一種啟動子SbUbi2、其製備方法及用途的製作方法

2023-06-06 10:08:36

專利名稱：一種啟動子SbUbi2、其製備方法及用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物分子生物學領域，涉及一種啟動子，特別是一種植物例如甜高粱的啟動子，以及所述啟動子的製備方法及用途。
背景技術：
啟動子是基因的一個組成部分，通常位於結構基因5』端上遊，是RNA聚合酶識別、 結合和開始轉錄的一段DNA序列。啟動子能夠指導全酶(holoenzyme)同模板正確結合，活化RNA聚合酶，啟動基因轉錄，從而控制基因表達(轉錄)的起始時間和表達的程度。在轉基因植物中，啟動子是影響轉基因表達效率的重要因素之一，選擇高效率的啟動子是高效率表達外源基因的關鍵。
根據啟動子的轉錄模式可將其分為3類組成型啟動子、組織或器官特異性啟動子和誘導型啟動子。所謂組成型啟動子是指在組成型啟動子調控下，不同組織器官和發育階段的基因表達沒有明顯差異，因而稱之組成型啟動子。
目前廣泛應用的一種組成型啟動子為CaMV35S，它在單子葉植物和雙子葉植物中都產生較高效率的表達，但Ajith Anand等將水稻幾丁質酶基因chitinase轉入小麥，發現使用CaMV35S作為啟動子時，轉入的植株到第二代時chitinase全部表現出基因沉默，而使用玉米泛素WDiquitin啟動子，在第四代時，該基因的表達量仍然較大(AjithAnand等， Plant Biotechnology Journal,2003(1) :241-251)。
人們高度重視從植物本身克隆組成型啟動子。例如泛素(WDiquitin)和肌動蛋白 (Actin)等基因的啟動子已被克隆。用這些啟動子代替CaMV 35S啟動子，可以更有效地在植物中驅動外源基因的轉錄。
泛素⑴biquitin，Ubi)啟動子廣泛存在於真核生物中，在增強基因表達的長期性，穩定性等方面有顯著功效，並且以啟動效率高、甲基化程度低、遺傳性狀穩定等因素而倍受青睞(謝偉，樂超銀.三峽大學學報，2007, ) :176-179)。
Ubi啟動子能夠有效促進外源基因的長期穩定高效表達，現在已經有很多的Ubi 啟動子在單子葉植物和雙子葉植物中得到應用。並且W^i啟動子跟源於T-DNA的n0S、0CS、 mas和源於病毒的CaMV35S、CsVMV等啟動子相比，具有更高水平的轉錄調節作用。郭殿京等(遺傳學報，1999, ) :168-173)發現在轉基因小麥愈傷組織中，W^i啟動子的效率最高，是CaMV35S啟動子的4-5倍。Genschik等(Gene, 1994，148 :195-202)將分離得到菸草泛素基因Ubi. U4的啟動子序列導入轉基因菸草中啟動GUS表達，結果表明Ubi. U4啟動子啟動⑶S基因的表達量是CaMV35S的7倍。
隨著植物基因工程的發展，人們不再滿足把特定的外源基因轉入受體植物，而是要外源基因特定而高效的表達。外源基因表達量不足往往是得不到理想轉基因植物的重要原因，而啟動子在決定基因表達方面起到關鍵作用(侯丙凱等.遺傳，2001，23(5) 492-497)。利用Ubi啟動子在細胞體內持久而高水平的轉錄調節作用，將其整合至附加型的載體中，可獲得高水平的表達系統，因而在轉基因植物中，泛素啟動子有巨大的應用潛力。
目前，已經從很多泛素基因中分離得到啟動子序列，包括玉米基因組中的WDi-I 啟動子、水稻泛素RUBQ2啟動子、擬南芥泛素啟動子、向日葵泛素WdBI啟動子、菸草泛素 Ubi. U4啟動子、馬鈴薯泛素啟動子、番茄泛素W^il-I啟動子、大麥泛素Mubl啟動子等等。其中，玉米泛素W^i-I啟動子已經廣泛應用於玉米、小麥、水稻等單子葉植物中，水稻泛素RUBQ2啟動子在水稻和甘蔗中也有較多的應用。

發明內容
為了給植物研究中調控目的基因表達提供一種新的工具和選擇，本發明人通過對甜高粱基因組的深入研究，提供了一種新的泛素啟動子，所述啟動子能夠用於調控植物中目的基因表達。
本發明的一個方面，提供了一種具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的植物啟動子。 在本發明中，所述啟動子的具體鹼基序列長度為2330個鹼基，如SEQ ID NO 1所示 TAAGGACTGTCGTTTACTTGCATTTCAGTTGATCGTATCTAGATAGTCTGAGATGTTACTGCTAGTAAA GAAAAGTTTGTCTTAGTTGATGACATGTAGATAACATGAGATGCTACTGCGGGTAAAGAAAATCAATAGTATGCTCA ACCTATTGTCTTGCATTTTCATCTTGATTTATTTAGGCACTATTGGATGATATTAAATGCCGTGCTCTGTCGTATAA AAATCCTGCCCCTTGGACCATTTTTTCTATGGTGGAATGTGCATAGAGTTAATGAAATTGTCGTGTTCTGTGAATAT CCCATTTAACTTTGGAGCACTGCAGTCCACAAGGAGGGCCATCTGCCTGACAGGATCAAACTTTGTTTTTGTCATTA GCAGTCATTTGTCTTGTTTATGCTAACAATGATTCAGAATTATAATCATACGGGTTAAGATTCTGCACAATATAAAC TGGGAGGTAGTTCCTTGAAACTCTTCAAATAATCTAGCAAGTCTGCAACAGCTTCTGTCATGTCAGGCACTTCTGCT GAGTTAAATAATTGTTGAATTAGCATTTCTCTCCTGATAGAGTGACCTCAAATACCTATCTCTGCTATGAGCATTTC CTAGTTAAGCTACAGAATGTTTGGTTTATAATTATTACTAAATAGATTGATCTGAATGTTTCCTAGTTAATCAACAT AACCTTTGAGTTGAGATGGTCAAATTGGTCTTCCATTTTTATAAAGTTAATCACAGACATGCTTAACATTACAAGCT AAGTCTCCAGTCCAAAAGGTTGTCCTTTTGCATGTCTATGATAATCAAACTTTATGCATTCTACTCATTTGTATGTT GACTGAAAATTTTGCCTGGTGCATGCATTTTATAATTTGCTGGAAAGATAGGCTGGCATGGTACTAGAGTTTCTTGA CAAGCACACCGAGTCTTGACGAGTTACTGTTAGTATCAGGTAAGTCACCATTAATCCTTTTGACACCTTTTTTTATT TTGCATAACTTTTTAACTTGTTTGTTCGATGCTACAGGATTCTTTTACATGCACCAATAGGAAGATGTACCTTACCC CTTTTACAAACAATAATTTTGACAAGGACACTTATTCCATTTTAAAGATCAAAACAATGCAAAACTGTCAGTCACTG CGCCAATTTTAAAGATCAGAACCTAAGTCAAATAATGTCAATAGCTCCTATGTGAACCTAAGTGAAATTACTTCGTT GACATTAAGTGTGATGTAGCTTCTTCAAGTAATGCCTATCAGTGTTAAGTCTACAAGTGCTCAGGGTAACATGGGGG AAAAGGGAGCTACTGTGCTTAGTTAACCTCTAGGCTGGATGCAGTGTTGTGTTATCCTCATCCTGGACGGAGGGGAA CCCTTGATATTCTGAGGAAGAATGTACCAGTCTGGTAATGACGATCATGACACAATTGTCGGAGTTGATTTCCTGAC TGGTTTTCTGATATGGATTATATTGGTCCCGAGCCTGCTTCATTACTAATCTGTATTTCTCCCAATATTGGTTGTTT ATGTGGAGTGTATGCTTCTGATTATTTGGACCCTCTTGAG TCTTGACCTTTACTCCTGAATTTCGATATATATGCT TTGGTTATCACGTTGCTGGATCATTATAACCATATATGCTAGAATTTGCTTGTCAAAAAGGACCATCAACTAGAGCC TGGAGTAGACGAGTTCCAGAACTGAGATAGGATGGTAGAAACAAAGCACATTTTCCAGAGGGAAACAAAGTGGCCTG TGCATTCAATGCTGAGACTATAAAAGGTAAAAACAGTTCACCTTTTTGCTCCGACTTGGCGGGATGTGTGCATTTTC TGATTTGTTAAGAAGCTCTAAGTGACTCTAGGTCGGATCTGCTTCCATCTTTCTTTGTATGAGGAACCTTGTTGAAA GTCCGCTCGTTGCTTATTCCTTATCAGGCTAATGTAACTATGTTCCTGAAGGAAACCTTCTTTTGGATTAACCTGGATTTAGGGATAAAACCTTCTTGTGGTAGCCTTTACCACAACATGCATCCTCCTGCTGATTAGCTAGATATGCATGCTT GCTACTGTTCAATGATTCTTTAGTATACCTGATCATGCATGCTCTTGTTACTTAGCTTGATATACTTGGATGATGAC ATGCTGCTGTCGTTCACTGTTTCTATACCTGATGATCATGCATGCTCTTGTTACTTGTTTTGATATACTTGGTTCGA TGGTGATGAACACAGAACACACATGACATGATGTTGCTGTTTGCATGAGGCTGTTTCGTTGGTCTACTGCCAGATAC TTCCCCTGTTGTTTGGTTATCTTCTGCAG(SEQ ID NO 1) 在本發明中，將SEQ ID N0:1所示的啟動子序列稱為啟動子SWbi2，也簡稱為 P605。
該啟動子為組成型啟動子，也是泛素啟動子，帶有該啟動子和GUS的水稻愈傷組織以及轉基因水稻苗經GUS染色實驗後，所述水稻愈傷組織和轉基因水稻苗的根、莖、葉等都變藍色。
本發明的又一方面，涉及具有與SEQ ID NO :1所示核苷酸序列互補的序列的啟動子。
本發明的又一方面，還涉及SEQ ID NO :1所示植物啟動子的具有啟動子功能的選自如下的變體 1)在高等嚴緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列， 2)對SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進行一個或多個鹼基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，和 3)與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。
典型地，「雜交條件」根據測量雜交時所用條件的「嚴緊性」程度來分類。嚴緊性程度可以以例如核酸結合複合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據。例如，「最大嚴緊性」典型地發生在約Tm-5°C (低於探針Tm 5°C )；「高等嚴緊性」發生在Tm以下約5_10°C;「中等嚴緊性」發生在探針Tm以下約10-20°C ；「低嚴緊性」發生在Tm以下約20-25°C。作為替代，或者進一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強度條件和/或一或多次的嚴緊性洗滌為依據。例如，6XSSC =極低嚴緊性；3XSSC =低至中等嚴緊性；IXSSC =中等嚴緊性； 0. 5XSSC =高等嚴緊性。從功能上說，可以採用最大嚴緊性條件確定與雜交探針嚴緊同一或近嚴緊同一的核酸序列；而採用高等嚴緊性條件確定與該探針有約80%或更多序列同一性的核酸序列。
對於要求高選擇性的應用，典型地期望採用相對嚴緊的條件來形成雜交體，例如， 選擇相對低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，實驗室手冊，Cold Spring HarborPress, Plainview, N. Y.)提供了包括中等嚴緊性和高等嚴緊性在內的雜交條件。
為便於說明，用於檢測本發明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴緊條件包括用 5XSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(ρΗ8· 0)溶液預洗；在 50-65°C下在 5XSSC 中雜交過夜；隨後用含0. SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65°C下各洗滌兩次20分鐘。 本領域技術人員應當理解，能容易地操作雜交嚴緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜交溫度。例如，在另一個實施方案中，合適的高度嚴緊雜交條件包括上述條件，不同之處在於雜交溫度升高到例如60-65°C或65-70°C。
在本發明中，所述在高等嚴緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，其具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動子活性。
在本發明中，所述對SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進行一個或多個鹼基的取代、 缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時在所述核苷酸序列的5』端和/或3』端，和 /或序列內部進行例如不超過2-45個，或者不超過2-30個，或者不超過3-20個，或者不超過4 -15個，或者不超過5-10個，或者不超過6-8個的分別用逐個連續整數表示的鹼基的取代、缺失、添加修飾。
在本發明中，所述對SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進行如上述一個或多個鹼基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列具有與SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動子活性。
通過一種多核苷酸進行說明，其所具有的核苷酸序列例如與SEQID NO 1的參考核苷酸序列至少具95%的「同一性」是指在SEQ IDNO 1的參考核苷酸序列之每100個核苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達5個核苷酸的不同外，該多核苷酸之核苷酸序列與參考序列相同。換句話說，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%相同的多核苷酸，參考序列中多達5%的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些核苷酸插入參考序列中，其中插入的核苷酸可多達參考序列之總核苷酸的5% ；或在一些核苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達參考序列之總核苷酸的5%。參考序列的這些突變可發生在參考核苷酸序列的5』或3』末端位置，或在這些末端位置之間的任意地方，它們或單獨散在於參考序列的核苷酸中，或以一個或多個鄰近的組存在於參考序列中。
在本發明中，用於確定序列同一性和序列相似性百分數的算法是例如BLAST和 BLAST 2.0 算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 :3389-3402 和 Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。採用例如文獻中所述或者默認參數，BLAST 和BLAST 2.0可以用於確定本發明的核苷酸序列同一性百分數。執行BLAST分析的軟體可以通過國立生物技術信息中心(NCBI)為公眾所獲得。
在本發明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列包括與SEQ ID NO :1所公開序列基本同一的多核苷酸序列，例如當採用本文所述方法(例如採用標準參數的BLAST分析)時，與本發明多核苷酸序列相比含有至少 90%序列同一性、優選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的序列同一性的那些序列。
在本發明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動子活性。
本發明中，所述的啟動子來源於單子葉植物，具體地，為甜高粱，例如為甜高粱 BTX623(2010年4月1日保藏於湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心，即中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC P201005)。
本發明的又一方面，還涉及一種含有本發明所述植物啟動子的重組載體。所述重組載體可以通過將上述啟動子插入到克隆載體或表達載體而得到。
適於構建本發明所述重組載體的克隆載體包括但不限於，例如pUC18、pUC19、 pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T SimpleVecter、pMD19_T Simple Vecter 等。
適於構建本發明所述的表達載體包括但不限於，例如pBI121、pl3W4、pGEM等。
在本發明的一個實施方案中，所述重組載體為p8+P605重組載體。
本發明的又一方面，還涉及含有本發明所述植物啟動子的所述重組載體的重組細胞。所述重組細胞可以通過將含有本發明所述植物啟動子的所述重組載體轉化至宿主細胞而得到。
適於構建本發明所述重組細胞的宿主細胞包括但不限於，例如根癌農桿菌細胞 LBA4404、EHA105、GV3101 等。
在本發明的一個實施方案中，所述重組細胞為重組根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105-P605o 本發明的又一方面，還涉及一種植物愈傷組織，所述愈傷組織轉化有本發明所述的啟動子。在本發明的一個實施方案中，所述植物為水稻。所述水稻包括但不限於，例如 中花9、中花10、中花11、臺北309、丹江8號、雲稻2號、汕優63、汕優608、豐優22，黔優88、 II優416,11優107,11優128,11優718、準兩優527、川農1號、雜0152、皖稻88、皖稻90、 皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻 197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101 (上述水稻品種均可購自安徽徽商農家福有限公司)等。在本發明的又一實施方案中，所述水稻為日本晴(Oryza sativa L. s sp. japonica cv. Nipponbare)，其中水稻日本晴種子 2009 年 12 月 18 日保藏於湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心，即中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為 CCTCC P200910。
本發明的又一方面，還涉及一種製備本發明所述啟動子的方法，包括如下步驟 1)根據SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，設計PCR擴增引物對， 2)以甜高粱BTX623基因組DNA為模板，使用步驟1)中所設計的PCR擴增引物對進行PCR擴增。
本領域技術人員周知，可以根據待擴增的目的核苷酸序列按照鹼基互補原則設計相應的PCR擴增引物對。在本發明的一個實施方案中，所述PCR擴增引物對如SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 所示。
本發明的又一方面，還涉及一種調控植物中目的基因表達的方法，所述方法包括用本發明所述植物啟動子轉化植物的愈傷組織的步驟。在本發明的一個實施方案中，所述植物愈傷組織的轉化利用了含有本發明所述植物啟動子的重組細胞。在本發明的一個實施方案中，所述植物愈傷組織的轉化過程中利用了前述的重組根癌農桿菌EHA105-P605。在本發明的一個具體實施方案中，所述植物的愈傷組織為水稻愈傷組織，具體地，所述水稻為日本晴。
在本發明中，可採用植物基因轉化技術將目的基因插入到植物基因組中，包括農桿菌介導轉化、病毒介導的轉化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉化和電穿孔等。本領域周知，農桿菌介導的基因轉化常被用於單子葉植物和雙子葉植物的基因轉化，但其它轉化技術也可用於本發明所述單子葉植物的基因轉化。當然，適於本發明的轉化單子葉植物的另一種方法是粒子轟擊(顯微金或鎢粒子包覆轉化的DNA)胚性愈傷組織或胚胎開發。另外， 還可以採用的轉化單子葉植物的方法是原生質體轉化。基因轉化後，採用通用的方法來篩選和再生整合有表達單元的植株。
本發明中，可利用所述植物啟動子調控目的基因表達的植物包括但不限於，例如 水稻、小麥、玉米、小米、甘蔗、甜高粱、大麥等。
本發明的又一方面，還涉及本發明所述植物啟動子在植物中調控目的基因表達的應用。在本發明的一個實施方案中，所述植物為單子葉植物。在本發明的一個實施方案中， 利用本發明所述啟動子調控的目的基因是GUS。在本發明的一個實施方案中，所述單子葉植物為水稻，具體地所述水稻為日本晴。
為實現上述調控目的基因表達的目的，本發明所述啟動子可以以單拷貝和/或多拷貝的形式應用，也可以與現有技術中已知的啟動子和或增強子聯用。
本發明的又一方面，涉及本發明所述啟動子在水稻育種中的用途。所述水稻為日本晴、中花9、中花10、中花11、臺北309、丹江8號、雲稻2號、汕優63、汕優608、豐優22，黔優88、II優416、II優107、II優128、II優718、準兩優527、川農1號、雜0152、皖稻88、 皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻 195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101。在本發明的一個實施方案中，所述水稻為日本晴。
本發明的啟動子可成為一種新的啟動子，作為植物例如水稻，轉基因的工具啟動子。本發明的啟動子由於是組成型啟動子，同時還可跨物種調控目的基因的表達，故本發明的啟動子可為多種植物育種提供便利，如低表達基因轉化苗篩選、植物花器官敗育等分子育種研究，將可能極大的縮短優良品種的選育時間。
本發明的啟動子可廣泛用於培育水稻、小麥、玉米、小米、甘蔗、甜高粱、大麥等植物。
發明的有益效果 本發明人通過生物信息學研究獲得一種來源於甜高粱的泛素啟動子，並採用生物學實驗驗證了所述啟動子P605的功能，該啟動子具有跨物種調控目的基因表達的作用，為組成型啟動子。具體地，所述啟動子能夠在水稻中調控GUS基因表達在水稻的愈傷組織、 水稻轉基因小苗的根、莖、葉中都能調控gus基因的高效表達。


圖1是啟動子P605的PCR擴增檢測結果，其中，泳道M:200bp DNALadder Marker, 其左側的數字表示所指向的Ladder Marker的條帶的大小，單位都是bp ；泳道1 :PCR擴增產物。
圖2是用於構建p8質粒的pCAMBIA-1301質粒示意圖。
圖3是p8質粒示意圖中多克隆位點和GUS序列部分的示意圖。
圖4是p8質粒示意圖。
圖5是經轉化的水稻愈傷組織的GUS染色結果。其中，由帶有本發明所述啟動子 P605序列的重組根癌農桿菌P8+P605轉化的水稻愈傷組織(左)經⑶S染色後呈現藍色； 不帶有本發明啟動子序列的重組根癌農桿菌p8質粒的水稻愈傷組織(對照，右)經⑶S染色後顏色未發生變化。
圖6是經過轉化的轉基因水稻苗的GUS染色結果。其中，由帶有本發明所述啟動子P605序列的重組根癌農桿菌p8+P605轉化的水稻苗(左)經⑶S染色後，其根、莖、葉呈現藍色；不帶有本發明啟動子序列的重組根癌農桿菌P8轉化的水稻苗(對照，右)經GUS 染色後其根、莖、葉的顏色未發生變化。
8
具體實施例方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著， 黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
實施例1 :P605啟動子片段的PCR擴增和dMD18_T+P605重組載體的構津 PCR 擴增 使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒， 目錄號DP320-(^)提取甜高粱BT X 623種子的基因組DNA，根據該啟動子在甜高粱 BT X 623gDNA中的序列，分別在首尾設計一對PCR特異性擴增引物(上遊引物Fl，加限制性酶切位點Kpn I和保護鹼基，下遊引物R1，加限制性酶切位點Sbf I和保護鹼基)。以上述提取的甜高粱BTX623的gDNA為模板，使用高保真Ex Taq(TaKaRa, DRR100B)聚合酶進行 PCR擴增。如表1所示。
表1基因啟動子擴增的PCR體系
權利要求
1.一種具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列或與其互補的核苷酸序列的啟動子，或其具有啟動子功能的選自如下的變體1)在高等嚴緊條件下與SEQID NO :1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對SEQID NO :1所示的核苷酸序列進行一個或多個鹼基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，和3)與SEQID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。
2.一種重組載體，其特徵在於，所述重組載體含有權利要求1所述的啟動子，具體地， 所述重組載體為P8+P605重組載體。
3.一種含有權利要求2所述重組載體的重組細胞。
4.權利要求3所述的重組細胞，其為重組根癌農桿菌EHA105-P605。
5.一種植物愈傷組織，其特徵在於，所述愈傷組織轉化有權利要求1所述的啟動子，具體地，所述愈傷組織為水稻愈傷組織，更具體地，所述水稻為日本晴、中花9、中花10、中花 11、臺北309、丹江8號、雲稻2號、汕優63、汕優608、豐優22,黔優88、II優416、II優107、 II優128、II優718、準兩優527、川農1號、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻 201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101，特別具體地，所述水稻為日本晴。
6.一種製備權利要求1中所述的啟動子的方法，包括如下步驟1)根據SEQID N0:1所示的核苷酸序列，設計PCR擴增引物對，具體地，所述PCR擴增引物對為 SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO :3。2)以甜高粱BTX623基因組DNA為模板，使用步驟1)中所設計的PCR擴增引物對進行 PCR擴增。
7.—種調控植物中基因表達的方法，所述方法包括用權利要求1所述的啟動子轉化植物的愈傷組織的步驟，具體地，所述愈傷組織為水稻愈傷組織，特別具體地，所述水稻為日本晴。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述植物愈傷組織的轉化過程中利用了權利要求 4所述的重組根癌農桿菌EHA105-P605。
9.權利要求1所述的啟動子在調控植物中目的基因表達的用途，其中所述目的基因為 GUS,所述植物為水稻，具體地，所述水稻為日本晴。
10.權利要求1所述的啟動子在水稻育種中的用途，具體地，所述水稻為日本晴、中花 9、中花10、中花11、臺北309、丹江8號、雲稻2號、汕優63、汕優608、豐優22，黔優88、II 優416、II優107、II優128、II優718、準兩優527、川農1號、雜0152、皖稻88、皖稻90、 皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻 197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101，更具體地，所述水稻為日本晴。
全文摘要
本發明屬於植物分子生物學領域，涉及一種啟動子SbUbi2、其製備方法及用途。本發明所述啟動子具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或其具有啟動子功能的選自如下的變體1)在高等嚴緊條件下與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對SEQ ID NO1所示的核苷酸序列進行一個或多個鹼基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，和3)與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。本發明還涉及所述啟動子的製備方法以及所述啟動子在調控植物中目的基因表達和水稻育種中的用途。
文檔編號C12N1/19GK102206640SQ20101015418
公開日2011年10月5日 申請日期2010年4月23日 優先權日2010年4月23日
發明者張耕耘, 倪雪梅, 黃剛, 張印新 申請人:深圳華大基因科技有限公司