一類檢測甲醛的螢光探針及其製備和應用的製作方法
2023-06-17 23:42:22 1
本發明屬環境分析化學及生物檢測領域,涉及一類檢測甲醛的螢光探針、其製備方法及在檢測環境中及生物樣本中甲醛含量中的應用。
背景技術:
甲醛是一種無色氣體,有特殊的刺激氣味,對人眼、鼻等有刺激作用。環境中高濃度的甲醛對人體有致敏、致畸和致癌等毒性,甲醛因而在2006年被確定為1類致癌物。因此,檢測環境中,尤其是家具、新裝修空間、新衣物材料、甚至食品中的甲醛含量是一項重要且有實際意義的工作。
環境中高濃度甲醛的毒性作用在國內外已被深入研究。然而與之相反的是,近年來人們發現人體幾乎所有細胞中均存在內源性甲醛!以大腦組織為例,研究發現,大腦組織中的生理內源性甲醛處於較高水平,其中皮層組織中甲醛濃度為0.2mmol/L左右,海馬組織為0.4mmol/L左右,提示其可能參與到大腦正常的生理活動中;而大腦細胞中內源性甲醛的異常聚集可在醛酮應激、氧化應激等各種誘導因素的作用下,造成神經細胞功能障礙、變性死亡,導致學習、記憶功能障礙。目前,由於缺乏甲醛在生物原位環境中準確、簡便定量分析的檢測方法,甲醛的生理性和病理性作用研究受到極大限制。如何簡便易行地檢測和評估內源性甲醛的濃度水平和組織分布特徵,對於預測和評估相關疾病的進展和程度,有著重要的臨床意義。然而,常規的檢測方法如分光光度法、色譜分析法等在醫學和生命科學領域的應用存在諸多限制,如檢測靈敏度較差,難以實現活細胞或活體組織中甲醛的實時在線檢測等,這使得甲醛在活體生物樣本中的生理及病理作用研究受到限制。因此,開發適用於複雜活體生物樣本的靈敏度高、選擇性好的甲醛快速分析檢測方法對研究內源性甲醛的生理病理作用具有重要的意義。
小分子螢光探針是檢測細胞內分子事件的高效工具之一。小分子螢光探針檢測法具有靈敏度高,選擇性好等優點,兼之小分子探針通常具有良好的生物膜通透性,且可通過調整結構優化其在生物體內的吸收代謝性質,因此更適用於活細胞/活組織中微量代謝分子的檢測。目前僅有少量用於甲醛檢測的螢光探針被報導,而多數存在著檢測反應慢、靈敏性差的問題,且在檢測甲醛的同時會消耗部分甲醛,從而擾動生物樣本中內源性甲醛的濃度。因此,發展高靈敏性、且不會擾動內源性甲醛濃度的新型螢光探針,是目前探針研究領域的前沿和熱點。
技術實現要素:
本發明的一個目的是提供一類檢測甲醛的螢光探針,是一類新型的特異性小分子螢光探針,具有式I、II、III或IV所示的結構:
其中:
R1為氫,C1-C4烷基等;
R2為氫,C1-C4烷基等;
n為自然數1或2。
本發明的又一個目的是提供式I、II、III及IV所示化合物的製備方法,通過以下製備方法實現:
以式I所示化合物為例,7位N-R1,R2取代的香豆素與勞森試劑在乾燥的甲苯中回流反應6小時,冷卻後過濾,濾液旋幹後所得的產物溶於乙醇,加入80%水合肼回流反應3小時,反應完畢,經萃取、濃縮、及柱層析純化得式I所示化合物。式II、III及IV所示化合物採用類似的合成方法,以苯環對應取代的香豆素為起始原料製得。
其中R1、R2和n的定義同上述。
本發明的再一個目的是提供式I、II、III及IV所示化合物在製備檢測環境中甲醛含量的檢測劑中的應用。可通過以下步驟實現:(1)首先製備式I、II、III或IV所示化合物的水溶液;(2)上述溶液分若干份,分別置於密閉環境中,並在環境中充入已知不同量的甲醛,10小時後測其螢光強度;(3)以螢光強度對甲醛濃度作圖,得工作曲線;(4)將第一步中製備的化合物溶液置於待檢測環境中過夜,測其螢光強度;(5)利用第三步得到的工作曲線及第四步所測得的螢光強度,計算環境中的甲醛含量。
本發明的又一個目的是提供式I、II、III及IV所示化合物在製備檢測生物樣本中甲醛含量的檢測劑中的應用。本發明以活細胞中的應用為例,可通過以下步驟實現:細胞培養基中加入式I、II、III或IV所示化合物,使其終濃度為5μM,37℃下孵育30分鐘,觀察記錄細胞螢光強度,本發明提供的螢光探針的特徵在於它本身在生理環境中只有微弱的螢光,但可與甲醛特異性快速反應,生成具有強螢光的產物,且螢光強度與甲醛濃度間存在線性相關,從而實現對甲醛的特異性檢測和定量分析。
本發明涉及的螢光探針具有以下有益效果:(1)穩定性好,能夠長期保存使用;(2)由於探針本身無螢光,只有在與甲醛反應後才有螢光,因此,檢測信噪比高,靈敏度好;(3)具有優秀的選擇性,能在複雜生物樣品中特異性地檢測甲醛;(4)具有良好的生物膜通透性,因而能用於活細胞中甲醛的檢測;(5)檢測反應快速,對水溶液中的甲醛,1分鐘內可給出檢測結果;(6)檢測甲醛的同時不會影響環境中甲醛濃度。
附圖說明
圖1是螢光探針分子I-1與甲醛反應前後的螢光變化。
圖2是螢光探針分子I-1對甲醛的選擇性。
圖3是螢光探針分子I-1對甲醛濃度依賴性螢光增強。
圖4是螢光探針分子I-1檢測新櫥櫃中甲醛含量。
圖5是螢光探針分子I-1檢測人大腦微血管內皮細胞中的內源性甲醛。
圖6是螢光探針分子I-1檢測老年痴呆模型APP小鼠腦片活組織海馬區域的內源性甲醛。
圖7是螢光探針分子I-1檢測老年痴呆模型APP小鼠腦片活組織海馬區域的內源性甲醛。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明做進一步說明,以下的實施例不限制本發明的範圍。
實施例1:螢光探針分子I-1的製備
7-二乙基氨基香豆素(500毫克)和勞森試劑(1.86克)在乾燥的甲苯中回流反應6小時。反應後,冷卻過濾,濾液旋幹溶劑後溶於乙醇,加入80%水合肼,回流反應3小時。反應完畢,旋幹溶劑,加入水,以二氯甲醛萃取三次,合併有機相,無水硫酸鈉乾燥,柱層析純化,得I-1(產率65%)。LC-MS:m/z232.3010[M+H]+。
實施例2:螢光探針分子II-1的製備
7-甲氧基香豆素(500毫克)和勞森試劑(1.86克)在乾燥的甲苯中回流反應6小時。反應後,冷卻過濾,濾液旋幹溶劑後溶於乙醇,加入80%水合肼,回流反應3小時。反應完畢,旋幹溶劑,加入水,以二氯甲醛萃取三次,合併有機相,無水硫酸鈉乾燥,柱層析純化,得II-1(產率70%)。LC-MS:m/z191.2066[M+H]+。
實施例3:螢光探針分子I-1與甲醛反應前後的螢光變化
將探針分子以少量DMSO溶解,分別加入PBS緩衝液或甲醛的PBS溶液,使探針分子的終濃度為10μM,甲醛終濃度為500μM。反應10min後使用螢光分光光計以450nm激發,記錄溶液在最大發射波長(約500nm)下的螢光強度,進而確定探針分子與甲醛反應後螢光強度增強,如圖1所示。
實施例4:螢光探針分子II-1與甲醛反應前後的螢光變化
將探針分子以少量DMSO溶解,分別加入PBS緩衝液或甲醛的PBS溶液,使探針分子的終濃度為10μM,甲醛終濃度為500μM。反應10min後使用螢光分光光計以450nm激發,記錄溶液在最大發射波長(約500nm)下的螢光強度,進而確定探針分子與甲醛反應後螢光強度增強,如圖2所示。
實施例5:螢光探針分子I-1對甲醛的選擇性
將探針分子以少量DMSO溶解,再加入PBS緩衝液配置成溶液,分別加入PBS緩衝液溶解的各類可能干擾甲醛分析的待測樣品,使探針分子的終濃度為10μM,各待測樣品終濃度為300μM。反應30min後使用螢光分光光計以450nm激發,記錄溶液在最大發射波長(約500nm)下的螢光強度,進而確定探針分子對甲醛的選擇性,如圖3所示。
實施例6:螢光探針分子I-1對甲醛濃度依賴性螢光增強
將探針分子以少量DMSO溶解,再加入PBS緩衝液配置成溶液,分別加入不同濃度的甲醛溶液,使探針分子的終濃度為10μM,反應10min後使用螢光分光光計以450nm激發,記錄溶液在最大發射波長(約500nm)下的螢光強度,進而確定探針分子對甲醛濃度依賴性螢光增強,如圖4所示。
實施例7:螢光探針分子I-1檢測新櫥櫃中甲醛含量
96孔培養板中加入濃度為10μM的探針溶液,避光,開蓋分別放置於通風環境和新櫥櫃中。使用多功能酶標儀以450nm激發,在5min,10min,15min,30min,60min,120min,180min和240min檢測探針溶液在最大發射波長(約500nm)下的螢光強度。結果如圖5所示,探針溶液放置於新櫥櫃中5min時,螢光強度顯著上升,此後隨時間延長不斷上升。而放置於通風環境中的對照組在相同時間點的螢光強度均無明顯提高。這提示,螢光探針分子I-1能快速靈敏地檢測出空氣環境中的甲醛。
實施例8:螢光探針分子I-1檢測人大腦微血管內皮細胞中的內源性甲醛
大腦微血管內皮細胞接種於載玻片上,CO2細胞培養箱中培養至80%左右融合率。實驗分為三組,內源性甲醛清除對照組用200μM NaHSO3預孵育30min;甲醛檢測實驗組單加10μM的小分子探針孵育15min;內源性甲醛清除後檢測組先用200μM NaHSO3預孵育30min,再加入10μM探針預孵育15min。進行上述處理後,雷射共聚焦顯微鏡觀察細胞螢光強度變化。結果如圖6所示,NaHSO3對照組無螢光,探針組顯示出較強的螢光強度,而NaHSO3預孵育清除內源性甲醛後,細胞內螢光強度顯著降低,證明本探針能夠識別活細胞中的內源性甲醛。
實施例9:螢光探針分子I-1檢測老年痴呆模型APP小鼠腦片活組織海馬區域的內源性甲醛
C57BL/6小鼠或老年痴呆模型APP轉基因小鼠快速斷頭處死,取出大腦並放入4℃人工腦脊液1中。人工腦脊液1成分為(mM):75蔗糖,87NaCl,2.5KCl,15NaH2PO4,7MgCl2,0.5CaCl2,25NaHCO3和25葡萄糖。振動切片機平臺中灌入合適4℃人工腦脊液1,將大腦放置於切片機平臺,切取含有大腦海馬區域的300μm厚度的冠狀縫切面腦片,轉移至通入95%O2和5%CO2的4℃人工腦脊液2中30min備用。人工腦脊液2成分為(mM):124NaCl,3KCl,1.25NaH2PO4,1.0MgSO4,2CaCl2和26NaHCO3。所得腦片分為三組,第一組為20μM探針中孵育30min的C57BL/6小鼠腦片,第二組為20μM探針中孵育30min的APP轉基因小鼠腦片,第三組為APP轉基因小鼠腦片先在200μM NaHSO3孵育30min,PBS清洗腦片後,再加入20μM探針預孵育30min。進行上述處理後腦片用PBS清洗3次,雷射共聚焦顯微鏡觀察腦片螢光強度。結果顯示,在大腦海馬和皮層區域,C57BL/6小鼠腦片的螢光強度均處於較低水平,APP轉基因小鼠腦片的螢光強度顯著高於C57BL/6小鼠腦片,加入200μM NaHSO3可使APP轉基因小鼠腦片螢光強度顯著降低。這提示本小分子螢光探針能夠可視化檢測出老年痴呆病理模型的活組織腦片中內源性甲醛的水平顯著高於正常小鼠,且通過甲醛清除劑的幹預可降低內源性甲醛水平。本結果為探針的進一步用於病理模型中內源性甲醛的可視化檢測奠定了實驗基礎(圖7)。