可用於多發性肌炎/皮肌炎診斷的抗原提純工藝方法及應用的製作方法

2023-06-05 23:54:21

專利名稱：可用於多發性肌炎/皮肌炎診斷的抗原提純工藝方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種可用於對自身免疫性疾病多發性肌炎(PM)/皮肌炎(DM)和抗-Jo-1抗體綜合症(Anti-Jo-1 Antibody Syndrome)進行特異性診斷的Jo-1抗原的方便高效的提純工藝，用該工藝方法製備的Jo-1抗原用於製造可供臨床使用的特異性地診斷多發性肌炎/皮肌炎和抗-Jo-1抗體綜合症的免疫測定方法，如發展成斑點印跡(DB)或酶聯免疫吸附試驗(ELISA)診斷試劑盒等。
背景技術：
多發性肌炎以對稱性四肢近端不同程度的肌力下降為臨床特徵，也可累及頸項肌等除表情肌以外的各部位骨骼肌，絕大部分同時伴有血中骨骼肌酶類肌原性損害的肌電圖改變，如肌酸激酶(CK)、醛縮酶(aldolase)、天門冬氨酸轉氨酶(AST)、丙氨轉氨酶(ALT)和乳酸脫氫酶(LDH)等。皮肌炎除有上述表現外，還同時有特徵性的皮疹，如Gottron疹、「技工手」、向陽疹、「V」字徵和「披肩徵」等。多發性肌炎多以隱匿性或亞急性起病，皮肌炎常因皮疹出現，較早就診而被發現。目前還沒有多發性肌炎/皮肌炎確切的發病率統計，按1975年Bohan和Peter提出的診斷標準(參見Bohan A和Peter JB，N Engl J Med.，292344-47，403-07，1975)，估計在0.6-7例/十萬人口。資料也表明，多發性肌炎/皮肌炎病人並發惡性腫瘤較普通人群高(張海雲主編現代自身免疫病，人民軍醫出版社，1996，p.212-223)。多發性肌炎/皮肌炎在任何年齡均可發病，高發年齡出現在5-14歲和40-60歲，呈雙峰分布，女性患者是男性的2倍。多發性肌炎/皮肌炎病因和發病機理都不太明了，根據現有資料，推測在遺傳易感性的基礎上因病毒感染等環境因素導致機體免疫功能紊亂，通過分子模擬的方式引起發病。在多發性肌炎肌肉組織病理標本上，肌纖維細胞有MHC-I類抗原表達，肌細胞和肌膜下有大量CD8(+)T淋巴細胞浸潤。皮肌炎的肌肉或皮膚病理組織主要表現為小血管炎，可見血管內皮增生，血栓形成，管腔狹窄甚至閉塞，免疫病理發現有補體介導的膜攻擊複合物(MAC)在血管壁沉積。
對稱性肌無力、肌活檢異常、肌酶升高及肌電圖改變對肌炎的診斷有重要意義。在肌炎診斷中需要注意與其他累及肌肉的疾病進行鑑別，這些疾病包括重症肌無力，嗜酸粒細胞升高性筋膜炎，進行性肌營養不良、流行性肌痛症、肌球蛋白尿症，藥物所致的肌炎和風溼性多肌痛等。作為自身免疫性疾病的多發性肌炎/皮肌炎，針對疾病特異性抗體的檢測在疾病的確診中具有重要的作用。
多發性肌炎/皮肌炎和/或抗-Jo-1抗體綜合症患者血清中存在多種自身抗體，有些抗體對診斷具有特異性意義，被稱為肌炎特異性抗體(MSAs)，其中出現率最高，臨床意義最大的是所謂Jo-1抗體。這個抗體是1980年Nishikai.M和Reichlin.M在多發性肌炎/皮肌炎患者中發現的，他們用免疫雙擴散(DID)的方法建立了Jo-1抗原/抗體系統，而且發現Jo-1抗體對診斷多發性肌炎/皮肌炎具有高度特異性(參見Nishikai M和Reichlin M，關節炎和風溼病，23881-8(1980)。)，此後，其他學者用免疫雙擴散和/或對流免疫電泳(CIE)的方法研究Jo-1抗體和多發性肌炎/皮肌炎關係時發現，Jo-1抗體在多發性肌炎/皮肌炎中的陽性率在30％左右，並且幾乎僅見於多發性肌炎/皮肌炎患者(參見Arnett FC等，風溼病雜誌，8925-30(1981)。)，因此，Jo-1抗體被一致認為是多發性肌炎/皮肌炎的標誌性抗體。
抗-Jo-1抗體綜合症原是指多發性肌炎/皮肌炎患者中，血中Jo-1抗體陽性，同時有間質性肺病(ILD)，雷諾現象，「技工手」，非侵襲性多關節炎，發熱等。隨著對該綜合症認識的不斷深入，部分抗-Jo-1抗體綜合症的患者並不以肌炎為首發，甚至在病程中多發性肌炎/皮肌炎表現不明顯甚至缺如。有些患者僅有間質性肺病和血中Jo-1抗體陽性。對於這兩組患者，Jo-1抗體的檢測對確立診斷至關重要。
Jo-1抗體的臨床意義包括(1)幫助確立多發性肌炎/皮肌炎和/或Jo-1抗體綜合症綜合症的診斷；(2)血中Jo-1抗體滴度與疾病活動度相關，因此，Jo-1抗體檢測可用於監測病情變化；(3)Jo-1抗體陽性和陰性的多發性肌炎/皮肌炎和/或Jo-1抗體綜合症的患者對激素的治療反應不同，且對各類免疫抑制劑治療的敏感性也存在差異，因而，Jo-1抗體檢測結果對藥物選擇具有提示意義；(4)Jo-1抗體與多發性肌炎/皮肌炎的預後有一定的相關性，Jo-1抗體陽性患者預後相對較差；(5)Jo-1抗體還與某些人類白細胞抗原(HLA)等位基因相關，提示Jo-1抗原/抗體系統在多發性肌炎/皮肌炎和/或抗-Jo-1抗體綜合症的發病中發揮重要作用。
1983年Mathews MB等用放射性同位素32P和35S標記HeLa細胞提取物結合酶活性抑制實驗證實了Jo-1抗體的靶抗原是組氨醯-tRNA合成酶(參見MathewsMB和Bernstein RM，自然，304(14)177-9(1983)。)。隨著對Jo-1抗原/抗體系統研究的深入，有充足的數據表明組氨醯-tRNA合成酶只分布在細胞漿中(參見Shi MH等，J Reumatol.，18252-8(1991)；Kamei H，自身免疫雜誌，22(3)201-10(2004)。)，而Nishikai.M和Reichlin.M建立Jo-1抗原/抗體系統時的抗原來源是細胞核或整個細胞，並用間接免疫螢光法(IIF)證明Jo-1抗原在小鼠脾細胞的細胞核中。而後Reichlin.M(參見Reichlin M和ArnettFC Jr，關節炎和風溼病，271150-6(1984)。)和其他學者(參見Shi MH等，風溼病學雜誌，18252-8，1991；Kamei H，J Autoimmun.，22201-10，2004；Vazquez-Abad D等，Cell Tissue Res.，286487-91，1996)。更深入的細胞間接免疫螢光研究表明Jo-1抗原在細胞核和細胞漿都有分布，沒有細胞種類和細胞周期特異性。綜合20多年來從不同角度對Jo-1抗原/抗體系統的研究資料，有足夠的理由認為基於凝膠免疫沉澱技術建立起來的Jo-1抗原/抗體系統，其抗原可能不是單一組分，組氨醯-tRNA合成酶只是這個複雜抗原結構中的一種成分。
對某一特定疾病的確認應基於以下三個方面患者的臨床表現、病理學和血清學特徵。1975年Bohan和Peter的多發性肌炎/皮肌炎診斷標準沒有把免疫血清學因素考慮進去，近來提出來的一些標準在這方面做了努力(參見Tanimoto K等，風溼病學雜誌，22668-74(1995)。)。由於Jo-1抗原/抗體系統在多發性肌炎/皮肌炎和抗-Jo-1抗體綜合症臨床中的重要作用，一直以來免疫風溼病臨床和實驗室工作者都非常重視Jo-1抗體的檢測，現在臨床中用於檢測Jo-1抗體的技術主要有免疫雙擴散、對流免疫電泳、免疫印跡(IB)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和斑點印跡(DB)。免疫雙擴散、對流免疫電泳、免疫印跡的抗原主要來源於牛肝、牛胸腺或兔胸腺的鹽水粗提物。免疫雙擴散為檢測Jo-1抗體的經典方法，陽性結果特異性強，但敏感性低，假陰性較多，操作耗時較長；對流免疫電泳和免疫雙擴散一樣也是基於凝膠免疫沉澱技術，但需作參比電泳，技術操作較複雜，穩定性不夠好，一般不單獨用於Jo-1抗體檢測；國內臨床實驗室雖然廣泛應用免疫印跡檢測Jo-1抗原，但其結果可靠性差，對臨床診斷多發性肌炎/皮肌炎的幫助不大。免疫酶法(EIA)中的酶聯免疫吸附試驗和斑點印跡是近年來發展起來檢測Jo-1抗體的方法，它們的抗原來源大部分是基因工程重組的組氨醯-tRNA合成酶，少部分是從人源細胞株(如Hep-2等)中純化的組氨醯-tRNA合成酶，一方面，重組的組氨醯-tRNA合成酶常混有宿主蛋白，並且可能有不同的表達後摺疊和修飾，因而重組的組氨醯-tRNA合成酶與天然的組氨醯-tRNA合成酶在抗原表位上也可能不完全一樣；更重要的另一方面，正如前述一樣，組氨醯-tRNA合成酶只是Jo-1抗原的一部分。因而用重組的組氨醯-tRNA合成酶製成的酶聯免疫吸附試驗或斑點印跡試劑盒因抗原表位不全面，而使其敏感性並沒有象期待的那樣明顯高於免疫雙擴散，也因為混有雜蛋白和蛋白表達後摺疊、修飾的差異，特異性比免疫雙擴散明顯低。用純化的Jo-1抗原製備酶聯免疫吸附試驗或斑點印跡試劑盒基本保持了Jo-1抗原的特性，可製成更加特異的試劑盒。
20多年來，許多作者在Jo-1抗原的純化上作了很多努力，但提純工藝複雜，產率低，成本高，耗時長，難於大規模生產來滿足臨床實驗室診斷應用的需要。少量親和色譜成功純化組氨醯-tRNA合成酶(參見Targoff IN和Reichlin M，J Immunol.，1382874-82，1987)，僅見於實驗室應用，並未用於大規模純化Jo-1抗原中。
為進一步提高多發性肌炎/皮肌炎和/或抗-Jo-1抗體綜合症中Jo-1抗體的檢出率，同時保證陽性結果對診斷多發性肌炎/皮肌炎和/或抗-Jo-1抗體綜合症保留象免疫雙擴散一樣的高度特異性，簡便地製備表位全面、純度高能滿足免疫酶法檢測Jo-1抗體的Jo-1抗原是首要和亟待解決的問題。為了使免疫酶法檢測Jo-1抗體能確實有效地用於臨床診斷，解決高純度的Jo-1抗原供應是關鍵。發明人創立了一個方便有效的Jo-1抗原提純方法，這個工藝方法篩選出來源豐富的生物原料、改進了免疫親合色譜柱的製備、發現了高效率的色譜分離條件、並有機結合應用了其它蛋白質純化方法，建立了大量提純製造Jo-1抗原的工藝方法。
應用本工藝方法提純製造的Jo-1抗原已用於製造酶聯免疫吸附試驗檢測試劑盒及其他免疫檢測試劑盒，臨床檢驗表明其檢驗結果與現有臨床檢測方法相比顯著地提高了敏感性和特異性並降低了檢測時間。

發明內容
發明人建立了免疫親和色譜結合其它蛋白質提純技術製備Jo-1抗原的工藝方法。這其中包括找到來源豐富的生物原料；改進免疫親和色譜柱的製備；高效率色譜分離條件的建立；及色譜分離與其它蛋白提純技術的合理結合等。方法簡便、重複性好、產量較高。
本工藝方法是用磷酸鈉-鹽水緩衝液從來源豐富的新鮮和/或凍存的動物組織中抽提可溶性核抗原(ENA)，用構建的親和色譜法進一步從可溶性核抗原中批量化地提純出Jo-1抗原。免疫親和色譜柱的基質是環氧活化的瓊脂糖(Sephrose4B)，配體來源於從單一特異性Jo-1抗血清中提純的IgG。使用的動物組織包括但不限於豬、牛、兔、羊、鼠、猴、狗、馬等的脾臟、肝臟、胸腺等動物組織。
本方法進一步提供了將純化的Jo-1抗原用於製備酶聯免疫吸附試驗板或斑點印跡膜的方法，並經臨床樣品的檢測和應用。臨床檢測的血清標本包括多發性肌炎、皮肌炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)、類風溼關節炎(RA)例、原發性乾燥綜合症(1°SS)、其它結締組織病及正常人。結果表明酶聯免疫吸附試驗和/或斑點印跡檢測Jo-1抗體的特異性與免疫雙擴散結果一致。在一組多發性肌炎/皮肌炎病例中，Jo-1抗體檢出率為30％，符合Jo-1抗體在多發性肌炎/皮肌炎病人中出現的頻率；而且特異性為100％。因此，本發明提供了一種製造高純度Jo-1抗原的技術工藝，該工藝為鹽水緩衝液提取和免疫親和色譜的結合運用純化蛋白質的工藝。
本發明還提供了可提取性核抗原製造工藝之一鹽水抽提法及可提取性核抗原保存和初步濃縮方法之一的丙酮沉澱法。
本發明進一步提供了免疫親和色譜柱的製造工藝之一環氧活化瓊脂糖凝膠偶聯蛋白質配體和溼法裝柱。
本發明還提供了鹽水緩衝液提取和免疫親和色譜所涉及各步驟所用的緩衝液、溶液的配方和配製方法。
本發明還提供了由上述方法獲得的高純度Jo-1抗原。
本發明還提供了一種檢測Jo-1抗體的方法之一斑點印跡試劑盒以及上述試劑盒在檢測Jo-1抗體中的應用。
本發明還進一步提供了一種檢測Jo-1抗體的方法之一酶聯免疫吸附試驗試劑盒以及上述試劑盒在檢測Jo-1抗體中的應用。
根據本發明的一個方面，本發明提供了一種製造Jo-1抗原的技術工藝，該技術工藝為鹽水緩衝液提取和免疫親和色譜的結合運用純化Jo-1抗原。
具體地說，包括以下步驟A將哺乳動物組織，例如豬、牛、兔、羊、鼠、猴、狗、馬等的脾臟、肝臟、胸腺等，特別是豬的脾臟(凍存的先解凍復甦)置於鹽水緩衝液中，用勻漿器製成勻漿，勻漿液離心後收集上清液，上清液就是可提取性核抗原；B可提取性核抗原溶液與結合緩衝液透析後上樣到免疫親和色譜柱上，在結合緩衝液平衡親和柱後用洗脫緩衝液洗脫，收集洗脫組分，此即Jo-1抗原；如實施例4所述，可以用酶聯免疫吸附試驗和/或斑點印跡檢測Jo-1抗體，具體包括以下步驟C把Jo-1抗原包被酶聯免疫吸附試驗板或製造斑點印跡膜，檢測Jo-1抗體。
另一方面，本發明還提供了可提取性核抗原製造工藝之一鹽水抽提法及可提取性核抗原保存和初步濃縮方法之一的丙酮沉澱法。具體步驟如下A將豬脾臟等動物組織(凍存的先解凍復甦)置於鹽水緩衝液中，用勻漿器製成勻漿，勻漿液離心後收集上清液，上清液就是可提取性核抗原；B向可提取性核抗原溶液中加入預冷丙酮，離心除去丙酮，所得沉澱晾乾，收集可提取性核抗原丙酮粉。
根據本發明的又一方面，本發明進一步提供了免疫親和色譜柱的製造工藝之一環氧活化瓊脂糖凝膠偶聯蛋白質配體和溼法裝柱。包括以下步驟
A把水洗過的瓊脂糖凝膠置於水中，加入環氧氯丙烷和氫氧化鈉進行環氧法活化凝膠基質；B將活化後的瓊脂糖凝膠水洗後置於溶有配體的偶聯緩衝液中偶聯配體；C必要時，偶聯配體的凝膠清洗後乙醇(例如20％的乙醇)中保存；如實施例2中所述，偶聯有配體的凝膠可進一步裝到柱子裡，製造免疫親和色譜柱，包括如下步驟D向色譜柱注入佔柱體積1/2以上的結合緩衝液，打開柱的下端出口使液體流出；E偶聯有配體的凝膠懸浮於結合緩衝液中，把凝膠混懸液從色譜柱的上端入口加入色譜柱中；F繼續用結合緩衝液清洗色譜柱至5倍柱床體積以上。
依據本發明的另一方面，本發明同時還提供了鹽水緩衝液提取和免疫親和色譜純化Jo-1抗原所涉及各步驟所用的緩衝液、溶液的配方和配製方法。具體地說，本發明涉及的緩衝液和/或溶液配方及其配製方法示例而非限制性地如下所示A勻漿緩衝液0.01M磷酸鈉-鹽水(PBS)緩衝液，PH7.0，乙二銨四乙酸二鈉(EDTA)0.01M，苯甲基磺醯氟(PMSF)1.5mM，二巰基蘇糖醇(DTT)1mM，胰蛋白酶抑制劑4μg/ml，亞硫酸氫鈉1.5mM；B製造配體結合緩衝液20mM磷酸鈉鹽緩衝液(PB)，pH7.0-7.5；C製造配體洗脫緩衝液0.1M檸檬酸鈉緩衝液，pH3.0-4.0；。
D製造配體收集緩衝液1-2M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩衝液；E瓊脂糖環氧活化緩衝液0.4M氫氧化鈉水溶液；F配體偶聯緩衝液0.5M碳酸鈉水溶液；GJo-1抗原純化結合緩衝液0.01M磷酸鈉-鹽水緩衝液，pH7.2，含氯化鈉(NaCl)0.5M或0.05M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸-鹽水緩衝液(TBS)，pH 7.2，含氯化鈉0.5M；HJo-1抗原純化洗脫緩衝液3-4M氯化鎂；I斑點印跡洗膜緩衝液20mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸-鹽水-吐溫-20(TBS-T)，pH值7.5，含0.15M氯化鈉，吐溫-20(Tween-20)濃度為0.05％；J斑點印跡封閉液5％脫脂奶粉，溶媒為洗膜緩衝液；K酶聯免疫吸附試驗包被緩衝液碳酸鈉/碳酸氫鈉緩衝液，pH8.5-9.5；L酶聯免疫吸附試驗封閉緩衝液5％脫脂奶粉，溶媒為包被緩衝液；M酶聯免疫吸附試驗漂洗緩衝液0.01M磷酸鈉-鹽水-吐溫-20(PBS-T)，吐溫-20濃度0.05％，pH＝7.5。
鹽水緩衝液抽提豬脾臟等動物組織中的可提取性核抗原，100g組織可得1.0-1.5g蛋白質，丙酮沉澱可得到5-7g幹丙酮粉，丙酮粉中蛋白質含量為20-24％。丙酮粉在低溫中長期保存(如3-5年)，其中抗原活性不會降低。
根據本發明的另一方面，依照本發明製造Jo-1免疫親和色譜柱，1g瓊脂糖幹膠溶漲後能夠得到3.0-3.5ml凝膠，Jo-1配體與凝膠的最適比例是5-10mg/ml，配體與凝膠偶聯的偶聯率為98％以上。可提取性核抗原經過Jo-1免疫親和色譜柱純化，可以得到抗原表位全面、純度高的Jo-1抗原，純化倍數約是1900倍。經過親和色譜柱的保留組分在十二烷基磺酸鈉-聚丙希醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上存在5條帶，但在免疫印跡上只有50千道爾頓(KD)的條帶具有與Jo-1抗體發生免疫反應的抗原活性。斑點印跡和/或酶聯免疫吸附試驗結果表明親和純化的保留峰只和Jo-1抗血清發生免疫反應，不與其他自身免疫性疾病中常見的抗血清，如Sm/RNP、SSA(Ro)/SSB(La)、ScL-70等抗血清發生免疫反應。
本發明還進一步提供了一種檢測對肌炎/皮肌炎和抗-Jo-1抗體綜合症有特異性診斷價值的抗體之一Jo-1抗體的斑點印跡和/或酶聯免疫吸附試驗試劑盒，在斑點印跡試劑盒中，有一張硝酸纖維素(NC)膜，膜上有一個高純度Jo-1抗原點或一條Jo-1抗原線。在酶聯免疫吸附試驗試劑盒中，有一塊微量孔酶聯免疫吸附試驗板，孔中包被有抗原表位全面的高純度Jo-1抗原，與之同時提供的可以是經政府藥物管理機構審核批准的、有關藥品或生物製品製造、使用及銷售的信息。本領域的技術人員已知，以上組分僅是檢測Jo-1抗體的核心關鍵成分，與這些關鍵組分共同提供的還將有封閉緩衝液、漂洗緩衝液或它們的配方，以及酶標記的二抗、顯色所需的底物及其緩衝液或它們的配方。例如，封閉緩衝液可以是5％的脫脂奶粉或1-5％的牛血清白蛋白(BSA)，漂洗緩衝液可以是含0.05％吐溫-20的磷酸鈉鹽水緩衝液，酶標記的二抗可以是辣根過氧化物酶(HRP)或鹼性磷酸酶(ALP)標記的羊或兔抗人免疫球蛋白(Ig)或Ig Fc段的抗體。對於辣根過氧化物酶標記的二抗，斑點印跡的顯色底物可以用3，3』-二氨基聯苯胺(DAB)/4氯芬(4-Chloronaphthol，4-CN)+過氧化氫(H2O2)，底物緩衝液是0.05M的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液，pH7.6。酶聯免疫吸附試驗的顯色底物可以是鄰苯二胺(OPD)或3，3』，5，5』-四甲基聯苯胺(TMB)，底物先用而四甲基亞碸(DMSO)溶解後再用底物緩衝液枸櫞酸-乙酸鈉緩衝液(pH＝5-6)稀釋。對於鹼性磷酸酶標記的二抗，顯色底物是對硝基苯磷酸鈉(n-NPD)，底物緩衝液為二乙醇胺溶液(pH＝9.8)。本領域的技術人員還已知，上述斑點印跡和/或酶聯免疫吸附試驗檢測過程的相關緩衝液和顯色系統只是可選擇的方法之一。
其使用方法說明如下
斑點印跡檢測1)檢測膜與抗血清反應把檢測膜用洗膜緩衝液漂洗3-5分鐘，棄去洗膜緩衝液，封閉緩衝液封閉0.5-1小時，洗膜緩衝液漂洗3-5分鐘/次×3次，加入待測抗血清室溫孵育1-2小時；2)檢測膜與酶標二抗反應洗膜緩衝液漂洗3-5分鐘/次×3次，加入酶標二抗室溫孵育0.5-1小時；3)顯色與結果觀察洗膜緩衝液漂洗3-5分鐘/次×3次，加入底物液顯色，結果滿意後加入終止液終止顯色反應，將結果與陽性、陰性和空白對照比對，讀取和記錄檢測結果。
酶聯免疫吸附試驗檢測1)與抗血清反應用洗滌緩衝液漂洗酶聯免疫吸附試驗板3-5分鐘/次×2次，封閉緩衝液室溫封閉1-2小時，洗滌緩衝液漂洗3-5分鐘/次×3次，加入稀釋待測抗血清室溫孵育1-2小時；2)與酶標二抗反應洗滌緩衝液漂洗3-5分鐘/次×3次，加入酶標二抗室溫孵育0.5-2小時；3)顯色洗滌緩衝液漂洗3-5分鐘/次×3次，加入底物液顯色，結果滿意後加入終止液終止顯色反應；4)酶標儀讀取吸光值並記錄結果將酶聯免疫吸附試驗板放入酶標儀中，按廠家說明書操作，進行檢測，記錄檢測結果。
對檢測結果的可靠性，本領域的普通技術人員應該已經知道，斑點印跡和/或酶聯免疫吸附試驗檢測待測血清，應該同時有陽性、陰性和空白對照，這樣檢測結果才準確可靠。
本發明同時還提供了斑點印跡和酶聯免疫吸附試驗在多發性肌炎/皮肌炎和抗-Jo-1抗體綜合症特異性抗體之一的Jo-1抗體血清學檢測中的應用。用本發明製造的Jo-1抗原製成的斑點印跡和/或酶聯免疫吸附試驗試劑盒，顯著提高了Jo-1抗體在診斷多發性肌炎/皮肌炎和抗-Jo-1抗體綜合症中敏感性和特異性，尤其為不典型病例的診斷提供了可靠的診斷手段，從而提高了多發性肌炎/皮肌炎和抗-Jo-1抗體綜合症臨床診斷的準確性，為及時治療和治療中的正確藥物選擇提供了可靠的依據。
最後，本發明也為其它自身免疫性疾病的自身抗體所針對的靶抗原提純開闢了新的思路和有效可行的技術路線。例如，其它的常見的自身抗體也能夠按本發明的製造工藝製造出純度高、抗原表位全面並能滿足免疫酶法檢測抗體的抗原。


圖1顯示rProtein A純化Jo-1 IgG的色譜圖。本圖為用rProtein A預裝柱從多發性肌炎患者的單一特異性Jo-1抗血清中純化出IgG的色譜圖。圖中橫坐標是流過色譜柱的溶液體積，縱坐標紫外(UV280)吸光值(單位mAu)，非保留峰和保留峰圖中分別在峰頂標有「上樣峰」和「洗脫峰」。
圖2顯示rProtein A純化Jo-1 IgG各組分在SDS-PAGE上的電泳圖(考馬斯亮藍染色)。圖中各泳道的上面分別註明色譜分離的各組分，「M」表示「Marker」即蛋白質分子量標記，膠的右側標註的數字是各蛋白質標記的分子量，單位是千道爾頓(KD)。血清、上樣峰、洗脫峰的蛋白質上樣量分別為11μg、13μg和5μg。
圖3顯示免疫親和色譜純化Jo-1抗原的色譜圖。圖中橫坐標表示流過色譜柱的溶液流量(單位ml)，縱坐標表示紫外(UV280)吸光值(單位mAu)，藍色曲線是紫外曲線，紅色曲線是電導曲線，非保留峰和保留峰圖中分別在峰右旁標有「上樣峰」和「洗脫峰」。
圖4顯示免疫親和色譜純化Jo-1抗原各組分在十二烷基磺酸鈉-聚丙希醯氨凝膠電泳上的電泳圖(硝酸銀染色)，圖中各泳道的上面分別註明色譜分離的各組分，「M」表示「Marker」即蛋白質分子量標記，膠的左側標註的數字是各蛋白質標記的分子量，單位是千道爾頓(KD)。粗抗原、上樣峰和洗脫峰的蛋白質上樣量分別是4μg、5μg和0.5μg。
圖5顯示免疫親和色譜純化Jo-1抗原各組分免疫印跡圖。圖中各泳道的上面分別註明色譜分離的各組分，「M」表示「Marker」即蛋白質分子量標記，膜的偏右側標註的數字是各蛋白質標記的分子量，單位是千道爾頓(KD)。粗抗原、上樣峰和洗脫峰的蛋白質上樣量分別是8μg、8μg和0.8μg。箭頭所指為免疫反應條帶。
圖6顯示免疫親和色譜純化Jo-1抗原各組分代表性的斑點印跡結果，膜上端分別註明色譜分離的各組分。粗抗原、上樣峰和洗脫峰第一行上樣量分別為2μl、16μl和1μl；由上往下依次倍比稀釋；Jo-1陽性抗血清的稀釋度為1∶25。粗抗原、上樣峰和洗脫峰中蛋白質濃度(UV280表示)分別是24.886AU、7.488AU和0.0016AU。
具體實施例方式
實施例1可提取性核抗原的提取和可提取性核抗原丙酮粉的製造1 取新鮮或-80℃凍存豬脾臟等動物組織，凍存組織需置4℃過夜(12小時以上)解凍復甦；2 稱量豬脾臟等組織100g，加入200ml勻漿緩衝液(0.01M PBS，PH7.0，乙二銨四乙酸二鈉0.01M，苯甲基磺醯氟1.5mM，二巰基蘇糖醇1mM，胰蛋白酶抑制劑4μg/ml，亞硫酸氫鈉1.5mM)，低速勻漿，30秒/次，間隔2分鐘/次，共十次；3 組織勻漿液磁力攪拌1-2小時；4 離心，4℃，10,000G，1小時；5 棄沉澱，取上清離心，4℃，100,000G，1小時；6 棄沉澱，將上清液置於燒杯中，邊攪拌邊徐徐加入5倍預冷丙酮；7 4℃，10,000G，離心30分鐘；8 棄上清，沉澱置燒杯中，用200ml預冷丙酮懸浮漂洗沉澱，磁力攪拌30分鐘；9 重複步驟7；10 棄上清，沉澱晾乾即為可提取性核抗原丙酮粉，稱重，計算回收率，-20℃密閉乾燥保存。
結果分析100g組織可製得5-7g可提取性核抗原丙酮粉，丙酮粉中的蛋白含量為20-24％。免疫雙擴散和免疫印跡結果顯示可提取性核抗原中的Jo-1抗原活性好。
實施例2免疫親和色譜柱的製造1瓊脂糖的環氧活化1)將瓊脂糖幹膠用去離子水(200ml/g)分3次漂洗，在布氏漏鬥上抽乾；2)把洗過的凝膠轉入氫氧化鈉水溶液中，接著加入環氧氯丙烷，它們在活化體系中的終濃度分別是凝膠30％(v/v)，環氧氯丙烷5％(v/v)，氫氧化鈉0.4M；3)使上述混懸液在溫和條件下震蕩，40℃的條件下反應2-3小時；4)將活化後的凝膠轉入布氏漏鬥中抽乾，用去離子水分次漂洗凝膠，待用。
2配體的製造1)把單一特異性Jo-1抗血清用等量結合緩衝液(20mM磷酸鈉緩衝液，pH＝7.0)混勻，用0.45μm濾器過濾；2)將上述處理後的抗血清上樣到rProtein A親和柱上，分管收集上樣峰；3)用結合緩衝液平衡5-10個柱體積；4)洗脫緩衝液(檸檬酸鈉緩衝液，pH＝3-4)3-5個柱體積洗脫，分管收集洗脫峰，及時用收集緩衝液(1-2M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液，pH＝9-10)中和。
5)用結合緩衝液平衡5-10個柱體積；6)測定、分析色譜分離各組分蛋白濃度及Jo-1抗體(IgG)滴度。
結果分析從色譜圖上可見，在洗脫時，洗脫峰呈現單峰，上升支急速上升，下降支回落迅速，沒有拖尾，呈現典型銳利的親和色譜洗脫峰，如圖1所示。洗脫峰在十二烷基磺酸鈉-聚丙希醯氨凝膠電泳上，血清和保留組份均可看到濃染的IgG重鏈(58KD)和輕鏈(29KD)，而非保留組分雖然上樣量較血清還大，但在IgG的重鏈和輕鏈位置幾乎看不到條帶存在，如圖2所示。免疫雙擴散結果顯示洗脫峰在最低蛋白濃度5.5mg/ml時，出現單一沉澱線，該沉澱線僅與Jo-1參比抗血清的沉澱線光滑融合，不與其他自身抗體參比抗血清的沉澱線相連。
3配體與基質的偶聯1)將Jo-1 IgG溶於偶聯緩衝液(0.5M碳酸鈉緩衝液，pH＝11.9)中；2)向上述溶液中加入活化後的瓊脂糖凝膠，配體/凝膠＝5-10mg/ml；3)25℃水浴震蕩偶聯24小時；4)測定偶聯前後偶聯體系中Jo-1 IgG濃度，計算偶聯率；5)偶聯配體的凝膠轉入布氏漏鬥中抽乾，用去離子水洗凝膠，直至中性，此時，凝膠可裝柱或放20％乙醇中保存。
結果分析偶聯前後偶聯體系中的IgG濃度分別為1.50mg/ml和0.39mg/ml，偶聯率(％)＝(偶聯前蛋白濃度-偶聯後蛋白濃度)/偶聯前蛋白濃度＝74％。
4裝柱1)偶聯了配體的凝膠混懸於結合緩衝液(0.01M磷酸鈉鹽水緩衝液，pH7.2，含氯化鈉0.5M或0.05M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸鹽水緩衝液(TBS)，pH7.2，含氯化鈉0.5M)中；2)色譜柱中注入1/2以上柱體積的結合緩衝液；3)打開色譜柱的下端出口，在液體流出的同時，從色譜柱的上端入口加入凝膠混懸液；4)按如下順序向色譜柱泵入緩衝液結合緩衝液-洗脫緩衝液-結合緩衝液，每種液體各5-10柱體積；5)裝好的色譜柱可注入20％的乙醇後保存於4℃或直接用於純化Jo-1抗原。
實施例3免疫親和色譜純化Jo-1抗原1)可提取性核抗原溶液對結合緩衝液透析16-24小時，透析過程至少換液5次，如果是可提取性核抗原丙酮粉，先用提取緩衝液抽提丙酮粉中的可提取性核抗原，再透析；2)用0.45μm濾器把可提取性核抗原溶液過濾，3)將可提取性核抗原溶液上樣到已準備好的Jo-1免疫親和色譜柱上，分管收集上樣峰；4)用結合緩衝液平衡親和柱5-10柱體積；5)用洗脫緩衝液(3-5M MgCl2)5-10柱體積洗脫，分管收集洗脫峰；6)用結合緩衝液平衡親和色譜柱5-10柱體積；結果分析從色譜圖上可見，在洗脫時，洗脫峰呈現單峰，上升支急速上升，下降支回落迅速，雖然稍有拖尾仍然呈現親和色譜的洗脫峰，如圖3所示。將各色譜組分進行十二烷基磺酸鈉-聚丙希醯氨凝膠電泳及免疫印跡分析發現，洗脫峰在十二烷基磺酸鈉-聚丙希醯氨凝膠電泳上有5個條帶，集中在45-60千道兒頓之間，如圖4所示；但在免疫印跡上只有大約50千道兒頓條帶與Jo-1抗血清起免疫反應，如圖5所示。斑點印跡和酶聯免疫吸附試驗顯示，洗脫峰只和Jo-1抗血清反應，不與其他自身抗體陽性血清起免疫反應。從上述結果可以看出，洗脫峰就是Jo-1抗原。
實施例4免疫親和色譜純化Jo-1抗原在檢測Jo-1抗體中的應用-斑點印跡檢測Jo-1抗體1)在硝酸纖維膜上用鉛筆畫上所需數量小方格；2)將Jo-1抗原點在硝酸纖維膜的小方格內；3)將加好樣的硝酸纖維膜放在室溫下晾乾；4)封閉用封閉緩衝液室溫封閉0.5-1小時；5)洗膜用洗膜緩衝液漂洗5分鐘/次×3；6)加入1∶25(v/v)的抗血清(封閉緩衝液稀釋)，室溫孵育1-2小時；
7)洗膜同「5)」；8)加入辣根過氧化物標記兔抗人IgG二抗(按說明書用封閉緩衝液稀釋)，室溫孵育0.5-1小時；9)洗膜同「5)」；10)顯色加入新鮮配製的底物液(溶於0.05M的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液，pH7.6的DAB+H2O2)，顯色清楚後，加入磷酸鈉鹽水緩衝液終止反應；11)觀察記錄結果，用保鮮膜將膜包好，保存。
用斑點印跡在一組自身免疫性疾病和正常對照中檢測Jo-1抗體的檢測結果如表1所示。
表1 斑點印跡檢測Jo-1抗體的結果

斑點印跡在這一組血清中的檢測結果顯示Jo-1抗體在多發性肌炎中的陽性率是30％，其它自身免疫性疾病和健康對照中Jo-1抗體都是陰性。
實施例5免疫親和色譜純化Jo-1抗原在檢測Jo-1抗體中的應用-用酶聯免疫吸附試驗1)包被抗原用包被緩衝液稀釋免疫親和色譜純化的Jo-1抗原，抗原的終濃度為0.5μg/100μl。取前述抗原溶液包被微量96孔酶聯免疫吸附試驗板，100μl/孔，4℃過夜；2)漂洗用漂洗緩衝液漂洗3分鐘/次×2，200μl/孔；3)封閉用封閉緩衝液室溫封閉1-2小時，200μl/孔；4)漂洗用漂洗緩衝液漂洗3分鐘/次×3，200μl/孔；5)一抗反應加入用稀釋緩衝液(10mM，pH＝7.5磷酸鈉-鹽水緩衝液溶解的5％脫脂奶粉)稀釋待測血清，稀釋度1∶100，100μl/孔，室溫孵育2小時；6)漂洗同「4)」；7)二抗反應加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人二抗，100μl/孔，室溫孵育2小時；8)漂洗同「4)」；9)顯色加入底物緩衝液(枸櫞酸-乙酸鈉，pH＝5-6)稀釋的TMB(10mg/ml，溶於DMSO)，100μl/孔，顯色滿意後用終止緩衝液(2M H2SO4)終止顯色反應；10)讀板和記錄雙波長(450nm/630nm)酶標讀數儀讀吸光值，記錄結果並進行結果分析。
結果如表2所示。
表2 酶聯檢測Jo-1抗體的結果

權利要求
1.一種可用於多發性肌炎或皮肌炎或抗-Jo-1抗體綜合症診斷的Jo-1抗原的提純方法，包括下列步驟A將哺乳動物組織，例如豬、牛、兔、羊、鼠等的脾臟、肝臟、胸腺等，特別是豬的脾臟置於鹽水緩衝液中，用勻漿器製成勻漿，勻漿液離心後收集上清液，製成可提取性核抗原；B可提取性核抗原對結合緩衝液透析後上樣到經結合緩衝液平衡的免疫親和色譜柱上，然後用洗脫緩衝液洗脫，收集洗脫組分，此即Jo-1抗原。
2.權利要求1的提純方法，進一步在步驟A和B之間包括向可提取性核抗原溶液中加入預冷丙酮，製成可提取性核抗原丙酮粉；免疫親和柱用3-5M的氯化鎂做為洗脫緩衝液。
3.根據權利要求1的提純方法，其中免疫親和色譜柱通過下列步驟來製備A把水洗過的瓊脂糖凝膠置於水中，加入環氧氯丙烷和氫氧化鈉進行環氧法活化凝膠基質；B將活化後的瓊脂糖凝膠水洗後置於溶有配體的偶聯緩衝液中偶聯配體；C必要時，偶聯配體的凝膠清洗後放乙醇(例如20％乙醇)中保存。
4.根據權利要求1的提純方法，其中免疫親和色譜柱的製備包括如下步驟A把水洗過的瓊脂糖凝膠置於水中，加入環氧氯丙烷和氫氧化鈉進行環氧法活化凝膠基質；B將活化後的瓊脂糖凝膠水洗後置於溶有配體的偶聯緩衝液中偶聯配體；C必要時，偶聯配體的凝膠清洗後放乙醇中保存；D向色譜柱注入佔柱體積1/2以上的結合緩衝液，打開柱的下端出口使液體流出；E偶聯有配體的凝膠懸浮於結合緩衝液中，把凝膠混懸液從色譜柱的上端入口加入色譜柱中；F繼續用結合緩衝液清洗色譜柱至5倍柱床體積以上。
5.根據權利要求3或4的提純方法，其中所述配體為特異性Jo-1抗血清。
6.一種檢測多發性肌炎或皮肌炎或抗-Jo-1抗體綜合症的方法，其特徵在於使用由權利要求1-4的任一項的方法獲得的抗原檢測生物樣本中的Jo-1抗體。
7.一種可用於檢測多發性肌炎或皮肌炎或抗-Jo-1抗體綜合症的斑點印跡試劑盒，其特徵在於包括硝酸纖維素膜和膜上包被的由權利要求1-4的任一項的方法獲得的Jo-1抗原。
8.一種可用於檢測多發性肌炎或皮肌炎或抗-Jo-1抗體綜合症的酶聯免疫吸附試驗試劑盒，其特徵在於包括微量孔酶聯免疫吸附試驗板，孔中包被的由權利要求1-4的任一項的方法獲得的Jo-1抗原。
9.由權利要求1-4的任一項的方法獲得的高純度Jo-1抗原。
10.一種可用於提純Jo-1抗原的免疫親和預裝柱，它通過下列步驟製備A把水洗過的瓊脂糖凝膠置於水中，加入環氧氯丙烷和氫氧化鈉進行環氧法活化凝膠基質；B將活化後的瓊脂糖凝膠水洗後置於溶有配體的偶聯緩衝液中偶聯配體；C必要時，偶聯配體的凝膠清洗後放乙醇中保存；D向色譜柱注入佔柱體積1/2以上的結合緩衝液，打開柱的下端出口使液體流出；E偶聯有配體的凝膠懸浮於結合緩衝液中，把凝膠混懸液從色譜柱的上端入口加入色譜柱中；F繼續用結合緩衝液清洗色譜柱至5倍柱床體積以上。
全文摘要
本發明涉及一種可用於多發性肌炎/皮肌炎診斷的抗原Jo－1抗原的提純工藝方法，所述方法為免疫親和色譜與其它蛋白質提純技術的特定組合。本發明同時涉及Jo－1免疫親和色譜柱的製備方法。本發明還涉及通過所述方法製備的、以合宜生物組織為原料的Jo－1抗原。本發明同時進一步涉及高效率親和色譜分離條件的建立。本發明也包括用純化的Jo－1抗原製造可供臨床推廣的免疫測定試劑盒及應用。此外，本發明也為其他自身免疫性疾病特異性抗體的檢測方法提供了一種製造工藝途徑。
文檔編號C07K1/22GK1740196SQ20051009327
公開日2006年3月1日 申請日期2005年8月23日 優先權日2005年8月23日
發明者姚志建, 唐福林, 朱材忠, 陳華, 彭鯤鵬 申請人:北京諾賽基因組研究中心有限公司, 中國醫學科學院北京協和醫院