抗梅毒螺旋體抗體測定試劑的製作方法
2023-06-05 21:10:41
專利名稱：抗梅毒螺旋體抗體測定試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及靈敏度和特異性高的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑以及使用該抗梅毒螺旋體抗體測定試劑的測定方法。
背景技術：
梅毒是由梅毒螺旋體菌(梅毒螺旋體，Treponema Pallidum)的感染引起的疾病。由於開發出了青黴素等有效的治療藥，梅毒的患病率在1940年以後減少，但近年來再次顯示增加的趨勢。作為近年來的梅毒新患病患者的特徵，可舉出大多並發HIV感染病這一點。作為高並發率的原因，認為梅毒、HIV均為性感染病，並且梅毒提高HIV感染風險。在這樣的狀況下，為了防止擴大梅毒和HIV的感染，要求早期發現並治療梅毒患者。是否患有梅毒是通過在免疫學上檢查血液中是否存在抗梅毒螺旋體抗體來進行·診斷的。在梅毒螺旋體菌體的菌體表面存在大量的表面抗原，通過利用該表面抗原與樣品中的抗梅毒螺旋體抗體的抗原抗體反應而進行免疫測定。作為在梅毒螺旋體菌體的菌體表面存在的表面抗原中的主要抗原，已知有分子量為47kDa、42kDa、37kDa、17kDa和15kDa的抗原。現在，作為用於梅毒診斷的梅毒螺旋體菌體的表面抗原，利用如下得到的抗原在家兔睪丸中培養梅毒螺旋體菌，用表面活性劑等進行增溶溶解、提取，進而用各種方法進行不溶物除去、必要成分的純化。這樣製備的來自梅毒螺旋體菌的抗原由於與抗梅毒螺旋體抗體的特異性高，能夠早期發現梅毒患者。但是，在如上所述的使用了家兔的抗原製造方法中，由於將家兔睪丸作為宿主，所以產量受到限制，而且梅毒螺旋體菌的增殖狀態存在家兔個體差異，難以確保大量穩定的產量。應予說明，目前，直接人工培養梅毒螺旋體菌未獲得成功。近年來，提出了利用了基因重組技術的梅毒螺旋體菌的菌體表面抗原的製造方法。對於梅毒47kDa抗原，克隆了編碼的基因，確定了由415個胺基酸構成的胺基酸序列(例如，非專利文獻I、非專利文獻3)。另外，關於其晶體結構、生物學作用也進行了報告，已知A、B、C和D這4個結構域結構(例如,非專利文獻2、非專利文獻3)。根據非專利文獻3，從胺基酸序列的N末端開始數，結構域A由第I 34個(Al結構域)和第157 207個(A2結構域)構成，結構域B由第35 156個構成，結構域C由第208 335個構成，結構域D由第336 415個構成(參照非專利文獻3、圖I)。進而，關於上述47kDa抗原的抗體識別部位，還報告了顯示抗原活性的胺基酸序列(例如，非專利文獻4)。作為使用了上述抗原的抗梅毒螺旋體抗體測定方法，公開了利用基因重組技術製作梅毒47kDa抗原並利用該梅毒47kDa抗原在免疫學上測定抗梅毒螺旋體抗體的方法(參照專利文獻I)。另外，還公開了使用在15kDa和17kDa的抗原的N末端融合有穀胱甘肽-S-轉移酶的蛋白質的方法(參照專利文獻2)。另一方面，除了利用基因重組技術的抗原製作以外，關於47kDa抗原，還公開了通過合成具有抗原活性的肽並將其用作抗原而測定抗梅毒螺旋體抗體的方法(參照專利文獻3)。專利文獻專利文獻I :國際公開W01988/02403號小冊子專利文獻2 :日本特開平7-287017號公報專利文獻3 :日本特開2001-264334號公報非專利文獻非專利文獻I :Infection and Immunity, Vol. 60 (4), ρ· 1568-1576, (1992) 非專利文獻2 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 277 (44)，p.41857-41864，(2002)非專利文獻3 :NCBI (National Center for Biotechnologylnformation), MMDBID :21051非專利文獻4 :Journal of immunology, Vol. 157, p. 720-731, (1996)
發明內容
雖然用由這樣的方法製備的梅毒螺旋體的重組抗原以及合成肽抗原也能夠進行抗梅毒螺旋體抗體的測定，但是利用基因重組技術製作的梅毒螺旋體的重組抗原存在靈敏度、特異性低的問題。另外，關於合成肽抗原，除了同樣的問題以外，還存在如下問題要精度良好地測定抗梅毒螺旋體抗體，就需要組合多種肽，在操作上繁雜。作為產生這些問題的因素，雖然詳細情況還不明確，但可以考慮以下原因。S卩，認為利用基因重組技術製作的梅毒螺旋體的重組抗原與來自梅毒螺旋體菌的天然抗原相比，其立體結構以及脂質的修飾等存在不同。一般地，蛋白質在進行翻譯後受到各種修飾。糖或者脂質的修飾等是它們中的代表性修飾，蛋白質通過受到這樣的修飾而使其立體結構發生變化。另一方面，在基因重組技術中主要使用的利用大腸桿菌的表達體系中，不進行蛋白質的翻譯後的修飾。蛋白質的立體結構在顯示其抗原性上是重要的因素，但是利用基因重組技術製作的重組蛋白質由於不受到翻譯後的修飾，所以與天然抗原相比，在立體結構上產生不同，考慮這對靈敏度、特異性帶來影響的可能性。本發明鑑於上述內容，目的在於提供高靈敏度且高特異性地測定抗梅毒螺旋體抗體的使用了多肽抗原的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑以及使用該抗梅毒螺旋體抗體測定試劑的測定方法。因此，本發明的發明人著眼於屬於梅毒螺旋體菌體表面抗原的分子量47kDa抗原，利用基因重組技術製作該47kDa抗原及其一部分的多肽，並研究了使用其的抗梅毒螺旋體抗體試劑系中的靈敏度和特異性，結果發現儘管由結構域C構成的重組多肽、以及由結構域D構成的重組多肽的各自單獨幾乎不反應，但對於由結構域C和D構成的重組多肽，由結構域A2、C和D構成的重組多肽，由結構域B、A2、C和D構成的重組多肽而言，與重組47kDa抗原相比，靈敏度顯著提高，其靈敏度能夠匹敵天然抗原，從而完成了本發明。即，本發明如下。(I) 一種抗梅毒螺旋體抗體測定試劑，其特徵在於，在利用了抗原抗體反應的、用於測定抗梅毒螺旋體抗體的試劑中，將至少包含梅毒螺旋體47kDa抗原中的結構域C和D而不包含梅毒螺旋體47kDa抗原中的結構域Al的重組多肽用作抗原。(2)根據(I)所述的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑，其中，抗原為由梅毒螺旋體47kDa抗原中的結構域C和D，結構域A2、C和D，或者結構域B、A2、C和D構成的重組多肽。(3)根據(I)所述的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑，其中，抗原被固定於不溶性載體。(4)根據(2)所述的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑，其中，抗原被固定於不溶性載體。
(5) 一種抗梅毒螺旋體抗體測定試劑，其中，(3)所述的不溶性載體為由高分子聚合物構成的乳膠。(6) 一種抗梅毒螺旋體抗體測定試劑，其中，(4)所述的不溶性載體為由高分子聚合物構成的乳膠。(7) 一種抗梅毒螺旋體抗體測定方法，其特徵在於，使用(I)所述的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑。(8) 一種抗梅毒螺旋體抗體測定方法，其特徵在於，使用(2)所述的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑。(9) 一種抗梅毒螺旋體抗體測定方法，其特徵在於，使用(3)所述的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑。(10)—種抗梅毒螺旋體抗體測定方法，其特徵在於，使用(4)所述的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑。(11)一種抗梅毒螺旋體抗體測定方法，其特徵在於，使用(5)所述的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑。(12)—種抗梅毒螺旋體抗體測定方法，其特徵在於，使用(6)所述的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑。根據本發明，使用能夠大量穩定地獲得品質均一的抗原的重組梅毒螺旋體抗原多肽，能夠高靈敏度且特異性地測定抗梅毒螺旋體抗體，能夠進行更正確的梅毒診斷。
圖I表示遞歸PCR圖像圖。圖2表示表達載體構建的圖像圖。圖3是表示使用了各抗原時的38T. U.下的吸光度變化量的圖。圖4是表示使用了各抗原時的119T. U.下的吸光度變化量的圖。圖5是表示使用了各抗原時的240T. U.下的吸光度變化量的圖。
具體實施例方式本發明的利用了抗原抗體反應的抗梅毒螺旋體抗體的測定試劑的特徵是將至少包含梅毒螺旋體47kDa抗原中的結構域C和D而不包含梅毒螺旋體47kDa抗原中的結構域Al的重組多肽用作抗原。作為用於本發明的重組多肽抗原的具體例，是由屬於梅毒螺旋體菌體表面抗原的47kDa抗原的一部分的結構域C和D，結構域A2、C和D，或者結構域B、A2、C和D構成的重組多肽，優選分子量小且與用來自梅毒螺旋體菌的抗原製作的試劑(Mediace (註冊商標)TPLA，積水醫療公司制)相關性良好的由結構域C和D構成的重組多肽，由結構域A2、C和D構成的重組多肽，進一步優選由結構域C和D構成的重組多肽。作為上述各多肽，含有胺基酸序列中同源性為90%以上的多肽，更優選同源性為95%以上的多肽，進一步優選同源性為98%以上的多肽。作為獲得使作為上述47kDa抗原的一部分的多肽表達的DNA片段的方法，有i)由梅毒菌體通過基因的克隆、或者通過基因合成而得到47kDa抗原基因全長，用適當的限制性內切酶等將編碼不需要的多肽部分的DNA片段刪除後導入表達載體的方法；ii)製作梅毒菌體的cDNA庫，使用適當的DNA引物，利用PCR法等擴增編碼各多肽的DNA片段後，導入表達載體的方法；iii)將編碼各多肽的DNA片段直接合成或者利用PCR法等而合成後導入表達載體的方法等，但不特別限定。關於上述表達載體，也沒有特別限定。例如，可舉出質粒、粘粒、噬菌體、病毒等。
作為表達被納入到表達載體的各多肽抗原的宿主，可以是培養細胞、大腸桿菌等微生物，蠶等，沒有特別限定，但大腸桿菌、培養細胞等是代表性宿主。為了有效率地表達上述各多肽、或者使其表達後的純化容易，也可以使其以與其它蛋白質(以下稱為標記蛋白質)的融合蛋白質的形式表達。作為標記蛋白質，有β _半乳糖苷酶、穀胱甘肽S轉移酶、6 X組氨酸、作為來自蘇雲金桿菌(Bacillus thurinRiensis菌)的殺蟲蛋白質的Cry蛋白質(W02010/013789中記載)等，但沒有特別限定。另外，使其以融合蛋白質的形式表達後，在純化過程中不需要一定除去標記蛋白質，可以直接使用。本發明的免疫學測定試劑沒有用特別限定，例如，能夠使用免疫凝集、酶免疫測定(EIA)、螢光免疫測定(FIA)、免疫層析等，優選用於使上述抗原擔載於不溶性載體的免疫凝集的方法。上述不溶性載體沒有特別限定，例如，可舉出有機高分子粉末、微生物、血球、細胞膜片等。其中，優選有機高分子粉末。作為上述有機高分子粉末，例如，可舉出天然高分子粉末、合成高分子粉末等。作為上述天然高分子粉末，例如，可舉出不溶性瓊脂糖、纖維素、不溶性葡聚糖等。作為上述合成高分子粉末，例如，可舉出聚苯乙烯、苯乙烯-磺酸(鹽)共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、乙酸乙烯酯-丙烯酸酯共聚物等。另外，上述不溶性載體可以使用在表面導入有磺酸基、羧基、氨基等的不溶性載體。作為上述不溶性載體，特別優選使合成高分子粉末均勻地懸浮的乳膠粒子。此外，還可以使用塑料制微量滴定板；動物的紅血球、細菌細胞等生物學粒子；膨潤土、火棉膠、膽固醇結晶、二氧化矽、高嶺土、碳粉等非生物學粒子等。上述乳膠粒子的粒徑沒有特別限定，但在用電子顯微鏡的測定中，優選的下限為
O.05 μ m、優選的上限為I. 5 μ m。若上述乳膠粒子的粒徑小於O. 05 μ m,則有時由凝集所致的光學變化量小，得不到測定所必需的高靈敏度。若上述乳膠粒子的粒徑超過I. 5 μ m，則有時由乳膠粒子的凝集所致的光學變化量超過可測定區域，測定範圍變小。上述乳膠粒子的粒徑的優選的下限為O. I μ m、更優選的上限為O. 8 μ m。作為使上述梅毒螺旋體重組抗原固定於上述不溶性載體的方法，沒有特別限定，可以使用通過物理或化學結合而使之擔載的現有公知的方法。作為物理性吸附的方法，例如，可以通過在一定條件下混合重組抗原與不溶性載體而使之擔載。進而，在上述固定工序後，也可以用白蛋白、酪蛋白、表面活性劑等免疫學非活性物質來被覆不溶性載體，優選使用白蛋白。上述白蛋白沒有特別限定，可使用存在於動物血液中的白蛋白。作為動物種類，可舉出牛、馬、兔子、山羊和人等。在上述被覆工序中，白蛋白的濃度沒有特別限定，優選的下限為O. 01重量％，優選的上限為10重量％。若上述白蛋白的濃度小於O. 01重量％，則不溶性載體表面未被充分被覆，因此發生非特異性凝集，若多於10重量％，則校正曲線靈敏度反而降低，因此更優選O. I 5重量％。作為用非活性物質被覆上述不溶性載體的方法，例如，可通過使重組抗原擔載於不溶性載體後，在一定條件下混合非活性物質而進行被覆。另外，反應時的PH沒有特別限定，優選的下限為2，優選的上限為12。若上述pH小於2、或者高於12，則產生重組抗原發生變性等問題，因此更優選PH4 10。反應時的溫度沒有特別限定，優選的下限為2°C，優選的上限為50°C。就上述溫度而言，若小於2V，則不能充分反應，或者反應體系冷凍，難以得到具有必要靈敏度的載體，若高於50°C，則產生重組抗原發生變性等問題，因此更優選2 10。。。這樣得到的擔載有重組抗原的載體沒有特別限定，但使之懸浮於含有免疫學非活性的物質的緩衝液中。作為免疫學非活性的物質，沒有特別限定，可以使用白蛋白、酪蛋白、表面活性劑(合成高分子化合物)、合成磷脂質、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等，優選白蛋白、合成磷脂質。在擔載於上述不溶性載體的工序、進一步利用非活性物質進行被覆的工序、以及使擔載有抗原的載體懸浮的工序中，所使用的溶劑沒有特別限定，例如，可舉出磷酸緩衝液、Tris鹽酸緩衝液、甘氨酸緩衝液、Good緩衝液等。對這樣得到的擔載有抗原的乳膠粒子懸浮液添加樣品，使之反應一定時間。反應後，以光學測定或目視來確定利用擔載於乳膠粒子的重組抗原與樣品中的抗梅毒螺旋體抗體的抗原抗體反應而產生的凝集的程度，從而能夠測定樣品中的抗梅毒螺旋體抗體量。作為光學測定上述凝集程度的方法，沒有特別限定，可使用公知的方法，例如，可舉出以濁度增加的方式捕獲凝集形成的比濁法、以粒度分布或者平均粒徑變化的方式捕獲凝集形成的方法、用積分球測定由凝集形成所致的前方散射光的變化並比較與透射光強度之比的積分球光度濁度法等。另外，還可以並用這些方法。在上述測定法中，可以利用在不同時刻至少得到2個測定值並基於這些時刻間的測定值的增加速度求出凝集程度的速度試驗(速度分析)，或者在某一時刻(通常為被認為是反應終點的時刻)得到I個測定值並基於該測定值求出凝集程度的終點試驗(終點分析)。從測定的簡便性、迅速性方面考慮，優選進行利用比濁法的速度試驗。進行上述測定時的光波長優選250 lOOOnm，更優選540 800nm。用於上述光學測定方法的裝置可舉出能夠檢測散射光強度、透射光強度、吸光度等的光學裝置，只要是通常使用的生物化學自動分析裝置，就可以使用任意裝置。以目視觀察上述凝集程度的方法通常可以使用在判定板上混合含有樣品和乳膠粒子懸浮液的溶液，搖動混合液後，判定有無凝集的方法等。應予說明，對於凝集程度的觀察，除了利用目視的方法以外，還可以使用用攝像機等拍攝凝集狀態並實施圖像處理的方法。
作為上述樣品，只要是有存在抗螺旋體抗體的可能性的樣品，就沒有特別限定，例如,可舉出人或者動物的血液、血漿、血清等。作為進行上述抗原抗體反應時的反應體系的反應液，只要是滿足能夠引起抗原抗體反應的生理條件的水溶液，就沒有特別限定，例如，可舉出磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、甘氨酸緩衝液、Tris緩衝液、Good緩衝液等。反應液的pH優選4 10,更優選6 8。在上述反應液中可以進一步根據需要添加牛血清白蛋白、蔗糖等穩定劑，疊氮化鈉等防腐劑，氯化鈉等鹽濃度調節劑等。反應溫度只要是能夠引起上述免疫反應的溫度就沒有特別限定，優選以恆溫在10 50°C的範圍內進行，更優選30 40°C。反應時間可適當決定。實施例
用比較例和實施例說明本發明，但本發明不限於此。(用於製備TpN47基因的引物)將為了製備TpN47基因而使用的引物(用DNA合成裝置合成)示於表I。應予說明，在表I所示的鹼基序列中，下劃線部表示向載體進行亞克隆所必需的限制性內切酶位點。[表 I]在TpN47基因的製作中使用的引物
權利要求
1.一種抗梅毒螺旋體抗體測定試劑，其特徵在於，在利用了抗原抗體反應的、用於測定抗梅毒螺旋體抗體的試劑中，將至少包含梅毒螺旋體47kDa抗原中的結構域C和D而不包含梅毒螺旋體47kDa抗原中的結構域Al的重組多肽用作抗原。
2.根據權利要求I所述的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑，其中，抗原為由梅毒螺旋體47kDa抗原中的結構域C和D，結構域A2、C和D，或者結構域B、A2、C和D構成的重組多肽。
3.根據權利要求I所述的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑，其中，抗原被固定於不溶性載體。
4.根據權利要求2所述的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑，其中，抗原被固定於不溶性載體。
5.一種抗梅毒螺旋體抗體測定試劑，其中，權利要求3所述的不溶性載體為由高分子聚合物構成的乳膠。
6.一種抗梅毒螺旋體抗體測定試劑,其中，權利要求4所述的不溶性載體為由高分子聚合物構成的乳膠。
7.一種抗梅毒螺旋體抗體測定方法，其特徵在於，使用權利要求I所述的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑。
8.一種抗梅毒螺旋體抗體測定方法，其特徵在於，使用權利要求2所述的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑。
9.一種抗梅毒螺旋體抗體測定方法，其特徵在於，使用權利要求3所述的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑。
10.一種抗梅毒螺旋體抗體測定方法，其特徵在於，使用權利要求4所述的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑。
11.一種抗梅毒螺旋體抗體測定方法，其特徵在於，使用權利要求5所述的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑。
12.—種抗梅毒螺旋體抗體測定方法，其特徵在於，使用權利要求6所述的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑。
全文摘要
本發明提供高靈敏度且高特異性地測定抗梅毒螺旋體抗體的使用了多肽抗原的抗梅毒螺旋體抗體測定試劑以及利用該抗梅毒螺旋體抗體測定試劑的測定方法。一種抗梅毒螺旋體抗體測定試劑，其特徵在於，在利用了抗原抗體反應的、用於測定抗梅毒螺旋體抗體的試劑中，將至少包含梅毒螺旋體47kDa抗原中的結構域C和D而不包含梅毒螺旋體47kDa抗原中的結構域A1的重組多肽用作抗原。
文檔編號G01N33/531GK102869991SQ20118001682
公開日2013年1月9日 申請日期2011年3月31日 優先權日2010年3月31日
發明者原康之, 大田哲也, 川本道子, 佐藤真也, 巖本繁久, 島岡達郎, 須藤薰雄 申請人:積水醫療株式會社, 日本羔羊有限公司