一種川芎提取物，其製備方法和用途的製作方法

2023-06-06 11:46:46

專利名稱：一種川芎提取物，其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於中藥化學領域，具體涉及一種川芎提取物、其製備方法和用途。
背景技術：
冠狀動脈粥樣硬化性心臟病主要由冠狀動脈粥樣硬化、炎症(風溼性、梅毒性、川崎病和血管閉塞性脈管炎等)、冠狀動脈痙攣、栓塞、結締組織疾病、創傷和先天性畸形等多種原因導致心肌缺血、缺氧，主要症狀為心絞痛和心肌梗死心臟病發作。由於冠心病絕大多數(95-99%)由冠狀動脈粥樣硬化引起。傳統理念認為動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種因脂質積累疾病，因而降脂治療一直是抗動脈粥樣硬化藥物研發及動脈粥樣硬化治療的重點。臨床常用的他汀類藥物其作用機制為通過抑制HMG-CoA還原酶(HMG-CoAreductase)而阻斷膽固醇的生物合成，發揮降脂作用，從而實現抗動脈粥樣硬化作用。川彎為傘形科植物川彎Ligusticum chuanxiong Hort.的乾燥根莖,其性味辛，溫。歸肝、膽、心包經。活血祛瘀作用廣泛，適宜瘀血阻滯各種病症，可治頭風頭痛、風溼痺痛等症。現代藥理學研究表明，川芎提取物對離體豚鼠心臟有劑量依賴性抑制作用，對離休大鼠或豚鼠心臟均具有顯著的增加冠脈流量作用，其主要活性成分川芎嗪能擴張大鼠肺血管，抑制缺氧性肺血管收縮反應和右心室肥大。此外，川芎還具有中樞神經系統抑制作用，對動物大腦的活動具有抑制作用，而對延腦呼吸中樞、血管運動中樞及脊髓反射中樞具有興奮作用。但目前研究大都集中在川芎嗪和阿魏酸等成分，對於川芎內酯提取物是否具有降脂及抗動脈粥樣硬化活性尚不清楚。本發明提供了一種川芎(拉丁名=RhizomaChuanxiong)提取物，該提取物具有較好的降血脂及抗動脈粥樣硬化效果。

發明內容
本發明的第一方面提供一種川芎提取物，其含有質量百分比約為30 90%的藁本內酯，優選地，該提取物中含有質量百分比為37 85%的藁本內酯，更優選地，該提取物中含有質量百分比約為37%的藁本內酯，更優選地，該提取物中含有質量百分比約為85%的藁本內酯。本發明的第二方面提供一種第一方面所述的川芎提取物的製備方法，包括以下步驟I)川芎經乙醇浸泡後，用乙醇加熱回流提取，然後將提取液濃縮，得濃縮液；2)將步驟I)獲得的濃縮液加至水中分散成混懸液，經石油醚萃取合適的次數，合併萃取液，回收溶劑至幹；可選擇地，按照以上步驟重複萃取一次，回收溶劑至幹，得到萃取濃縮物；3)將步驟2)獲得的萃取濃縮物過矽膠柱，以石油醚和乙酸乙酯的混和液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，濃縮後得到淡黃色液體。在本發明的一個實施方案中，步驟3)中所述的洗脫液進一步經過薄層色譜紫外分析，合併在365nm紫外線燈照射下藍色螢光斑點的洗脫液，減壓濃縮得到淡黃色液體；優選地，步驟3)中石油醚與乙酸乙酯的體積比為50 I ；優選地，步驟3)中薄層色譜的展開劑為石油醚與乙酸乙酯的混合物，優選地，石油醚與乙酸乙酯的體積比為25 I。在本發明的一個實施方案中，上述製備方法，其中，步驟I)中所用的乙醇濃度為90% -100%，優選為 95% ；優選地，步驟I)中所述的浸泡時間為8 12小時，優選為10小時；優選地，步驟I)中提取時間為1-3小時，提取次數為I至5次，更優選地，提取時間為2小時,提取次數為3次；優選地，步驟I)中所述的濃縮液相對水的密度為I. I I. 5 ;優選地，步驟I)或步驟3)中所述的濃縮方式為減壓濃縮，更優選地濃縮方式為採用旋轉蒸發儀減壓濃縮。本發明的第三方面提供一種藥物組合物，其含有本發明第一方面所述的川芎提取物，以及任選的藥學可接受的輔料。所述的藥學可接受的輔料是本領域技術人員公知的。所述的藥物組合物可根據需要，按照本領域技術人員公知的技術製成各種常用劑型，優選製成膠囊劑、片劑、滴丸劑等劑型。本發明的第四方面提供本發明第一方面所述的川芎提取物或第二方面所述的藥物組合物在製備用於抗動脈粥樣硬化的藥物中的用途。本發明的第五方面提供本發明第一方面所述的川芎提取物或第二方面所述的藥物組合物在製備用於降血脂的藥物中的用途。發明的有益效果本發明的藥物組合物中含有質量百分比約為30 90%的藁本內酯，能夠有效地降血脂、有效抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成，能夠用於降血脂、抗動脈粥樣硬化。本發明公開的藥物組合物製備方法高效簡便，能夠獲得純度較高的)I丨芎提取物。


圖I川芎提取物液相色譜-質譜聯用分析譜圖；圖2ApoE-/_小鼠動脈粥樣硬化斑塊病理切片圖。
具體實施例方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。實施例I川芎提取物的製備I)稱取Ikg川彎，95%乙醇浸泡10小時後，用4000ml 95%乙醇加熱回流提取3次，每次2小時，合併提取液，旋轉蒸發儀減壓濃縮至相對水的密度為I. 5的濃縮液。2)將濃縮液加至500ml水中分散成混懸液，500ml石油醚萃取3次，合併萃取液，回收溶劑至幹，再按照以上步驟重複萃取一次，回收溶劑至幹，得到萃取濃縮物。
3)取步驟2)獲得的萃取濃縮物，經200-300目正向矽膠柱分離(粗孔矽膠購自青島海洋化工廠分廠)，柱高50cm，柱徑4. 45cm。以石油醚和乙酸乙酯的混和液為洗脫劑進行洗脫，洗脫液的用量為6倍柱體積，其中石油醚乙酸乙酯=50 1(體積比)，然後進行薄層色譜紫外分析。薄層色譜展開劑為石油醚乙酸乙酯比例為25 1(體積比)，檢測儀器為YOKO-ZS紫外線分析攝影儀(購自武漢藥科新技術開發有限公司)，合併具有相同斑點的洗脫液(在365nm紫外線燈照射下處可見藍色螢光斑點)，旋轉蒸發儀減壓濃縮，得到淡黃色液體11. 3g，即本發明的川芎提取物。實施例2川芎提取物的製備I)稱取Ikg川芎，95%乙醇浸泡10小時後，用4000ml 95%乙醇加熱回流提取3次，每次2小時，合併提取液，旋轉蒸發儀減壓濃縮至相對水的密度為I. 5的濃縮液。2)將濃縮液加至500ml水中分散成混懸液，500ml石油醚萃取3次，合併萃取液，回收溶劑至幹，再按照以上步驟重複萃取一次，回收溶劑至幹，得到萃取濃縮物。3)取步驟2)獲得的萃取濃縮物，經300-400目正向矽膠柱填充的中壓製備柱進行分離(矽膠購自青島海洋化工廠分廠)，柱高50cm，柱徑7cm。以石油醚乙酸乙酯=50 I (體積比)為洗脫劑進行洗脫，棄去前2個柱體積洗脫得到的洗脫液，收集第3個柱體積洗脫得到的洗脫液，旋轉蒸發儀減壓濃縮，得到淡黃色液體3. 2g，即本發明的川芎提取物。本實施例用更細的矽膠柱，填中壓製備柱後，可獲得量少、純度高的川芎提取物。實施例3川芎提取物的分析稱取實施例I製備的川芎提取物4. 32mg，加O. 5ml乙酸乙酯溶解，取適量轉移至棕色液相進樣瓶，用於液相色譜質譜聯用分析。分析條件為進樣量5ul ;流速0. 8ml/min，柱溫30°C;質荷比100-1000m/z。液相色譜流動相組成為O. 01 % (體積比)甲酸-水溶液(A)和乙腈溶液(B)，液相色譜梯度為Omin 30%乙腈；O 45min，乙腈濃度從30%上升到95%，上升速度為1.44% /min ;45 50min,保持乙腈濃度為95%。分析譜圖如附圖I所示。液相色譜-質譜聯用分析顯示實施例I製備的川芎提取物在29min有I個明顯的分子離子峰，其對應的質譜檢測結果顯示其質荷比(m/z)為191. 23，質荷比191. 23對應的分子離子峰為[M+H]+，質荷比231. 76對應的分子離子峰為[M+H+CH3CN]+，因此推斷該峰分子量為190. 24，經與標準品比對後鑑定該峰代表的化合物為藁本內酯。分析結果顯示，川芎提取物中主要成分為藁本內酯。2.川芎提取物中藁本內酯含量測定精確稱取Z-蒿本內酯標準品2. IOmg(上海融禾醫藥科技有限公司，批號110825，純度> 98%。)，加乙酸乙酯420ul溶解得到5mg/ml的標準品溶液，用乙酸乙酯依次稀釋成lmg/ml、0. 5mg/ml、0. 25mg/ml、0. lmg/ml、0. 05mg/ml等五個濃度的標準品液。採用上述液相色譜分析方法進行對不同濃度的標準品溶液進行分析，建立標準曲線。以藁本內酯標準品對實施例I和實施例2製備的川芎提取物中藁本內酯含量進行準確定量，結果表明實施例I所得提取物中藁本內酯含量為37. 32% (質量比)，實施例2所得提取物中藁本內酯含量為85. 25% (質量比)。實施例4片劑製備取實施例I製備的川芎提取物120g、澱粉180g、糊精IOg混和均勻，用10%預膠化澱粉漿粘合，溼法制粒，烘乾，加適量硬脂酸鎂混和，壓成片劑1000片，包衣即得。實施例5膠囊的製備取實施例I製備的川芎提取物200g與羥丙基纖維素60g及微粉矽膠30g混和，用適量70%乙醇做溼潤劑，溼法制粒，揮髮油用環糊 精包合，兩者混合過篩烘乾後加入硬脂酸鎂，混勻後裝膠囊，製成1000粒。實施例6軟膠囊的製備取實施例I製備的川芎提取物300g，加入2倍量的橄欖油作為稀釋劑混合均勻後，裝入軟膠囊，製成1000粒。實施例7滴丸的製備取實施例I製備的川芎提取物200g研磨過篩(100目)，加聚乙二醇6000350g和硬脂酸25g混勻，加熱至90°C，攪拌至熔化，保持在80-85°C，控速滴入甲基矽油冷卻成丸，製得1000粒。 實施例8抗動脈粥樣硬化藥效評價採用經Apo-E基因敲除(ApoE-/-)小鼠動脈粥樣硬化模型，觀察給藥12周對ApoE-/-小鼠高血脂症的調節作用及動脈粥樣硬化斑塊形成的抑制作用。I.動脈粥樣硬化模型的建立Apo-E基因敲除(ApoE-/-)小鼠及C57BL/6J小鼠購自北京大學醫學部，飼養於中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心(室溫24±2°C，相對溼度58-65% )。ApoE-/-小鼠經正常飼料(購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司)餵養4周後，改用高脂飼料餵養12周，高脂飼料配方為基料77. 8%、蛋黃粉10%、豬油10%、膽固醇1.0%、豬膽鹽O. 2 %，造成動脈粥樣硬化模型。2.分組及給藥方法將小鼠分為模型組、高劑量組和低劑量組、陽性藥組、以及空白對照組。所有供試藥品均用O. 5%的羧甲基纖維素鈉溶液助溶後，口服灌胃給藥，每日一次。其中模型組給予O. 5%的羧甲基纖維素鈉溶液，給藥體積為lml/100g鼠重；分別取實施例I製備的川芎提取物O. 6g和O. 3g，加入IOOml O. 5%的羧甲基纖維素鈉溶液溶解，混勻後配製成6mg/ml (高劑量組)和3mg/ml (低劑量組)的溶液，口服灌胃給藥，給藥體積為lml/100g鼠重；陽性藥給予3mg/kg鼠重的辛伐他汀；空白對照組為C57BL/6J小鼠，給予O. 5 %的羧甲基纖維素鈉溶液，給藥體積為lml/100g 鼠重；連續給藥12周，給藥期間各組動物均自由飲水，期間餵飼高脂飼料，每隔10天稱體重I次。觀察給藥12周對Ap0E-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的抑制作用。3.實驗方法連續給藥12周後,處死小鼠，小鼠處死前24小時禁食禁水,稱重。剝離主動脈固定於10%甲醒中，石臘包埋切片後進行HE染色(蘇木精-伊紅染色，hematoxylin-eosinstaining，簡稱HE染色)，光學顯微鏡觀察、拍照動脈粥樣硬化斑塊病變情況。分別檢測主動脈弓部、主動脈胸段及主動脈腹段中的斑塊面積，用Image J軟體計算該三部分斑塊面積與管腔面積的比值。
摘眼球取血，滴至I. 5ml離心管中，3500轉/分離心lOmin，得血清樣本，4°C保存，用半自動生化測定儀(荷蘭威圖公司型號Vital Scientific7-0416)測定血清中各相關生化指標，其中，血清總膽固醇(TC)含量測定採用中生北控生物科技股份有限公司提供的總膽固醇(TC)測定試劑盒(批號111281);血清甘油三酯(TG)含量測定採用中生北控生物科技股份有限公司提供的甘油三酯(TG)測定試劑盒(批號115011);直接低密度脂蛋白膽固醇(LDL)含量測定採用中生北控生物科技股份有限公司提供的直接低密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒(批號110321)，直接高密度脂蛋白膽固醇(HDL)含量測定中生北控生物科技股份有限公司提供的直接高密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒(批號110321)。4.實驗結果結果表明，提取物高、低劑量組對ApoE-/-小鼠體重無明顯影響，對整個主動脈斑塊的形成有明顯的抑制作用，其中高低劑量組對主動脈胸段斑塊的形成具有顯著抑制作用(P < O. 05)，低劑量組對主動脈弓部斑塊的形成具有顯著抑制作用(P < O. 05)，高低劑量組對主動脈腹段斑塊的形成無顯著影響。具體數據見表I及附圖2。表I中藥提取物對動脈粥樣硬化斑塊形成的抑制作用
斑塊/管腔面積比主動脈弓部斑塊主動脈胸段斑塊主動脈■腹段斑塊 模型組 1.49±0.581.62±1.062.75±0.82
提取物低劑量組 0.52±.4}{*0.33+0.58*2.73±3.37
提取物高劑量組 1.19士 1.060.13±0,10** 1.27 士 1.48注與模型組相比，*P < O. 05，**p < O. Ol血脂分析結果表明，經高脂飲食(12周)後，與正常對照組(C57BL/6J小鼠)相比，模型組TC、LDL的血清含量均顯著上升(P < O. 01)。該結果表明高脂餵養的ApoE-/-小鼠血脂顯著升高。與模型組相比，陽性藥辛伐他汀等顯著降低TC和LDL的血清含量，川芎提取物高劑量組TG、TC的血清含量均顯著降低(P < O. 05);並且，川芎提取物低劑量組能顯著降低LDL的血清含量(P < O. 01)，表明川芎提取物具有降血脂效果。表2川芎提取物對大鼠血脂的影響(X 土SD )mmol/L
體重變化 TGTCLDLIIDL
組別物
(g) (nimoI/L) (nimol/L) (mniol/L) (nimoi/L)
_(η)_
空白對照61.25 土2.230.73±0.091,98^0.570.82±0.421.14±0.29
模型100.45±3.25 0.77±0.188.8±1.63##3.53±1.06##1.76+0.31##
辛伐他汀82.25±t.00 0.66±0. 35.7 ±1.06Λ*2.49± .04Α1.7±0.16
川芎提取物(高)91.6 ±1.520·62±0·12*6,4±2,4*3.0 ±1.551.82±0.66
川芎提取物(低 >90.90±l.fi10.67±0.167.52±0.872.03±0.98** 1.72±0.24注模型組與正常對照組比較#p < 0. 05，##p < 0. 01 ；與模型組相比，*P < O. 05，* * P < O. 01
綜合分析上述結果發現，實施例I製備的川彎提取物在60mg/kg鼠重和30mg/kg鼠重給藥量下能夠顯著降低Apo-E基因敲除小鼠血清中TC和TG含量，減少主動脈弓部和主動脈胸段的動脈粥樣硬化斑塊面積，表現出良好的降脂及抗動脈粥樣硬化效果。與陽性藥辛伐他汀相比，本發明提供的提取物不僅能夠降低ApoE-/-小鼠血清中TC和LDL含量，高劑量組還能顯著降低血清甘油三酯(TG)含量，這一藥效作用是他汀類降脂藥物所不具備的。此外，該提取物對於小鼠體重的影響也小於辛伐他汀，表明其對機體的
影響較小。因此該提取物在預防和治療動脈粥樣硬化方面具有一定的優勢。
權利要求
1.一種川芎提取物，其含有質量百分比為30 90%的藁本內酯， 優選地，該提取物中含有質量百分比為37 85%的藁本內酯， 更優選地，該提取物中含有質量百分比約為37%的藁本內酯， 更優選地，該提取物中含有質量百分比約為85%的藁本內酯。
2.—種權利要求I所述的川芎提取物的製備方法，包括以下步驟 1)川芎經乙醇浸泡後，用乙醇加熱回流提取，然後將提取液濃縮，得濃縮液； 2)將步驟I)獲得的濃縮液加至水中分散成混懸液，經石油醚萃取合適的次數，合併萃取液，回收溶劑至幹；可選擇地，按照以上步驟重複萃取一次，回收溶劑至幹，得到萃取濃縮物； 3)將步驟2)獲得的萃取濃縮物過矽膠柱，以石油醚和乙酸乙酯的混和液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，濃縮後得到淡黃色液體。
3.權利要求2所述的製備方法，步驟3)中所述的洗脫液進一步經過薄層色譜紫外分析，合併在365nm紫外線燈照射下具有藍色螢光斑點的洗脫液，減壓濃縮後得到淡黃色液體； 優選地，步驟3)中石油醚與乙酸乙酯的體積比為50 I ； 優選地，步驟3)中薄層色譜的展開劑為石油醚與乙酸乙酯的混合物，優選地，石油醚與乙酸乙酯的體積比為25 I。
4.權利要求I或2所述的製備方法，其中，步驟I)中所用的乙醇濃度為90%-100%，優選為95% ； 優選地，步驟I)中所述的浸泡時間為8 12小時，優選為10小時； 優選地，步驟I)中提取時間為1-3小時，提取次數為I至5次，更優選地，提取時間為2小時，提取次數為3次； 優選地，步驟I)中所述的濃縮液相對水的密度為I. I I. 5 優選地，步驟I)或步驟3)中所述的濃縮方式為減壓濃縮，更優選地濃縮方式為採用旋轉蒸發儀減壓濃縮。
5.一種藥物組合物，其含有權利要求I所述的川芎提取物，以及任選的藥學可接受的輔料。
6.權利要求5所述的藥物組合物，該中藥組合物的劑型為膠囊劑、片劑、滴丸劑。
7.權利要求I所述的川芎提取物或權利要求5至6任一項所述的藥物組合物在製備用於抗動脈粥樣硬化的藥物中的用途。
8.權利要求I所述的川芎提取物或權利要求5至6任一項所述的藥物組合物在製備用於降血脂的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種川芎提取物、其製備方法和用途。該川芎提取物中含有質量百分比約為30～90％的藁本內酯，可以用於製備抗動脈粥樣硬化的藥物或降血脂的藥物。
文檔編號C07D307/88GK102872175SQ201210306968
公開日2013年1月16日 申請日期2012年8月24日 優先權日2012年8月24日
發明者程翼宇, 王怡, 劉二偉 申請人:天津中醫藥大學