一種明日葉查爾酮合成酶基因的序列的製作方法
2023-06-06 04:55:46
一種明日葉查爾酮合成酶基因的序列的製作方法
【專利摘要】一種明日葉類黃酮合成途徑限速酶—查爾酮合成酶基因的序列，該基因的序列具有SEQ ID NO.1中從第1-1413位所示的核苷酸序列以及SEQ ID NO.2中從第1-1194位所示的核苷酸序列，其序列編碼的多肽具有SEQ ID NO.3所示的胺基酸序列。查爾酮合成酶是植物體內類黃酮代謝途徑中的第一個關鍵酶，本發明利用同源克隆方法結合RACE技術獲得的明日葉查爾酮合成酶基因可用於調控明日葉及其他植物內黃酮類化合物的合成，具有較大的經濟價值和應用前景，尤其在醫療、保健領域使得明日葉能夠獲得更廣泛的應用。
【專利說明】-種明日葉查爾酮合成酶基因的序列
【技術領域】
[0001] 本發明涉及的是一種植物基因工程領域的基因序列，具體涉及一種明日葉類黃酮 化合物合成關鍵基因的查爾酮合成酶基因的DNA、cDNA開放閱讀框全長序列及編碼蛋白的 胺基酸序列。
【背景技術】
[0002] 明日葉，傘形科當歸屬草本植物，原產自日本八丈島，因島民多食用明日葉，均較 長壽，因此明日葉又名長壽菜。明日葉具有抗癌、防止細胞老化、提高機體免疫力、抗血栓、 降血壓等保健功能，被譽為"21世紀的健康食品"。研究發現，明日葉富含一種特有成分 查爾酮，屬黃酮類化合物，而此黃酮類化合物具有很高的藥用價值（藥食兼用植物明日葉 的研究進展及應用劉暢，王正武等，食品與藥品2013, 15 (3) 205-209)(周先麗，梁成欽， 徐慶，等.明日葉的化學成分[J].中國實驗方劑學雜誌，2012, 18 (3): 103-105)，孟揚 等在關於查爾酮抑制小鼠癌細胞的研究中證明了查爾酮的藥用功能（孟揚，鍾進義，孫 赫.明日葉查爾酮對小鼠肝癌細胞Caspase-3和Bax蛋白表達的影響[J].癌變.畸變.突 變，2011，23(1) :50-53)。因此明日葉的藥用及保健功能與其富含查爾酮有著必然聯繫。黃 酮類化合物是一類重要的植物次生代謝物質，指基本母核為苯基色原酮類化合物，現在則 泛指兩個具有酚羥基的苯環通過中央三碳原子相互連接的一系列化合物。黃酮類化合物合 成途徑中，主要是由多個結構基因和調節基因來完成的，通過苯丙氨酸代謝途徑，從苯丙氨 酸經過三步酶促反應生成香豆醯輔酶A，再在查爾酮合成酶的作用下，與丙二酸輔酶A縮合 生成查爾酮，然後在查爾酮異構酶（CHI)、二氫黃酮醇還原酶（DFR)和異黃酮合酶（IFS)等 催化下合成黃酮、異類黃酮、花青素類等化合物（蔣明，曹家樹.查爾酮合成酶基因[J]. 細胞生物學雜誌，2007, 29(4) :525-529)。因此，查爾酮合成酶（CHS)在苯丙氨酸代謝途徑 中扮演著極其重要的角色，是類黃酮合成途徑中的關鍵酶和限速酶。因此明日葉查爾酮合 成酶基因 CHS可應用於明日葉類黃酮化合物合成的調控。目前，國內外關於查爾酮合成酶 的報導較多，主要集中在十字花科的擬南芥、禾本科的稻、玉米、豆科的大豆、苜蓿、豌豆、葡 萄科的葡萄、菊科植物等，但未曾見任何公開報導傘形科當歸屬明日葉查爾酮合成酶基因 的克隆及DNA、cDNA開放閱讀框全長序列和編碼蛋白的胺基酸序列，同時對於UV-C照射處 理對明日葉CHS基因表達的影響和查爾酮含量調控研究也未見報導。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種明日葉查爾酮合成酶基因 DNA 全序列、開放閱讀框ORF序列以及該基因編碼的胺基酸序列，並且在獲得高查爾酮含量明 日葉品種中得到應用，為調控明日葉黃酮類化合物合成及在轉基因植物中的應用提供有效 的技術手段。
[0004] 本發明的技術方案是：
[0005] -種明日葉查爾酮合成酶基因的序列，其具有SEQ ID NO. 1中從第1-1413位所示 的核苷酸序列以及SEQ ID NO. 2中從第1-1194位所示的核苷酸序列。
[0006] 進一步地，所述的序列編碼的多膚具有SEQ ID NO. 3所不的氣基酸序列。
[0007] 本發明的另一技術方案是：
[0008] -種所述的明日葉查爾酮合成酶基因在獲得高查爾酮含量明日葉品種中的應用。
[0009] 本發明所述的明日葉查爾酮合成酶基因 CHS全長的克隆，依次通過以下步驟實 現：
[0010] 1)根據菊科植物查爾酮合成酶基因保守序列設計兼併引物，以明日葉葉片CDNA 為模板，擴增明日葉查爾酮合成酶基因的保守區域；
[0011] 2)基於獲得的明日葉查爾酮合成酶基因的保守區域設計基因特異引物，進行3'、 5' race克隆，分別得到明日葉CHS基因的3'、5'端序列，通過拼接得到明日葉CHS基因的 ORF序列，並命名為Ak-CHS ;
[0012] 3)根據明日葉CHS基因 ORF設計基因全長引物，以明日葉cDNA為模板進行PCR擴 增，驗證獲得的CHS基因 ORF全長序列，並以DNA為模板，以上述設計全長特異引物進行PCR 擴增獲得基因 DNA全長。
[0013] 4)根據獲得的ORF序列設計Ak-CHS螢光定量引物，以actin為內參基因設計其熒 光定量引物，通過UV-C照射處理明日葉葉片不同時間，以不同時間提取的明日葉葉片RNA 反轉錄的cDNA為模板進行q-PCR，並測定不同時間明日葉葉片查爾酮提取量。
[0014] 本發明具有如下的有益效果：
[0015] 由於查爾酮合成酶是植物體內類黃酮代謝途徑中的第一個關鍵酶，因此本發明提 供的查爾酮合成酶基因可用於調控明日葉及其他植物內黃酮類化合物的合成，具有較大的 經濟價值和應用前景，尤其使得明日葉在醫療、保健領域中獲得更廣泛的應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 圖1為明日葉葉片RNA電泳結果圖。
[0017] 圖2為CHS基因3'端PCR擴增產物電泳圖；
[0018] 圖中，M- DL2000，1-CHS基因3'端PCR擴增產物。
[0019] 圖3為CHS基因5'端PCR擴增產物電泳圖；
[0020] 圖中，M- DL2000, 2- CHS基因5'端PCR擴增產物。
[0021] 圖4為CHS基因 ORF、DNA全長驗證電泳圖；
[0022] 圖中，M- DL2000, 3- CHS基因 ORF全長的PCR擴增產物，4一CHS基因 DNA全長的 PCR片擴增產物。
[0023] 圖5為UV-C照射處理AK-CHS基因相對表達量分析圖。
[0024] 圖6為UV-C照射處理查爾酮提取量變化圖。
[0025] 圖7為查爾酮含量測定標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0026] 本發明利用同源克隆方法結合RACE技術獲得明日葉類黃酮合成途徑限速酶一查 爾酮合成酶的基因全長序列，該基因 DNA全長1413bp，含兩個外顯子和一個內含子，開放閱 讀框（ORF)全長為1194bp，編碼397個胺基酸。
[0027] 下面結合具體的實施例進一步闡述本發明的【具體實施方式】。這些實施例僅用於說 明本發明而不用於限制本發明的範圍。
[0028] 下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，詳見[美]J.莎姆 布魯克（2005)編著的《分子克隆實驗指南》第三版中所述的條件，或按照試劑盒製造廠商 所建議的條件。實驗所用的高保真Taq酶（Premix Taq)、pMD18 - T載體、PrimeScript?lst Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒和突光定量試劑盒購自TaKaRa公司， SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒購自 Clontech 公司，RNAprep Pure 植物總 RNA提取試劑盒購於天根生化科技（北京）有限公司，大腸桿菌DH5ci由實驗室保存。
[0029] 實施例1
[0030] 明日葉查爾酮合成酶基因的克隆，步驟如下：
[0031] 1.明日葉葉片RNA的提取
[0032] a)勻漿處理：
[0033] 稱取50-100mg鮮嫩明日葉葉片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450 μ I RL，渦旋 劇烈震蕩混勻。
[0034] b)將所有溶液轉移至過濾柱CS上（過濾柱CS放在收集管中），12000rpm離心 2-5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的離心管中，吸頭儘量避免接觸收集管中 的細胞碎片沉澱。
[0035] c)緩慢加入0. 5倍上清體積的無水乙醇，混勻，將得到的溶液和沉澱一起轉入吸 附柱CR3中，12000rpm離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。
[0036] d)向吸附柱CR3中加入350μ 1去蛋白液RWl，12000rpm離心30-60sec，倒掉收集 管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。
[0037] e) DNase I工作液的配製：取10 μ I DNase I儲存液放入新的RNase-Free離心管 中，加入70 μ I RDD溶液，輕柔混勻。
[0038] f)向吸附柱CR3中央加入80 μ 1的DNase I工作液，室溫放置15min。
[0039] g)向吸附柱CR3中加入350μ 1去蛋白液RWl，12000rpm離心30-60sec，倒掉收集 管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。
[0040] h)向吸附柱CR3中加入500 μ 1漂洗液RW，室溫靜置2min，12000rpm離心 30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。
[0041] i)重複步驟h)。
[0042] j) 12000rpm離心2min，倒掉廢液，將吸附柱CR3置於室溫放置數分鐘，以徹底晾乾 吸附材料中殘餘的漂洗液。
[0043] k)將吸附柱CR3放入一個新的RNase-Free離心管中，向吸附膜的中間部位懸空 滴加 30-100 μ I RNase-Free ddH20,室溫放置 2min，12000rpm 離心 2min，得到 RNA 溶液，一 70°C保存。
[0044] 1)用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，明日葉葉片總RNA電泳結果見圖 1，由圖1可以看到28S和18S清晰的兩條帶，且28S條帶的亮度約為18S的2倍；說明R NA 提取完整，無降解，滿足後續試驗需要，分光光度計下檢測RNA濃度。
[0045] 2. cDNA第一條鏈的合成
[0046] 根據 PrimeScript?lst Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒說明，將一 70°C保存 的RNA反轉錄合成cDNA第一條鏈，反轉錄後的cDNA保存於-20°C冰箱中備用。
[0047] 3. CHS基因 cDNA開放閱讀框全長克隆及DNA全長的獲得
[0048] a)根據菊科植物查爾酮合成酶基因保守序列設計兼併引物CHS-F、CHS_R(見下列 表1)，以反轉錄的明日葉cDNA為模板，擴增明日葉查爾酮合成酶基因的保守區域；PCR反應 條件為：94°C 5min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C lmin，32 個循環；72°C IOmin ;4°C保存。將回 收的PCR產物連接至pMD18-T載體上，轉化大腸桿菌DH-5a，在選擇培養基上培養（氨苄青 黴素）後，挑選單克隆搖菌後進行PCR檢測，檢測獲得的陽性結果送至上海華大基因進行測 序，測序獲得長度為959bp的保守區域片段。
[0049] 表1本發明所用引物
[0050]
【權利要求】
1. 一種明日葉查爾酮合成酶基因的序列，其特徵在於，具有SEQ ID NO. 1中從第 1-1413位所示的核苷酸序列以及SEQ ID NO. 2中從第1-1194位所示的核苷酸序列。
2. 根據權利要求1所述的明日葉查爾酮合成酶基因的序列，其特徵在於，所述的序列 編碼的多肽具有SEQ ID NO. 3所示的胺基酸序列。
3. -種權利要求2所述的明日葉查爾酮合成酶基因在獲得高查爾酮含量明日葉品種 中的應用。
【文檔編號】C12N9/10GK104313040SQ201410558045
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月20日 優先權日:2014年10月20日
【發明者】周麟筆, 劉峰, 曹越平 申請人:上海交通大學