利於(x-環糊精的工業化生產。
圖l野生型CGT酶和突變型酶的三種環糊精產量。A、野生型CGT酶；B、 突變體酶D372K; C、突變體酶Y89D; D、突變體酶Y89R; E、突變體酶D372K/Y89R。 其中4表示a-環糊精；《表示卩-環糊精；A表示Y-環糊精。
具體實施例方式
實施例1:本例說明突變體酶D372K， Y89D， Y89R, D372K/Y89R的製備。 1)定點突變
利用快速PCR技術，單突變體酶D372K， Y89D及Y89R的定點突變以 表達載體cg/pET-20b(+)為模板，
6引入D372K密碼子的定點突變引物為
正向引物5'- GACCGGCGATGGCAAACCCAACAACC -3，(下劃線為突變鹼基) 反向引物5，- GGTTGTTGGGTTTGCCATCGCCGGTC -3，(下劃線為突變鹼基)
引入Y89D密碼子的定點突變引物為
正向引物5'- CTCCGTCATCAAGGATTCCGGCGTTA -3，(下劃線為突變鹼基) 反向引物5 ，- TAACGCCGGAATCCTTGATOACGGAG -3 ，(下劃線為突變鹼基)
引入Y89R密碼子的定點突變引物為
正向引物5，- CTCCGTCATCAAGCGTTCCGGCGTTA -3，(下劃線為突變鹼基) 反向引物5，- TAACGCCGGAACGCTTGATGACGGAG -3'(下劃線為突變鹼基) 雙突變體酶D372K/Y89的定點突變利用快速PCR技術，以單突變體酶
D372K基因為模板，
引入Y89R密碼子的定點突變引物為
正向引物5，- CTCCGTCATCAAGCGTTCCGGCGTTA -3，(下劃線為突變鹼基) 反向引物5'- TAACGCCGGAACGCTTGATGACGGAG -3 ，(下劃線為突變鹼基) PCR反應體系均為10x￡x r叫buffer 5 ptL， dNTPs (2.5 mM) 5 pL，正向引
物(10 pM) lpL，反向引物(10 nM) lpL，模板DNA 1 |iL， ￡x &《HS (5 U L)
0.25 (iL，加入雙蒸水至5(HiL。
PCR擴增條件均為94。C預變性4min;隨後進行35個循環(94。C 30 s， 55°C
30 s， 72。C6min);最後72。C保溫10 min。
PCR產物經D;w I (購自加拿大Fermentas公司)消化，轉化大腸桿菌JM109
感受態細胞，感受態細胞在LB固體培養基(含100pg/mL氨苄青黴素)培養過夜
後，挑單克隆於LB液體培養基(含100pg/mL氨苄青黴素)中培養，提取質粒，
突變質粒轉化表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，突變質粒均測序正確。 2)突變體酶的表達與純化
挑取轉入表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆於LB液體培養基(含100 嗎/mL氨苄青黴素)生長8~10 h，按4%接種量將種子發酵液接到TB液體培養基 (含100嗎/mL氨苄青黴素)；大腸桿菌在30 。C搖床培養至OD6。。=0.6，加入 O.OlmM終濃度的IPTG誘導胞外表達，並在25t:搖床繼續培養發酵90小時後， 將發酵液於4 。C、 10000 rpm離心20 min除菌體，收集上清液。
上清液中加入70%固體硫酸銨鹽析過夜，4 。C、 10000 rpm離心20 min， 取沉澱物用適量含20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉、20mM咪唑、pH7.4的緩衝 液A溶解，並在緩衝液A中透析過夜後，通過0.22pm膜過濾後製成上樣樣品； Ni親和柱用緩衝液A平衡後，將上樣樣品吸入Ni柱，使之完全吸附後，分別 用緩衝液A、含20-480 mM咪唑的緩衝液A、含480mM咪唑的緩衝液A洗脫， 流速lmL/min，檢測波長為280nm，分部收集含CGT酶酶活的洗脫液；活力組分在50 mM磷酸鈉緩衝液(pH=6)中透析過夜後，分別得到純化突變體酶D372K， Y89D， Y89R及D372K/Y89R。
實施例2:本實施例說明酶活分析。1)酶活測定方法
甲基橙法測定a-環化活力的方法取適當稀釋的酶液0.1mL，加入裝有0.9mL預先用50mM磷酸緩衝液(pH6.5)配製的3n/。(w/v)可溶性澱粉溶液中，在40。C下反應10min後，加入l.OmL l.ON的鹽酸停止反應，再加入1.0 mL用50mM磷酸緩衝液配製的O.l mM甲基橙，在16"C下保溫20min，在505nm下測定吸光度。 一個酶活單位定義為在該條件下每分鐘生成1 ^mola-環糊精所需酶量。
酚酞法測定(3-環化活力的方法取適當稀釋的酶液O.l mL，加入裝有0.9 mL預先用50mM磷酸緩衝液(pH6.5)配製的3。/。(w/v)可溶性澱粉溶液的試管中，在4(TC下反應10min後，加入3.5mL 30mM NaOH和0.5mL由5mM Na2C03溶液配製的0.02%(w/v)酚酞停止反應，在室溫下保溫20min,在550nm下測定吸光度。 一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成1^imol卩-環糊精所需酶量。
溴甲酚氯法測定Y-環化活力的方法如下取適當稀釋的酶液O.l mL，加入裝有0.9 mL預先用50mM磷酸緩衝液(pH6.5)配製的3。/。(w/v)可溶性澱粉溶液的試管中，在40'C下反應10min後，加入50(iL l.ON的鹽酸停止反應，再加入2mL0.2M檸檬酸緩衝液(pH 4.2)和100|liL 5 mM溴甲酚氯溶液，在室溫下保溫20min，在630nm下測定吸光度。 一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成l)imol Y-環糊精所需的酶量。
2)酶活比較實驗結果列於表l，將突變體純酶製品與野生型純酶製品相比，可以發現單突變體酶D372K的a-環化活力雖有所上升，但(3-環化活力下降了 51°/。； Y89D的a-環化活力上升了 10%， (3-環化活力也有輕微的上升；Y89R的a-環化活力下降了 18%， P-環化活力降低了 56°/。；雙突變體酶D372K/Y89R的a-環化活力比野生型酶上升了 24%， P-環化活力下降了 67%。 Y89D， Y89R和D372K/Y89R的總環化活力上升了 10%左右。而且，突變體酶D372K， Y89D，Y89R和D372K/Y89RY89D的a-環化活力佔總環化活力的比例高於野生型酶。
表l酶a-環化活力卩-環化活力Y-環化活力總活力
(U/mg)(U/mg)(U/mg)(U/mg)
野生型190.432.21.1223.7
D372K202.515.61.0219.1
Y89D210.733.61.6245.9
Y89R225.414.00.7240.1
D372K/Y89R235.610.50.6246.7
8實施例3:本實施例說明HPLC方法分析環糊精生成量。
配製5%(溼基，含水量8%， w/v)可溶性澱粉溶液作為底物，5g澱粉溶解在 90mL磷酸鈉緩衝液(pH6.0)中，定容至100mL，在沸水中煮沸30min。分別加入 一定量的野生CGT酶、突變酶D372K， Y89D， Y89R或D372K/Y89R使反應體 系中酶活為0.2U/mL,置於40 。C下反應40h，隔時間取樣600nL， 12000 rpm離 心10min，取上清500iiL，加5jiL糖化酶(70 U/mL)，在30 。C糖化lh, 10min 煮沸滅活，12000 rpm離心30 min，取上清0.45[im超濾膜過濾後取20|iL上HPLC
分析。 一
反應液中a-, (3-,和Y-環糊精的濃度採用HPLC測定，採用HPLC進行產物 分析的色譜條件是Waters 600HPLC色譜儀，Waters自動進樣器，色譜柱 LichrosorbNH2(4.6mmxl50mm)， Waters2410示差檢測器；流動相(V/V)為65% 乙腈水溶液，流速lmLmin";柱溫30 °C。
實驗結果列於圖1，將上述突變體表達獲得的突變體純酶製品與野生型純酶 製品相比，可以發現，突變體D372K， Y89D， Y89R， D372K7Y89R實現了a-環糊精生產能力的提高。表3可以看出，通過40h培養後，單突變體酶D372K 的a-環糊精產量增加了29。/。， P-環糊精產量減少了23。/o; Y89D的a-環糊精產量 增加了 12%， P-環糊精產量減少了 10%，而Y89R的a-環糊精產量上升了 35%， P-環糊精產量下降了 30%;雙突變體酶D372K/Y89R優於野生型酶和單突變體 酶，a-環糊精產量增加了 50%， P-環糊精產量比野生型減少了 43%，野生型酶 的最終環糊精比例為41.8:54.4:3.8，雙突變體酶的最終環糊精比例為65:31.9:3.1。
表3
酶澱粉轉化率(％)a產物te/i) P
野生型42.37.6(41.8)9.9 (54.4)0.69 (3.8)
D372K42.09.8(54.3)7.6(42.1)0.65 。.6)
Y89D42.08.5(47.1)8.9 (49.3)0.64 (3.6)
Y89R41.110.3 (58.2)6.8 (38.4)0.60 (3.4)
D372K/Y89R40.811.4 (65.0)5.6(31.9)0.55 (3.1)
9序列表
SEQ ID NO: 1
正向引物5， - GACCGGCGATGGCAAACCCAACAACC墨3，反向引物5，誦GGTTGTTGGGTTTGCCATCGCCGGTC畫3，
SEQ ID NO: 2
正向引物5， -CTCCGTCATCAAGGATTCCGGCGTTA-3'反向引物5， -TAACGCCGGAATCCTTGATGACGGAG-3，
SEQ ID NO: 3
正向引物5， -CTCCGTCATCAAGCGTTCCGGCGTTA-3，反向引物5， -TAACGCCGGAACGCTTGATGACGGAG-3，
權利要求
1、來源於軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans)JFB05-01的環糊精葡萄糖基轉移酶，簡稱CGT酶，的三種單突變體酶D372K，Y89D及Y89R，其特徵是將CGT酶基因中第372位的天冬氨酸Asp突變成了賴氨酸Lys，命名為D372K；將CGT酶基因中第89位的酪氨酸Tyr分別突變成了天冬氨酸Asp或精氨酸Arg，分別命名為Y89D及Y89R；它們相比於野生型CGT酶具有更高的產α-環糊精能力。
2、 權利要求1所述的三種單突變體酶D372K， Y89D及Y89R的製備方法， 其特徵在於根據P JFB 05-01 CGT酶基因序列，分別設計併合成引入 D372K， Y89D或Y89R突變的引物，對CGT酶基因進行定點突變，測定DNA 序列，分別鑑別出第372位Asp密碼子變成Lys密碼子，第89位Tyr密碼子分 別變成Asp或Arg密碼子的突變體，並進行大腸桿菌表達。
3、 P wacerara JFB 05-01 CGT酶的一種雙突變體酶D372K/Y89R，其特徵 是將單突變體酶D372K基因中第89位的酪氨酸Tyr突變成了精氨酸Arg，命 名為D372K/Y89R，其相比於野生型CGT酶具有更高的產a-環糊精能力。
4、 權利要求3所述的一種雙突變體酶D372K/Y89R的製備方法，其特徵是 以單突變體酶D372K基因為模板，設計併合成引入Arg密碼子於89位的定點 突變引物，對D372K基因進行定點突變，測定序列，鑑別出89位的Tyr突變成 Arg的突變體，並進行大腸桿菌表達。
5、 權利要求2或4所述的突變體酶D372K， Y89D， Y89R及D372K/Y89R 的製備，其特徵是(1)定點突變單突變體酶D372K， Y89D及Y89R的定點突變利用快速PCR技術，以 表達載體cgf/pET-20b(+)為模板， 引入D372K密碼子的定點突變引物為正向引物5 ，- GACCGGCGATGGCAAACCCAACAACC -3'，反向引物5 ， - GGTTGTTGGGTTTGCCATCGCCGGTC隱3 ，， 引入Y89D密碼子的定點突變引物為正向引物5 ， - CTCCGTCATCAAGGATTCCGGCGTTA -3 ，，反向引物5 ， - TAACGCCGGAATCCTTGATGACGGAG畫3 ，， 引入Y89R密碼子的定點突變引物為正向引物5 ，- CTCCGTCATCAAGCGTTCCGGCGTTA -3 ，，反向引物5， - TAACGCCGGAACGCTTGATGACGGAG -3"，下戈U線為突變鹼基，雙突變體酶D372K/Y89的定點突變利用快速PCR技術，以單突變體酶下劃線為突變鹼基， 下劃線為突變鹼基，下劃線為突變鹼基， 下劃線為突變鹼基，下劃線為突變鹼基，D372K基因為模板，引入Y89R密碼子的定點突變引物為正向弓l物5，- CTCCGTCATCAAGCGTTCCGGCGTTA -3'，下劃線為突變鹼基， 反向引物5,- TAACGCCGGAACGCTTGATGACGGAG -3,，下戈U線為突變鹼基， PCR反應4本系均為lOx五;c buffer 5 pL， 2.5 mM dNTPs 5 |aL， 10 ^M正 向引物l(iL， 10 pM反向引物liiL，模板DNAlpL， 5 U/|iL￡x化《HS 0.25 juL， 加入雙蒸水至50)aL;PCR擴增條件均為94。C預變性4min;隨後進行94。C30s， 55°C 30 s， 72°C 6min35個循環；最後72。C保溫10 min;PCR產物經Dp" I消化，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，感受態細胞在 含100嗎/mL氨苄青黴素的LB同體培養基培養過夜後，挑單克隆於含100 嗎/mL氨苄青黴素的LB液體培養基中培養，後提取質粒，將突變質粒轉化表達 宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，所有突變質粒均測序正確； (2)突變體的表達與純化 挑取轉入表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆於含100 pg/mL氨苄青 黴素的LB液體培養基生長8~10 h，按4%接種量將種子發酵液接到含100 (ig/mL 氨苄青黴素的TB液體培養基；大腸桿菌在30 。C搖床培養至OD6。。=0.6，加入 O.OlmM終濃度的IPTG誘導胞外表達，並在25。C搖床繼續培養發酵90小時後， 將發酵液於4 °C、 10000 rpm離心20 min除菌體，收集上清液並純化，分別得 到突變體酶D372K， Y89D， Y89R及D372K/Y89R製品。
全文摘要
具有高產α-環糊精能力的環糊精葡萄糖基轉移酶的突變體及突變方法，屬於基因工程和酶工程領域。本發明改進環糊精葡萄糖基轉移酶(簡稱CGT酶)的產物特異性，提供了提高來源於Peanibacillus macerans JFB 05-01(CCTCC NOM 208063)的CGT酶產α-環糊精能力的突變方案，將CGT酶的372位的Asp替換為Lys，89位的Tyr分別替換為Asp及Arg，分別獲得單突變體酶D372K，Y89D及Y89R，它們的α-環糊精生產能力較野生型CGT酶有所提高；將帶有Lys372的CGT酶的基因片段替代Y89R基因的相應片段，可獲得雙突變體酶D372K/Y89R，其α-環糊精產量比野生型CGT酶增加了1.5倍，而β-環糊精產量降低了57％。這些突變體比野生型CGT酶更利於α-環糊精的生產。
文檔編號C12R1/01GK101503681SQ20091002915
公開日2009年8月12日 申請日期2009年1月6日 優先權日2009年1月6日
發明者敬 吳, 張佳瑜, 李兆豐, 堅 陳 申請人:江南大學