一種治療男性禿髮藥物的製備方法及其在臨床中的應用的製作方法
2023-06-17 16:08:21
專利名稱：一種治療男性禿髮藥物的製備方法及其在臨床中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物的製備方法，特別是涉及一種治療男性禿髮藥物的製備方法及其在臨床中的應用。
背景技術：
男性禿髮是中老年男性臨床常見的一種疾病，目前還沒有一種有效治療方法。由於生活節奏的加快，男性禿髮還有進一步升高的趨勢。
一般認為，人毛乳頭細胞(dermal papilla cells，DPC)在毛囊的發育及周期性生長調控中起重要作用。要闡明人毛乳頭細胞對調節毛囊生長和發育的機制，必須從人毛乳頭細胞自身分泌的生物活性成份著手，這也是今後毛囊研究的重要內容之一。我們在建立人毛乳頭細胞體外培養模型基礎上，應用低傳代人毛乳頭細胞的培養上清製成條件培養基，觀察其對不同傳代的人毛乳頭細胞生長狀態的影響，發現人毛乳頭細胞條件培養液(dermal papilla cellconditional medium DPCCM)能將非凝集生長的人毛乳頭細胞有效誘導為凝集性生長狀態，並促進細胞增殖。為進一步分析人毛乳頭細胞生長活性蛋白的體內生物學活性，我們將人毛乳頭細胞條件培養液製成凍乾粉，初步應用於男性禿髮患者，發現其有改善男性禿髮的治療效果。
鑑於上述，本發明的目的在於提供一種治療男性禿髮藥物的製備方法。本發明的另一目的在於男性禿髮藥物在臨床中的應用。
本發明藥物的製備方法及其臨床應用是通過以下步驟來實現的(1).試劑和材料低糖培養基(DMEM)購自Sigma公司。Hepes購自BoehringerMannheim公司。健康人AB型血清第三軍醫大學西南醫院輸血科提供。
(2).藥物製備的方法2.1基礎培養基的製備2.1.1人AB型血清的製備a)採集健康獻血員(經查排除HIV、HBV、HCV、梅毒螺旋體感染)全血200ml入無抗凝劑的血袋；
b)將全血血袋37℃水箱中放置1小時；c)2000rpm離心30分鐘；d)用血清分離器分離人AB型血清，所分離的人AB型血清可放入-20℃冷凍箱備用，也可直接行下例步驟h)；e)將人AB型血清袋從-20℃冷凍箱中取出，放入4℃冷藏箱中12小時；f)將人AB型血清室溫放置2小時；g)將人AB型血清在37℃水箱中放置1小時；h)將人AB型血清在56℃水箱中放置1小時去除補體，其上下溫差應小於0.5℃；i)在超淨臺上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分鐘，空幹；j)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，將血清倒入已消毒好的100ml瓶中；k)用吸管分裝為15ml/瓶，-20℃凍存備用。
上述人AB型血清製備的步驟也可為l)採集健康獻血員全血200ml入無抗凝劑的血袋；m)將全血血袋37℃水箱中放置1小時；n)2000rpm離心30分鐘；o)用血清分離器分離人AB型血清，所分離的AB型血清可放入-20℃冷凍箱備用；p)將人AB型血清袋從-20℃冷凍箱中取出，放入4℃冷藏箱中12小時；q)將人AB型血清室溫放置2小時；r)將人AB型血清在37℃水箱中放置1小時；s)將人AB型血清在56℃水箱中放置1小時去除補體，其上下溫差應小於0.5℃；t)在超淨臺上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分鐘，空幹；u)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，將血清倒入已消毒好的100ml瓶中；v)用吸管分裝為15ml/瓶，-20℃凍存備用。
2.1.2基礎培養基的製備將15ml人AB型血清與85ml低糖培養基(DMEM)，0.24gHepes，0.2g碳酸氫鈉，0.03g L-穀氨醯胺混勻後，用0.22微米孔徑的微孔濾膜過濾除菌，直接使用或-20℃凍存備用。
2.2人毛乳頭細胞條件培養液的收集(1)取意外死亡的正常健康青年(經查排除HI、HBV、HCV、梅毒螺旋體感染)枕後一手掌大小頭皮，用二步酶法分離人毛乳頭細胞(參見鍾白玉，楊希川，楊衛兵，等。二步酶消化法分離人頭皮毛乳頭細胞[J]。中華皮膚科雜誌，2003；36(7)406。)；(2)培養時在50ml培養瓶中加入5ml基礎培養基，100ml培養瓶中加入7ml基礎培養基，3天換一次基礎培養基；(3)開啟超淨臺並用紫外線消毒30分鐘，操作時著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒雙手後在超淨臺上將低傳代毛乳頭細胞培養上清從培養瓶中無菌倒入50ml無菌離心管中，用旋絲口蓋蓋上離心管並擰緊，在IK16型離心機(美國SIGMA公司)中3000rpm離心10分鐘；(4)在超淨臺上打開離心管，用無菌吸管吸出離心管中的上清(小心不能攪起底部的沉澱)，移入無菌玻璃容器中，加無菌橡皮塞後，作好標記，-20℃凍存備用。
2.3人毛乳頭細胞條件培養液凍乾粉的製備(1)凍幹室紫外線消毒4小時；(2)操作時著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒雙手後在超淨臺上用無菌吸管將人毛乳頭細胞條件培養液分為3ml/凍幹瓶，蓋上瓶塞且留出凍幹孔；(3)將凍幹瓶放入凍幹機中；(4)凍幹過程I -40℃ 4小時II -20℃ 3小時 (開始抽真空至結束)III-5℃ 10小時IV 5℃ 4小時V 15℃ 3小時VI 25℃ 5小時(5)在真空環境下，真空封包凍幹瓶；(6)打開凍幹機凍幹室門，取出凍幹瓶，加瓶蓋並加壓封包瓶塞；(7)貼上標籤，註明標識和日期，4℃保存備用。
治療男性禿髮藥物的理化特性為顏色白色；
形態粉末狀；pH值7.35；溶解度每瓶用3ml生理鹽水在3秒鐘內可完全溶解，溶解後液體為橙紅色。
本發明的優點和產生的有益效果是人毛乳頭細胞為分泌性細胞，在體外培養時可分泌許多蛋白質，這些蛋白質可促進毛囊的生長和發育，在體外實驗我們已證明其有確切的生物學活性，但其應用於臨床還未見報導，我們在原有的培養人毛乳頭細胞的基礎上，改進其培養基，用人AB型血清替代小牛血清，成功地培養出人毛乳頭細胞，我們收集培養過低傳代人毛乳頭細胞的基礎培養基，用於臨床治療男性禿髮，觀察其治療效果，發現有確切的治療作用，取得了良好的經濟效益和社會效益。
應用本發明製備的藥物在治療男性禿髮中有明顯的療效，本藥物所用細胞和培養血清均對人體均無抗原性，用於人體無任何過敏反應，本發明用含人AB型血清的基礎培養基培養人毛乳頭細胞，較以前用小牛血清培養人毛乳頭細胞在技術上取得了突破，為本藥物應用於臨床奠定了基礎，這也是本發明關鍵技術的核心所在。此外，本發明所用藥物為皮下注射，其有效藥物利用度大大提高，其製備工藝十分考究，實用性強，能為廣大患者服務。
圖1為本發明男性禿髮治療前示意2為本發明男性禿髮治療後示意圖具體實施方式
使用前依照上述藥物製備的方法進行藥物的配製每瓶凍乾粉用3ml生理鹽水溶解(恢復凍幹前原始濃度)。
(1)、藥物的生物安全性實施例1.1小鼠急性毒性試驗我們選用7～9周齡、體重為18～22g的昆明種小鼠。按預試驗公比0.8設立50.0ml/kg、40.0ml/kg、32.0ml/kg、25.6ml/kg、20.5ml/kg等5個劑量組，每組10隻小鼠，雌雄各半。單次腹腔注射，藥後立即觀察、記錄動物的中毒反應、死亡情況及時間，連續觀察14天。
1.2家兔熱原試驗選3隻體重為1.8～2.4kg的日本大耳白家兔。按10ml/kg耳靜脈注射給藥。測量家兔肛門體溫，深度為6釐米，以後每隔1小時測量體溫1次，共3次。
1.3細菌培養隨機抽取5支凍幹瓶，無菌生理鹽水溶解，4道劃線法接種於普通血平板上，培養48小時後觀察結果。
1.4真菌培養隨機抽取5支凍幹瓶，無菌生理鹽水溶解，接種於沙堡氏培養基上，培養10日後觀察結果。
1.5結果小鼠急性毒性試驗顯示在腹腔注射不同劑量人毛乳頭細胞條件培養液樣品溶液後，各組動物未發現明顯的中毒症狀，在整個試驗期限內無動物死亡或其它異常徵象。家兔熱原試驗顯示在耳靜脈注射人毛乳頭細胞條件培養液樣品溶液後，各動物的體溫變化均符合熱原試驗的要求。細菌和真菌培養均未見細菌和真菌生長。
(2)、藥物的臨床應用(1)治療男性禿髮藥物的理化特性為顏色白色；形態粉末狀；pH值7.35；使用前依照上述藥物製備的方法進行藥物的配製每瓶凍乾粉用3ml生理鹽水溶解(恢復凍幹前原始濃度)。藥物溶解度每瓶用3ml生理鹽水在3秒鐘內可完全溶解，溶解後液體為橙紅色。
(2)治療方案選擇50例年齡在40～68歲的男性禿髮患者為試驗對象，常規消毒患部皮膚後皮下多點注射，每周1次，每個患部(直徑小於5釐米)每次最多3ml，共4次，治療完成後觀察6個月。
人毛乳頭細胞條件培養液在通過生物安全鑑定後，我們在患者知情同意的情況下應用於患部。50例人毛乳頭細胞條件培養液治療的男性禿髮患者中，除6例無效外其餘均有一定療效。
權利要求
1.一種治療男性禿髮藥物的製備方法，其特徵在於用含人AB型血清的基礎培養基培養低傳代人毛乳頭細胞，收集低傳代人毛乳頭細胞培養上清，將所收集上清液製備成凍乾粉；(1)上述人AB型血清製備的步驟為a)採集健康獻血員全血200ml入無抗凝劑的血袋；b)將全血血袋37℃水箱中放置1小時；c)2000rpm離心30分鐘；d)用血清分離器分離人AB型血清；e)將人AB型血清在56℃水箱中放置1小時去除補體，注意其上下溫差應小於0.5℃；f)在超淨臺上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分鐘，空幹；g)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，將血清倒入已消毒好的100ml瓶中；h)用吸管分裝為15ml/瓶，-20℃凍存備用；(2)上述的基礎培養基的製備方法基礎培養基將15ml人AB型血清與85ml低糖培養基(DMEM)，0.24gHepes，0.2g碳酸氫鈉，0.03g L-穀氨醯胺混勻後，用0.22微米孔徑的微孔濾膜過濾除菌，直接使用或-20℃凍存備用；(3)人毛乳頭細胞條件培養液的收集過程為a)取意外死亡的正常健康青年枕後一手掌大小頭皮，用二步酶法分離人毛乳頭；b)培養時在50ml培養瓶中加入5ml基礎培養基，100ml培養瓶中加入7ml基礎培養基，3天換一次基礎培養基；c)開啟超淨臺並用紫外線消毒30分鐘，操作時著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒雙手後在超淨臺上將低傳代人毛乳頭細胞培養上清從培養瓶中無菌倒入50ml無菌離心管中，用旋絲口蓋蓋上離心管並擰緊，在離心機中離心；d)在超淨臺上打開離心管，用無菌吸管吸出離心管中的上清，移入無菌玻璃容器中，加無菌橡皮塞後，作好標記，-20℃凍存備用。(4)人毛乳頭細胞條件培養液的凍幹過程為a)凍幹室紫外線消毒4小時；b)操作時著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒雙手後在超淨臺上用無菌吸管將藥物分為3ml/凍幹瓶，蓋上瓶塞且留出凍幹孔；c)將凍幹瓶放入凍幹機中；d)連續凍幹過程I -40℃4小時II-20℃3小時III -5℃ 10小時IV5℃ 4小時V 15℃ 3小時VI25℃ 5小時e)在真空環境下，真空封包凍幹瓶；f)打開凍幹機凍幹室門，取出凍幹瓶，加瓶蓋並加壓封包瓶塞；g)貼上標籤，註明標識和日期，4℃保存備用。
2.根據權利要求1所述的一種治療男性禿髮藥物的製備方法，上述人AB型血清製備的步驟也可為a)採集健康獻血員全血200ml入無抗凝劑的血袋；b)將全血血袋37℃水箱中放置1小時；c)2000rpm離心30分鐘；d)用血清分離器分離人AB型血清，所分離的AB型血清可放入-20℃冷凍箱備用；e)將人AB型血清袋從-20℃冷凍箱中取出，放入4℃冷藏箱中12小時；f)將人AB型血清室溫放置2小時；g)將人AB型血清在37℃水箱中放置1小時；h)將人AB型血清在56℃水箱中放置1小時去除補體，其上下溫差應小於0.5℃；i)在超淨臺上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分鐘，空幹；j)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，將血清倒入已消毒好的100ml瓶中；k)用吸管分裝為15ml/瓶，-20℃凍存備用。
3.一種治療男性禿髮藥物在臨床中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種藥物的製備方法，特別是涉及一種治療男性禿髮藥物的製備方法。藥物的前體為含15％人AB型血清的基礎培養基，該基礎培養基按15ml人AB型血清、85ml低糖培養基(DMEM)、0.24gHepes、0.2g碳酸氫鈉、0.03gL－穀氨醯胺配比構成。用基礎培養基培養低傳代人毛乳頭細胞，收集低傳代人毛乳頭細胞培養上清為人毛乳頭細胞條件培養液，將所收集的人毛乳頭細胞條件培養液製備成凍乾粉。本發明所製備的藥物在治療男性禿髮中有明顯的療效，本藥物所用細胞和培養血清對人體均無抗原性，用於人體無任何過敏反應。此外，本發明所用藥物為皮下注射，其有效藥物利用度大大提高，其製備工藝十分考究，實用性強，能為廣大患者服務。
文檔編號A61K9/19GK1879883SQ200610042780
公開日2006年12月20日 申請日期2006年4月30日 優先權日2006年4月30日
發明者羅洋 申請人:羅洋