一種新型的產生物表面活性劑海水發酵型菌株的製作方法

2023-06-18 04:06:36

一種新型的產生物表面活性劑海水發酵型菌株的製作方法
【專利摘要】傳統發酵一般採用淡水資源。本發明公開了一種新型的產生物表面活性劑的海水發酵型菌株，能很好的利用天然海水作為發酵用水和廢棄食用油脂作為單一碳源進行發酵生產生物表面活性劑鼠李糖脂。通過在沿海淡水資源缺乏和水質欠佳的地區興辦海水發酵企業，可解決傳統發酵工業對淡水資源的依賴。本發明菌株通過海水富集培養、高鹽血平板初篩、合成培養基復篩以及海水搖瓶發酵驗證而得到分離純化，並通過生理生化實驗和分子鑑定分析，確定該海水發酵型菌株為銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)，已於2014年4月25日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC?No.9091。該發明菌株在利用海水發酵上的優勢，所得粗產物鼠李糖脂可用於區域性的市場推廣，將在農業、石油化工、環境治理、土壤修復、化妝品工業、製藥行業和食品行業等領域發揮潛在的應用前景。
【專利說明】一種新型的產生物表面活性劑海水發酵型菌株

【技術領域】
[0001] 本發明屬於發酵工程領域，具體涉及一株海水發酵型菌株在利用天然海水作為發 酵用水和廢棄食用油脂作為單一碳源進行發酵生產生物表面活性劑鼠李糖脂。

【背景技術】
[0002] 目前市場上的大多數表面活性劑主要來自石油基的化學產品，其生產過程需要消 耗大量的石油產品，且易造成環境汙染，而生物表面活性劑的獲得則不存在這樣的問題。生 物表面活性劑鼠李糖脂是由微生物發酵次級代謝得到的一種新型陰離子生物表面活性劑， 具有可生物降解、低毒性和環境友好性等特點。且因鼠李糖脂具有良好的乳化性、潤溼性、 起泡性，在農業、石油化工、環境保護、化妝品工業、製藥行業和食品行業等具有潛在的應用 前景。
[0003] 發酵用水和無機鹽成本是發酵企業生產成本的重要組成部分。天然海水中含有豐 富的無機鹽礦質元素，可補償發酵用水中部分無機鹽離子。傳統發酵用水多為淡水，目前海 水淡化成本較高，因此在淡水缺乏，水質不佳的沿海灘涂地區利用新型的海水發酵菌株產 生物表面活性劑鼠李糖脂具有特殊意義。
[0004] 發酵碳源原料的成本也是發酵工程生產成本的重要組成部分，而目前地溝油、炸 貨油等廢棄食用油脂並未得到很好的利用，反而成了嚴重的環境汙染物或被不合理地回收 利用重回餐桌，危害人們的健康。因此興辦利用天然海水作為發酵用水和廢棄食用油脂為 單一碳源發酵產生物表面活性劑的發酵企業，既可解決傳統工業發酵對淡水資源的依賴， 也可為廢棄食用油脂的處理提供新思路。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一株海水發酵型菌株，用於利用天然海水作為發酵用水和廢 棄食用油脂為單一碳源發酵生產生物表面活性劑鼠李糖脂，可在淡水缺乏，水質不佳的沿 海地區興辦海水發酵企業，且採用該菌株生產所得的粗產物，可用於區域性的市場推廣。
[0006] 本發明提供的海水發酵型菌株是具有耐海水鹽度的銅綠假單胞菌，菌株名稱為 Z-2,其分類命名為銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa),並已於2014年4月25日保 藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（地址：北京市朝陽區北辰西路1號 院3號中國科學院微生物研究所），保藏編號為：CGMCC No. 9091。
[0007] 所述新型產生物表面活性劑的海水發酵型菌株的分離篩選和鑑定步驟為：取沿 海灘涂植物根際土樣或泥樣，在實驗室利用海水發酵培養基富集培養、高鹽血平板初篩、合 成培養基復篩和海水搖瓶發酵驗證，分離純化菌株，根據發酵液排油圈形成大小和表面張 力的測定，最終篩選出一株能利用天然海水作為發酵用水和廢棄食用油脂為單一碳源發酵 生產生物表面活性劑鼠李糖脂的菌株，標號為Z-2 ;然後根據菌落的形態特徵、生理生化指 標，以及16SrDNA測序結果與GenBank中的序列進行同源性比較分析發現，菌株Z-2經鑑定 為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.)，命名為銅綠假單胞菌Z-2。
[0008] 採用該菌株海水發酵製得粗產物鼠李糖脂的過程如下： (1)發酵種子液的製備：取保藏的銅綠假單胞菌Z-2斜面接種於三角瓶的高鹽種子培 養基中，並將三角瓶置於恆溫搖床振蕩培養，溫度為30°C轉速180r ?mirT1，過夜培養後即得 種子液。 ⑵發酵液的製備：取⑴中所獲得的Z-2菌株種子液，按3%的接種量接種至海水發 酵培養基中，180r · min'SOt：條件下振蕩培養3d後即得發酵液。 (3) 發酵粗產物的分離：將（2)製得的發酵液在4°C條件下，以SOOOrpm離心20min，去 除菌體，取上清液在旋轉蒸發儀上濃縮至原來體積的1/3後，加入濃鹽酸並調節發酵液pH 至2. 0左右，酸沉過濾後，再在旋轉蒸發儀上旋轉濃縮，直至濃稠狀粗產物的出現，即得粗 產物鼠李糖脂。 (4) 進一步地，所述過程⑴和⑵中的培養基成分：高鹽種子培養基（g/L):蛋白腖 10,牛肉膏5, NaC130, pH7. 4。海水發酵培養基：中速濾紙過濾後的天然海水1000ml，加酵 母粉lg，炸貨油3% (V/V)即成，自然pH值。
[0009] 此發明與已有技術相比，具有明顯的有益效果，從上述技術方案可知：所分離的海 水發酵型菌株銅綠假單胞菌Z-2具有很好的耐海水鹽度的特徵，能利用天然海水作為發酵 用水和廢棄食用油脂為單一碳源發酵生產生物表面活性劑鼠李糖脂，且同等鹽度和培養條 件下，海水發酵在產量上於合成培養基發酵基本相當，部分海水發酵產量較合成培養基發 酵可高出35%，因此在生產成本和產量上，海水發酵型菌種已基本克服產量低和過分依賴 淡水資源發酵的缺陷。此外本發明的發酵粗產物鼠李糖脂可作為化學表面活性劑的新型替 代品，用於石油開採、環境治理、土壤修復等對於發酵產品純度要求不高的行業。當然通過 進一步的產物純化，其在化妝品工業、製藥行業和食品等方面也是具有潛在的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1是本發明菌株Z-2海水發酵利用廢棄食用油脂並出現乳化的效果圖。
[0011] 圖2是本發明菌株z-2的在高鹽肉湯培養基中的生長曲線。
[0012] 圖3為本發明菌株Z-2的系統發育樹。
[0013] 圖4為本發明菌株z-2在不同發酵培養基發酵產物性質和產量的對比圖。

【具體實施方式】
[0014] 下面通過具體的實施方案對本發明做進一步說明。
[0015] 實施例1 :新型產生物表面活性劑海水發酵型菌株的篩選分離步驟
[0016] ⑴採樣 主要採集以下樣品：土樣或泥樣採自沿海灘涂。水樣採自港口附近的近海海水。採集 後立刻帶回保存於4°C中。
[0017] ⑵富集培養 在加有海水發酵培養基的搖瓶中加入土樣或泥樣，30°c振蕩培養3d後再轉接於新的 海水發酵培養基，共富集培養3次，致使能利用廢棄食用油脂做唯一碳源的微生物得到富 集。
[0018] ⑶初篩 取（2)中的富集液在高鹽血平板劃線或稀釋塗布培養，挑取透明圈較大且清晰的單菌 落接斜面30°C培養l-2d後4°C保存備用。
[0019] ⑷復篩 取（3)中各菌株的斜面，接高鹽種子培養基，過夜活化後，按3%的量接入合成培養基 中，180r · min'SOt：條件下振蕩培養3d後，取發酵液進行排油圈和表面張力測定。
[0020] (5)海水搖瓶發酵驗證 從（4)中選擇復篩發酵較好的搖瓶，取1. 5mL發酵液（含菌種）至50mL海水發酵培養 基中，180r · η?η'βΟ?條件下振蕩培養3d後，取發酵液進行排油圈、表面張力的測定。 測定表面張力採用表面張力儀，排油圈測定大小的方法是：在90mm培養皿小蓋中，力口 入20mL去離子水，滴加100uL柴油形成油膜，再在油膜中心加入10uL的發酵液。如果排油 圈直徑超過培養皿小蓋的直徑，則將發酵液稀釋10倍後再加入。取排油圈較大且表面張力 明顯降低的菌株保藏，標號為Z-2。
[0021] 進一步地，步驟（2)、（3)和（4)中所述培養基成分如下： 高鹽種子培養基（g/L):蛋白腖10,牛肉膏5，NaC130，pH7.4。 海水發酵培養基（SM):中速濾紙過濾後的海水1000ml，加酵母粉lg，炸貨油3% (V/V) 即成，pH為自然狀態。 合成培養基（CM，g/L) :NaN032. 5，K2HP044，KH2P044，MgS0 40. 2，CaCl20. 02，KCll，NaC130， 酵母粉1，炸貨油3% (V/V)，pH調至6. 5左右。 高鹽血平板採用肉腖培養基中加入5%的脫纖維羊血製得。高鹽肉腖培養基成份為 (g/L):蛋白腖10,牛肉膏3,氯化鈉30,日本瓊脂15,去離子水lOOOmL，pH調至7. 4左右。 配製血平板時，將肉腖培養基滅菌取出冷卻至50°C左右後，加入5%的脫纖維無菌羊血混 勻後迅速傾倒培養皿，冷卻後即得血平板。
[0022] 實施例2 :海水發酵型菌株Z-2的鑑定 對海水發酵型菌株Z-2進行了生理生化鑑定以及16S rDNA分子鑑定，並結合細菌的形 態特徵及生理生化特徵確定該海水發酵型菌株的種屬。
[0023] (1)海水發酵型菌株Z-2細胞形態，生理生化特徵 根據《常見細菌系統鑑定手冊》，進行包括形態鏡檢、產生芽孢、革蘭氏染色，膿青素、 產生吲哚、還原硝酸鹽、葡萄糖氧化發酵、過氧化氫酶、明膠液化、澱粉水解、檸檬酸鹽、甲基 紅、乙醯甲基甲醇（V-P)、丙二酸鹽等各項實驗。測定結果如下表1 : 表1海水發酵型菌株Z-2的細胞形態和生理生化特徵

【權利要求】
1. 一種新型的產生物表面活性劑海水發酵型菌株，其特徵在於，所述菌株為銅綠假單 胞菌菌株Z_2(Pseudomonas aeruginosa Z-2)，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC No. 9091。
2. -種利用如權利要求1所述銅綠假單胞菌產生物表面活性劑，其特徵是：在海水中 添加少量酵母粉和以炸貨油為唯一碳源進行發酵產生物表面活性劑，海水發酵培養基成份 為：酵母粉1. 〇g，炸貨油30mL，中速濾紙過濾後的天然海水1000mL，pH值自然狀態，121°C滅 囷後備用。
3. 根據權利要求2所述的銅綠假單胞菌Z-2具有很好的耐鹽性，其特徵在於：在鹽度 為30-35%。的天然海水中可正常發酵。
【文檔編號】C12N1/20GK104087525SQ201410211268
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年5月16日 優先權日:2014年5月16日
【發明者】張祥勝, 張飛, 苗麗平, 周衝 申請人:鹽城師範學院